פנילטנול גליקוזידים מ-Cistanche Tubulosa מדכאים את הפעלת תאי הכבד וחוסמים את הולכת מסלולי איתות ב-TGF-01/smad כחומרים פוטנציאליים נגד פיברוזיס בכבד
Mar 05, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang וטאו ליו
תַקצִיר: Cistanche tubulosaהיא רפואת צמחים סינית מסורתית בשימוש נרחב לוויסות חסינות ופנילתנואידים גליקוזידים(CPhGs) הם בין המרכיבים העיקריים האחראים לפעילות זו. מחקרים קודמים הצביעו על ההשפעות המניעתיות והטיפוליות של CPhGs על פיברוזיס כבד המושרה בסרום בקר (BSA) בחולדות. מטרת המחקר הייתה להעריך את השפעת הפיברוזיס האנטי-כבדית של CPhGs ושל המונומריםechinacosideואקטאוזידעל ידי עיכוב הפעלת תאי כבד (HSC), חסימת הולכה של מסלולי איתות בהפיכת גורם גדילה-p1 (TGF-p1)/smad, וקביעה שהם פעילות הגנה על הכבד במבחנה. שגשוג HSC נבלם ללא ספק לאחר טיפול ב-CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), עם ערכי IC50 של 119.125,520.395 ו-/g/mL mL, בהתאמה, במבחן MTT. ריכוזים שונים של CPhGs/echinacoside/אקטאוזידלא השפיע על הרעילות התאית ב-HSC על פי מדידות לקטט דהידרוגנאז (LDH). ריכוזים שונים של CPhGs/echinacoside/אקטאוזידהעלו את רמת ה-mRNA וביטוי החלבון של smad7 והפחית את רמות ה-mRNA של smad2, smad3 ואת ביטוי החלבון של smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) ב-HSC. לסיכום, תוצאות אלו מראות כי CPhGs/echinacoside/אקטאוזידיכול לחסום את ההולכה של מסלולי האיתות ב-TGF-p1/smad, ולעכב את ההפעלה של HSC, מה שמצביע על כךC. tubulosaעשויה אם כן להיות תרופה צמחית פוטנציאלית לטיפול בפיברוזיס בכבד.
מילות מפתח: Cistanche tubulosa; פנילטנול גליקוזידים מCistanche(CPHGs);echinacoside; אקטאוזיד; תאי stellate hepatic (HSC); TGF-p1/smad
1. הקדמה
הופכים לשגשוג ופיברוגני, לאחר מכן צוברים ECM, ובסופו של דבר מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסט פיברוגניים. Transforming factor growth-.1 (TGF-p 1) נחשב למתווך הפרופיברוגני העיקרי. מסלול האיתות הקשור ל-TGF-&1 הוא מנגנון חשוב של פיברוזיס בכבד, והוא כולל בעיקר איתות תלוי ב-SMAD ו-Smad-בלתי תלוי, ומסלול המרת איתות תלוי ב-SMAD נחשב כערוץ מרכזי של איתות TGF-p1 . לכן, חסימה של מסלול האיתות TGF-p1/smad יכולה לדכא ייצור קולגן ובסופו של דבר להקל על פיברוזיס בכבד, מה שהפך את המסלול הזה למטרה חשובה במחקר תרופות נגד פיברוזיס בכבד בשנים האחרונות.
למרות השכיחות הגבוהה בעולם של פיברוזיס בכבד, אין טיפול אנטי פיברוגני מקובל [2-4]. תרופות צמחיות סיניות מסורתיות (TCHMs) מעוררות עניין רב לטיפול בהפרעות כבד מכיוון שחלקן יכולות לשמש תרופות טיפוליות בניהול ומניעה של פיברוזיס בכבד. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בתרופות אנטי-פיברוגניות פוטנציאליות ששימשו כ-TCHMs במשך אלפי שנים [5].
צמח טפילי Cistanche tubulosa W (משפחת Orobanchaceae)fa, גדל באופן נרחב באזור הדרומי של שינג'יאנג בסין [6]. אנשים משתמשים בו כדי להמריץ את הכליות, להזין את הדם, להרפות את המעיים ולדחות את ההזדקנות ללא תופעות לוואי, והוא רשום רשמית בפרמקופאה הסינית [7]. C. tubulosa מכיל מגוון של רכיבים פעילים, כולל פנילתנואידים גליקוזידים (CPhGs), אירידואידים ופוליסכרידים. בין הרכיבים הפעילים הרבים ב-C. tubulous, ה-CPhGs, המציגים מספר פעילויות ביולוגיות (נוגד חמצון, נוגד עייפות, עמידות לרדיו וכו') הם הרכיבים האופייניים העיקריים של צמח זה. בשנים האחרונות דווח כי ל-CPhGis יש עודף השפעות הגנה על הכבד של Hent, והם יכולים לנקות רדיקלי עצים, להגן על ממברנות הכבד ולהפגין השפעות אימונו-רגולטוריות, עיכוב של אפופטוזיס, עיכוב ביטוי של אנטיגן משטח הפטיטיס B (HBs Ag) והפטיטיס B פעילות שכפול ה-DNA של אנטיגן (HBeAg) ושל הפטיטיס B (HBV), וכו'. רמת ה-DNA של HBV היא האינדקס המהימן ביותר המשקף ישירות את פעילות השכפול הנגיפי, שהיא גורם המפתח בקביעת ההיסטוריה הטבעית של זיהומי HBV כרוניים, ניטור ההשפעה של טיפול אנטי-ויראלי oP, והערכת הפרוגנוזה של זיהומי HBV חריפים וכרוניים. מדדי הגילוי הסרולוגי של HBV כוללים בעיקר HBsAg, HBeAg וכו' [8-11]. עם זאת, ישנם מעט דיווחים בספרות על השפעות פיברוזיס אנטי-כבדיות של CPhGs. מחקרים קודמים הצביעו על ההשפעות המניעתיות והטיפוליות של CPhGs על פיברוזיס כבד המושרה בסרום אלבומין (BSA) בחולדות, אך הפעילות האנטי-פיברוגנית של CPhGs ושל המונומרים העיקריים שלו (echinacoside ו-acteoside, איור 1) מעולם לא הוערכה במבחנה.
Cistanche tubulosa אורגנית
2. תוצאות
2.1. קביעה כמותית של CPhGs
CPhGs בC. tubulosaמכילים ITשני גליקוזידים של פנילאתיל אלכוהול: צד אכינאקוסיד ואקטאו, ותכולתם ב-CPhGs זוהה על ידי ניתוח HPLC (איור 1) כ-42.71 אחוז 土 0.42 אחוז ו-14.27 אחוז 土 0.18 אחוזים, בהתאמה.
2.2. פעילויות מעכבות של CPhGs, Echinacoside ו-Acteoside על HSC-T6
CPhGs, echinacoside ו-acteoside (62.5-500 卩g/mL) עיכבו את כדאיות התא של HSC באופן תלוי ריכוז. CPhGs ו-acteoside הראו פעילות מעכבת יוצאת דופן על תאי HSC, עם עיכוב של 50 אחוז של פעילות צמיחת תאים (IC50) ערכי 119.125 昭/mL ו-6.999 昭/mL בהתאמה. Echinacoside הציג פעילות מעכבת מתונה (IC50,520.345 昭/mL; טבלה 1 ואיור 2).
2.3. רעילות תאים של CPhGs, Echin acoside ו-Acteorida על HSC
לקטט דהידרוגנאז (LDH), אנזים ציטופלזמי יציב הקיים בכל התאים, מוחזר במהירות לסופרנטנט של תרבית התאים לאחר נזק לממברנת הפלזמה. פעילות האנזים ב- supernatant התרבית מתאמת עם השיעור של celfs עם lysed [12]. כפי שמוצג בטבלה 2, כאשר טופלו עם שונים: ריכוזים של C PhGs, echinacoside ו-acteoside, למרות שפעילות LDH הראתה עלייה קלה בהשוואה לקבוצת coirtrol התא, ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית (p > 0.05 ), המצביע על כך שרוב קרומי התא שומרים על שלמותם, והעיכוב של CPhGs, echinacoside ו-acteoside ב-HSC אינו נובע מרעלות תאית לא ספציפית.
2.4. השפעת CPhGs, Echinacoside ו-Acteosde על התפשטות HSC המושרה על ידי TGF-^i
ההתפשטות, ההפעלה והבידול של HSC מוסדרים על ידי מגוון גורמים. בין הגורמים השונים המעורבים בפיברוזיס בכבד, TGF{{0}} נחשב לחשוב ביותר, מכיוון שהוא יכול להפעיל HSC, לקדם התמיינות מיופיברובלסט, להגביר את סינתזת ECM ולעכב פירוק ECM ולשחרר כימוקינים ו ציטוקינים המעורבים בפיברוזיס בכבד [13]. במחקר זה, מלבד קבוצת הביקורת, HSCs נייחים עוררו עם TGF-P1 במבחנה כדי לדמות היווצרות של פיברוזיס כבד מוקדם, וכדי לחקור את ההשפעה של CPhGs, echinacoside ו-acteoside על TGF-p1- גרם להתרבות HSC. כפי שמוצג בטבלה 3, בהשוואה לקבוצת ביקורת, קבוצת TGF-61 קידמה באופן משמעותי את התפשטות HSC (p < 0.01).="" בהשוואה="" לקבוצת="" tgf-p1,="" tgf-p1="" בתוספת="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p=""><0.05), tgf{{18}="" }="" בתוספת="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" plus="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" כולם="" עיכבו="" להפליא="" את="" התפשטות="" של="" hscs="" המושרה="" על="" ידי="" tgf-|3="" 1="" בדרגות="">
2.5. ביטויים של smad2)smad3 ו-smad7 mRNA לאחר התערבות CPhGs, ochmacoside ו-acteaside על HSCs
Smad3 ו-smad2 הם גורמים מרכזיים במורד הזרם של מסלול האיתות TTGF-p [14,15], ו-smad7 הוא מעכב של איתות Smad. תיאורטית, הביטוי המוגבר של smad7 או הביטוי המופחת של smad2/smad3 יכול לחסום את ההולכה של מסלולי איתות ב-TGF-p 1/smad. כפי שמוצג באיור 3, ניתוח PCR כמותי בזמן אמת הראה שביטוי ה-mRNA של smad2 ו-smad3 הצביע על רמה נמוכה יותר, בעוד smad7 הצביע על רמות גבוהות יותר בקבוצת הביקורת, בהשוואה לקבוצת TGF-|31. בקבוצת TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), רמת ה-mRNA של smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" ו-smad3="" (p="">< 0.01)="" ירדו="" באופן="" משמעותי="" בהשוואה="" לקבוצת="" tgf-pf,="" ואף="" היו="" דומים="" לקבוצת="" הביקורת;="" בינתיים,="" רמת="" ה-mrna="" של="" smad7="" עלתה="" באופן="" משמעותי="" בקבוצת="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p=""><0.05, p=""><0.05, p=""><0.01, בהתאמה).="" למרות="" זאת;="" הביטוי="" smad7="" הצביע="" על="" מגמה="" עולה="" בקבוצת="" tc="" 25="" 卩g/ml="" בהשוואה="" לקבוצת="" tgf-p1="" (איור="">
בינתיים, בהשוואה לקבוצת TGF-p1, הביטוי של smad2 ו-smad3 mRNA ירד משמעותית ב-TE (62.5, 125, 250, 500 卩g קבוצת /mL) (p < 0.01),="" והביטויים="" של="" smad7="" mrna="" עלו="" באופן="" משמעותי="" בקבוצת="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (איור="" 4)="" .="" באופן="" דומה,="" קבוצת="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" גם="" הראתה="" את="" אותה="" מגמה="" (איור="">
2.6. השפעת CPhGs, Echinacoside ו-Ac)eosids על מסלול איתות T GF-^i/smad ב-HSC
מסלול האיתות TGF-p 1/smad תלוי ב-smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) ו-smad7, כאשר p-smad2, p-smad3 הן הצורות המופעלות של smad2 ו smad3. במחקר זה נותחו רמות החלבון של omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 ו-smad7. אנליזה של Western blot זיהתה עליות ברמות smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 על ידי TGF-p1, ועיכוב העליות הללו על ידי CPhGs, ec hinacoside ו-acteoside; בינתיים, ניתוח ה-Wesiern Blot חשף רמות smad7 שהווסרו על ידי CPhGs, echinacoside ו-acteoside. (איור 6-8).
כפי שמוצג באיור 6, בהשוואה לקבוצת c on2rol( ביטויי החלבון של smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 עלו באופן משמעותי, וביטוי חלבון smad7 ירד בקבוצת TGF-p1. ב-TC (25 , 50, 75, 100 昭/mL) קבוצות תרופות, ה-smad/ (איור 6A), p-smad2 (איור 6B), smad 3 (איור 6C), p -smad3 (איור 6D) הביטויים היו נמוכים משמעותית מזה של קבוצת TGF-p1 (卩 < 0.01), וביטוי חלבון smad7 (איור 6E) היה גבוה יותר מזה של קבוצת TGF-S1 (p < 0.01) (איור 6).
במקביל, הביטויים ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 ו-smad7 חלבון נמדדו לאחר התערבות echinacoside ו-acteoside ב-HSC. כפי שמוצג באיורים 7 ו-8, רמות ביטוי החלבון smad2, smad3, p-smad2 ו-p-smad3 עוכבו באופן משמעותי (p < 0.05="" או="" p="">< 0.01="" ),="" רמת="" ביטוי="" החלבון="" smad7="" הייתה="" מוגברת="" (p=""><0.01), בהשוואה="" לקבוצת="" tgf-p="" 1="" (איורים="" 7="">
3. דיון
פיברוזיס בכבד הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם, אך אפשרויות טיפוליות מוגבלות מאוד זמינות כיום למצב זה, לכן, חשוב לנו מאוד לחפש יעדים פוטנציאליים להתערבות טיפולית כדי למנוע התפתחות של פיברוזיס בכבד [ 16]. לאחרונה, חוקרים מצאו כי לתרופות צמחיות שונות יש השפעות אנטי-פיברוטיות מגינות על הכבד. TCHMs רבים כגון כדורי Fufang Biejia Ruangan [17] ומרתח שיאו-צ'אי-הו (שוסאיקו ביפן) [18,19] היו בשימוש נרחב לטיפול בפיברוזיס בכבד בסין, קוריאה ויפן במשך אלפי שנים. C. tubulosa מכיל מגוון רכיבים פעילים כולל CPhGs, אירידואידים ופוליסכרידים. כאחד מבסיסי החומר היעילים של C. tubulosa, ל-CPhGs יש פעילות מגוננת על הכבד מעולה, אך יש מידע מוגבל על ההשפעות האנטי-פיברוטיות של GPhCs והתרכובות הקשורות לה. במחקר זה, חקרנו כיצד CPhGs, echinacoside ו-acteoside מדכאים את הפעלת HSC וחוסמים את התנהלות האיתות ב-TGF-p1/snaad כחומרים פוטנציאליים נגד טיק פיברוזיס במבחנה.
פגיעה בכבד מכל אטיולוגיה תוביל בסופו של דבר להפעלה של HSCs, אשר עוברים טרנסדיפרנציאציה לתאים דמויי מיופיברובלסט פיברוגניים [20]. כלומר מיופיברובלסטים
נגזרים מההפעלה והשגשוג של HSCss [21], והוא נחשב כמתווך של היווצרות פיברוזיס בכבד. מסיבה זו, ביצענו מחקרים במבחנה כדי להשוות את שיעורי כדאיות התא של HSCs שנחשפו ל-CPhGs, echinacoside ו-acteoside. התוצאות הראו כי ההשפעה המעכבת של אקטאוזיד על HSC הייתה החזקה ביותר, וההשפעה של CPhGs הייתה טובה יותר מזו של אכינאקוסיד. CPhGs, echinacoside ו-acteoside סרה תרופתית כולם עיכבו את התפשטות HSC באופן תלוי מינון.
LDH הוא אנזים ציטופלזמי בתאים חיים, והוא אינו יכול לחדור לממברנת התא בנסיבות רגילות. כאשר תאים נפגעים, חדירות הממברנה גדלה ו-LDH משתחרר לחלק החיצוני של התא. בדרך כלל, LDH יכול לזהות את מידת הנזק לתא [{{0}}]. החקירה הראתה שפעילות ה-LDH של CPhGs, echinacoside ו-acteoside סרום תרופתי הראתה רק עלייה קלה בהשוואה לקבוצת הביקורת של התא, וההבדל לא היה מובהק סטטיסטית (p>0.05), מה שמעיד על כך שרוב קרום התא שמר על שלמותם , ועיכוב HSCs על ידי CPhGs, echinacoside ו-acteoside אינם נובעים מרעלות תאית לא ספציפית.
כאשר מתרחשת פגיעה בכבד, הפטוציטים מופעלים יכולים לשחרר TGF-pi שבתורו מפעיל את HSC-T6, לכן, ל-TGF-pi יש קשר הדוק עם פיברוזיס [25-27]. במחקר זה, CPhGs, echinacoside ו-acteoside יכולים להיחשב כאסטרטגיה טיפולית אטרקטיבית לעיכוב התפשטות HSC לאחר גירוי של HSCs עם wTGF-pi במבחנה. אנו משערים ש-CPhGs, echinacoside ו-acteoside עשויים לשמש סוג של טיפול ו/או מניעה של פיברוזיס בכבד, ולעכב היווצרות של פיברוזיס כבד מוקדם. היווצרות פיברוזיס בכבד היא תהליך מורכב של מעורבות רב-גורמית ורב-תאית. בתהליך פתולוגי זה, האינטראקציות התא-תא, תא-ציטוקינים ותא-מטריקס מהווים רשת מסורבלת. ברשת זו ניתן לווסת התפתחות של פיברוזיס בכבד על ידי מסלולי איתות ואמצעים שונים. TGF-pi הוא מפעיל קלאסי של HSC ומתווך מפתח בפתוגנזה של פיברוזיס בכבד [28]. CPhGs, echinacoside ו-acteoside יכולים לעכב את הביטויים של mRNA וחלבונים הקשורים למסלול TGF-pi/smad ב-HSCs.
TGF-pi מפעיל את ההשפעות הסלולריות שלו דרך מסלול האותות הסמדי, והוא נחשב למתווך מרכזי בהתפתחות פיברוזיס ודלקת בכבד. עם קישור של TGF-pi לקולטן TGF-p-type II, הקולטן מסוג II מסוג קינאז מזרחן את תחום ה-GS של הקולטן מסוג TGF-p, מה שמוביל להפעלה של הקולטן מסוג I [29]. באמצעות הפעולה של p-smad2 ו-p-smad3 בשני שיירי סרין במוטיב SSXS של טרמינל ה-C שלהם, תגובות במורד הזרם של מסלול האיתות של smad מופעלות על ידי הפעלה של קולטן מסוג I [30]. P-smad2 ו-p-smad3 יוצרים קומפלקסים אוליגומריים עם smad4, ואז נכנסים לגרעין ומפעילים את פעילות השעתוק הביולוגית שלהם. לפיכך, חלבוני Smad מעבירים אותות ישירות מהקולטן קינאז לגרעין [3i]. מצד שני, smad7 משולב בחוזקה עם קולטן TGF-pi, מה שמוביל לחוסר היכולת של smad 2/3 להיות מופעל וכן לעיכוב של מסלולי העברת האותות [32]. Smad7 יכול לפעול לעיכוב ה-p-smad2 ו-p-smad3, טרנסלוקציה גרעינית של קומפלקסים SMAD פעילים והפעלה של (CAGA) (9)-MLP-Luc, וכתוצאה מכך ירידה בביטוי קולגן I ועיכוב מוחלט של העברת אותות TGF-p [33,34]. התוצאות שלנו הראו ש-CPhGs, echinacoside ו-acteoside יכולים להפחית את ביטויי mRNA smad2 ו-smad3, ולהגביר את ביטוי mRNA של smad7; מעכבים את ביטויי החלבון smad2, p-smad2, smad3 ו-p-smad3, ומסדירים את ביטוי החלבון של smad7, מה שמצביע על כך ש-CPhGs, echinacoside ו-acteoside ממלאים תפקיד גם בעיכוב הפעלת HSC ובכך מעכבים פיברוזיס בכבד, מה שמדגיש פוטנציאל אנטי-פיברוטי. מַנגָנוֹן.
רצף ההשפעות המגנות על הכבד של שלושת חומרי הבדיקה הוכח כאקטאוזיד > CPhGs > echinacoside. על מנת להבהיר יותר את הסיבות להבדלים במנגנון שבו CPhGs, echinacoside ו-acteoside מגנים מפני פיברוזיס בכבד, נותחו המבנים הכימיים שלהם. נראה שחלקת הגליקוזיד של אלכוהול פנאתיל היא מבנה חיוני להשפעה מגוננת על הכבד [35]. אקטאוזיד (C29H36Oi5) הוא גליקוזיד כפול, ואכינאקוסיד (C35H46O20) הוא טריגליקוזיד, כלומר לאכינאקוסיד יש גליקוזיד נוסף במבנה שלו בהשוואה לאקטאוזיד, מה שמוביל לגידול בגודלו המרחבי. ההגנה על הכבד או עיכוב פעילות HSC של אקטאוזיד טובים יותר מזה של אכינאקוסיד, מה שעשוי להיות בגלל קיומו של הפרעה סטרית.
להגן על הכבד: תמצית cistanche
4. מדור ניסוי
4.1. כימיקלים וריאגנטים
TGF-pi נרכש מחברת Peprotech (Rocky Hill, NJ, ארה"ב). קו התאים HSC-T6 נרכש מ- Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd (Wuhan, סין). Dimethyl sulfoxide (DMSO) נרכש מ-Sigma Inc. (St. Louis, MO, ארה"ב). פריימרים Smad2, smad3 ו-smad7 יוצרו על ידי החברה הביולוגית והטכנולוגית של Shanghai Sangon (שנחאי, סין). ערכת סינתזת cDNA של גדיל ראשון של Revert Aid נרכשה מ-Thermo Scientific (שנחאי, סין). ערכת ה-PCR ירוקה Quantifast SYBR נרכשה מ-QIAGEN GmbH (Hilden, גרמניה). נוגדן p-smad2 (ser465/467), Smad3 (C67H9) ארנב mAb ו-p-smad3 (ser423/425) ארנב mAb נרכשו מ- Cell Signaling Technology (בוסטון, MA, ארה"ב). נוגדן Smad7 נרכש מ-Boster (Wuhan, סין). נוגדן רב שבטי Smad2 ונוגדן חד שבטי p-actin נרכשו מחברת Proteintech (Wuhan, סין). זיהוי נוגדן ראשוני נעשה באמצעות תמיסת נוגדנים של 2 מעלות (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) ותמיסת נוגדנים של 2 מעלות (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) שנרכשה מ-Invitrogen™ (Carlsbad, CA, ארה"ב). ערכת בדיקת לקטט דהידרוגנאז הייתה ממכון הביו-הנדסה נאנג'ינג Jiancheng (נאנג'ינג, סין).
4.2. חומר צמחי
C. tubulosa נאסף מ- Tulufan, באזור Xinjiang Uirghur האוטונומי של סין, במאי 2006. החומרים הצמחיים זוהו כ-C. tubulosa על ידי Jiang He, Institute of Materia Medica של Xinjiang. דגימת שובר הופקדה במכון Materia Medica של שינג'יאנג בסין.
4.3. בידוד וטיהור של CPhGs ותרכובותיו
קני שורש מיובשים ופרוסים של C. tubulosa (6.0 ק"ג) חולצו ברציפות שלוש פעמים תחת ריפלוקס עם 70 אחוז אתנול (4.8 ליטר), ולאחר מכן הוסר הממס מהתמציות המשולבות כדי כדי להניב את תמצית האתנול (1.146 ק"ג). תמציות האתנול טוהר על ידי שרף AB-8 כדי להשיג את תמצית הפניל אתנול glycos ides (CPhG s) הגולמי. לאחר המסת ד במים, האקט החיצוני טוהר על ידי כרומטוגרפיה מאקרופורוסית שרף AB-8 וספיחה כדי להשיג את סך כל הצדדים של פניל אתנול גליקו מ-C. tubulosa (CPhGs, 210 גרם). CPhGs יושמו על עמודה ODS OP{{10}} ונשלפו ברציפות עם תערובות של MeOH—H?.(0:1 -^1:0). בדיקות Elua tes שולבו לחמישה חלקי משנה לפי התנהגות TLC באמצעות מערכת הממס CHCh-MeOH-H?.(6:4:0.5). כתמים הוצגו לאחר ריסוס עם 1 אחוז FeCih. חלקים שונים טוהרו שוב ושוב על ידי כרומטוגרפיה של Sephadex LH-20 עמודה עם מתנול כמפלט, ושני גליקוזידים של פניל אתנול בודדו מה-CPhGs. המבנים שלהם אושרו כאכינאקוסיד (C35H46O20) ואקטאוזיד (C29H36O15) באמצעות MS, 1H- ו-MC-NMR [35], שהטהרה נקבעו כ-99.17 אחוז ו-98.92 אחוזים, בהתאמה, על ידי UV-HPLC. המבנים של אכינאקוסיד ואקטאוזיד מוצגים באיור 9.
4.5. קביעה כמותית של CPhGs
כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) (LC{{0}}מכשיר HPLC, Shimadzu Co., קיוטו, יפן) הופעל כדי לנתח את התוכן של echina coside ו-cteoside ב-CPhGs. נעשה שימוש בעמודת Phenomenex Gemini ODS (250 x 4.6 מ"מ, 5 |^m) ב-30 מעלות. פאזה ניידת איזוקרטית המורכבת ממתנול-אצטוניטריל-1 אחוז חומצה אצטית (15:10:75, v/v/v) שימשה לריצה של 40 דקות, בקצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה, עם UV זיהוי ב-334 ננומטר.
4.6. תרבית תאים
תאי HSC תורבו במדיום Eagle's שונה של Dulbecco (High Glucose) (DMEM, בייג'ינג, סין) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, ארה"ב), 10 0 IU/mL פניצילין ו-100 ^g/mL סטרפטומיצין (HyClone, Logan, UT, ארה"ב) באינקובטור לח ב-37 מעלות עם 5 אחוז CO2. תאים אלה טופחו באופן קבוע על ידי תמיסת טריפסין 0.25 אחוז (1x) (HyClone, Logan, UT, ארה"ב) והמדיום הוחלף כל יומיים. בתחילה, תאים תורבו עם DMEM המכיל 10 אחוז FBS למשך 48 שעות. לאחר מכן המדיום הוחלף ב-DMEM ללא FBS כדי להרעיב את התאים למשך 12 שעות. תאים אלה התפשטו במשך 48 שעות ולאחר 48 שעות, הסרום הורעב עם 0.5 אחוז FBS למשך 12 שעות לפני הוספת 5 ננוגרם/מ"ל TGF-&1,
4.7. קביעת ערכי IC50
לאחר דגירה של לילה במדיום רעב המכיל {{0}}.5 אחוז FBS, תאי HSC נזרעו בצלחת 96-באר בצפיפות של 5 x 104 תאים/מ"ל למשך 24 שעות. תאי HSC טופלו ב-CPhGs, echinacoside ו-acteoside בריכוזים שונים (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250 ו-500 ^g/mL) למשך 48 שעות. לכל ריכוז היו ארבע בארות. בסיום הטיפול, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma; נוספו 5 מ"ג/מ"ל והתאים הודגרו למשך 4 שעות נוספות. DMSO (200 rL) נוספה לכל באר לאחר הסרת הסופרנטנט. לאחר ניעור הצלחת במשך 10 דקות על שייקר, ערכי IC50 התקבלו על ידי מדידת הספיגה באורך גל של 490 ננומטר באמצעות מכשיר לתיוג אנזים (Benchmark PLUS, Hercules, CA, ארה"ב), בדיקה זו בוצעה בשלושה עותקים. ערכי IC50 של CPhGs, echinacoside ו-acteoside היו 119.125, 520.345 ו-6.999 Rg/mL, בהתאמה.
4.8. השפעות עיכוב שגשוג התא וחיות התא
תאי HSC נחשפו לריכוזים שונים של CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) ואקטאוזיד (1.5,3, 6 Rg/mL). ריכוזים שונים של CPhGs, echinacoside ו-acteoside יושמו על הצלחת בארבע בארות רצופות והודגרו במשך 48 שעות. השפעות עיכוב התפשטות התאים ורמת הכדאיות של התא (בהתבסס על מדידת פעילות LDH המשתחררת מתאי פגוע לתוך הסופרנטנט [36]) נקבעו על ידי בדיקת MTT. שיעור העיכוב חושב באמצעות הנוסחה הבאה [37]:
שיעור עיכוב ( אחוז ) " [1 - (ספיגה ממוצעת של קבוצת ניסוי/ספיגה ממוצעת של קבוצת ביקורת ריקה)] x 100 אחוז
על פי הוראות הערכה,
LDH (U/L) {{0}} (OD נמדד - OD בקרה)/(OD סטנדרטי - blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
המחקר המקדים שלנו הראה ש-CPhGs, echinacoside ו-acteoside לא השפיעו על כדאיות התא.
4.9. פעילויות אנטי-התרבותיות על ידי TGF-^1
HSC המופעל על ידי TGF-p1 נחשב זמן רב כקשור לפיברוזיס בכבד, ועיכוב צמיחת HSC הוצע כשיטה לטיפול בפיברוזיס בכבד [36,38]. ההשפעות האנטי-פרוליפרטיביות של CPhGs, echinacoside ו-acteoside על HSCs שהופעלו על ידי TGF-p1 נקבעו על ידי בדיקת MTT [39]. באמצעות ההליכים וריכוזי התרופות כמתואר, ה
קבוצות הניסוי כללו את קבוצת הביקורת, קבוצת TGF-pi, TGF-pi ועוד קבוצות תרופות שונות בריכוז. כל קבוצות התאים מלבד קבוצת הביקורת תורבו עם DMEM המכיל 5.0 ng/mL TGF-p1 (ללא FBS) למשך 24 שעות. פעילות מעכבת על התפשטות תאים חושבה כ-100 x (ספיגה של תרכובת מטופלת - ספיגת אור רקע) / (ספיגה של מודל - ספיגת אור רקע).
4.10. תגובת שרשרת של פולימראז הפוך (RT-PCR)
רמת ביטוי ה-mRNA של smad2, smad3 ו-smad7 נקבעה על ידי PCR בזמן אמת. כדי לקבוע ביטוי mRNA בתאי HSC, התאים (5 x 104 תאים) נזרעו בצלחות שש בארות עם 3.0 מ"ל DMEM עם 10 אחוז FBS והודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות 5 אחוז CO2. לאחר שאמצעי התרבית הוחלפו ל-DMEM ללא סרום, נוספו CPhGs (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) ו-acteoside (6, 3,1.5 ^g/mL) לבארות. לאחר דגירה של 48 שעות עם CPhGs והרכבים מונומרים, RNA כולל הוצא באמצעות ריאגנט TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב) ועורבב במרץ עם כלורופורם במשך 15 שניות. לאחר שנתן לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות, הליסט עבר צנטריפוגה ב-12,000 xg למשך 15 דקות ב-4 מעלות. RNA בשלב המימי הוזרע עם איזופרופנול, והפאזה המימית העליונה הועברה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה. RNA הוזרם על ידי הוספת 0.75 אחוז אתנול, ולאחר מכן צינור המיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה ב-12, 000 xg ב-4 מעלות למשך לא יותר מ-5 דקות. הסופרנטנט הוסר וה-RNA יובש בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. הפריימרים (Sangon) תוכננו באמצעות Batch Primer 3, והם מפורטים בטבלה 4. התוצאות נורמלו ל-mRNA של גן הבית p-actin כבקרה פנימית ומוצגות כרמות mRNA יחסיות. התגובות בוצעו עם 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 זוג פריימר pM, 8.5 מים מזוקקים ו-2.5 rL cDNA.
כל תגובת שרשרת פולימראז בוצעה בתנאים הבאים: 95 מעלות למשך 3 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של 10 שניות ב-95 מעלות, 30 שניות ב-55 מעלות ו-10 שניות ב-55 מעלות -95 מעלות להארכה, ולאחר מכן מדידת פלואורסצנטי בודדת. התוצאות הסופיות תוארו עם הערכים היחסיים (2_AACt). החישוב והניתוח בוצעו על ידי iQ5 Real Time Detection PCR System.
4.11. Western Blot Analysis
תמציות תאים שלמים הוכנו באמצעות חיץ של Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) עם 1 אחוז מעכבי Halt פרוטאז ו-1 אחוז קוקטיילים מעכבי Halt פוספטאז (Thermo Fisher Scientific, Inc.). החלבון הכולל שימש לזיהוי של smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 ו-smad7. ריכוז החלבון נמדד וכומת בשיטת ברדפורד. חלבון (10-30 Rg) הופרד על ג'ל SDS-PAGE של 10 אחוז והועבר לממברנות פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (Millipore, Boston, MA, ארה"ב). הממברנות נחסמו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם 5 אחוז אלבומין בסרום בקר, והנוגדנים העיקריים (נוגדנים פוליקלוניים smad2, נוגדן p-smad2, smad3 ארנב mAb ו-p-smad3 ארנב mAb, דילול 1:1000; ארנב mAb 1 smad7, :200 דילול, נוגדן חד שבטי p-actin, 1:5000 דילול) הודגרו ב-4 מעלות למשך הלילה. ה-Alk-Phos המקביל. נוגדנים משניים מצומדים הודגרו בטמפרטורת החדר. לבסוף, הממברנות נשטפו שלוש פעמים עם 1 x מלח Tris-HCl עם 0.1 אחוז Tween 20, והאותות נסרקו והוצגו על ידי מערכת הדמיה GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב). ניתוח דנסימטרי בוצע על החלבונים המעניינים ומנורמל ל-p-actin על ידי תוכנת GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actin שימש כבקרה פנימית.
4.12. ניתוח סטטיסטי
הנתונים הובאו כאמצעים 土 סטיית תקן (SD). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). ניתוח פרוביט שימש לניתוח ערכי IC50. מובהקות ההבדל חושבה על ידי מבחן ANOVA חד כיווני, וערכים עם p < 0.05="" נחשבו="" למובהקים="">
5. מסקנות
לסיכום, CPhGs מ-C. tubulosa ומרכיביו echinacoside ו-acteoside מראים השפעות אנטי-פיברוטיות משמעותיות. ביניהם, פעילות האקטאוזיד היא החזקה ביותר, בעוד שפעילות ה-CPhGs היא בין שתי התרכובות. עיכוב הפעלה של איתות TGF-p1/Smad עשוי להיות המנגנון הבסיסי שבאמצעותו CPhGs מגנים מפני מחלת כבד כרונית הקשורה לפיברוזיס, ואכינאקוסיד ואקטאוזיד הם הבסיס האנטי-פיברוטי היעיל של C. tubulosa.
תודות:מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81260624). המחברים רוצים להביע את תודתם הכנה לפרופסור טאו ליו על שיפור הכתיבה במאמר זה.
תרומות מחבר:TL, JZ, S.-PY, LM ו-S.-LZ הגו ועיצבו את הניסויים. S.-PY, TL ו-JZ ניתחו את הנתונים. S.-PY ו-JZ כתבו את כתב היד. TL, LM ו-JZ סקרו את כתב היד. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.
ניגוד עניינים:המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.
הפניות
1. סוברמוניאם, א.; Pushpangadan, P. פיתוח של phytomedicine למחלות כבד. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. פרידמן, SL מנגנוני מחלה: מנגנונים של פיברוזיס בכבד והשלכות טיפוליות. נאט. קלינ. תרגול. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. פרידמן, SL; רול, FJ; בוילס, ג'יי; Bissell, DM ליפוציטים כבדים: התאים העיקריים לייצור קולגן של כבד חולדה רגיל. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. פרידמן, SL; Bansal, MB היפוך של פיברוזיס בכבד一עובדה או פנטזיה? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. אחמד, א.; Ahmad, R. הבנת המנגנון של פיברוזיס בכבד וגישות טיפוליות פוטנציאליות. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. פיטר, ה.; עוֹרֵב; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. בפלורה של סין, מהדורה 23; ועדת העריכה של פלורה של סין: האקדמיה הסינית למדעים, בייג'ינג, סין, 2013; עמ' 1-16.
7. ועדת הפרמקופיה הסינית של המשרד הסניטרי של הרפובליקה העממית של סין. פרמקופיה סינית; חלק 1; בית ההוצאה לאור של התעשייה הכימית: בייג'ינג, סין, 2010; ע. 126.
8. לי, ג'; הואנג, ד.; He, L. השפעת roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) על רעילות רבייה בעכברים המושרה על ידי גליקוזיד של Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). ג'יי טראדיט. סַנְטֵר. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; ליאו, ג'; טאנג, י.; ג'אנג, פ.; טאן, ג; ני, ח.; וו, X.; לי, נ.; Jia, X. ACE ומעכבי צבירה של טסיות מבית Tamarix hohenackeri Bunge (צמח מארח של Herba Cistanches) הגדל ב-Xinjiang. Pharmacogn. מג. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. ג'יה, י; גואן, ש; ג'יאנג, י.; סאלח, ב.; גואו, י.; טו, פ.; Du, C. שיפור של קוליטיס הנגרמת על ידי דקסטרן סולפט בעכברים על ידי תמצית מועשרת באכינאקוסיד של Cistanche tubulosa. פיטוטר. מילון 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. וונג, HS; Ko, KM Herba Cistanches מגרה מחזור חיזור גלוטתיון תאי על ידי מיני חמצן תגובתיים הנוצרים מנשימה מיטוכונדריה בקרדיומיוציטים H9c2. פארם. ביול. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. מרטין, א.; Clynes, M. Acid phosphatase: נקודת קצה לבדיקות רעילות חוץ גופיות. תא ויטרו. Dev. ביול. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. לצ'וגה, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; מוריס, ארה"ב; רינקון, AR; Rivas-Estilla, AM; אסטבן-גמבואה, א. Rojkind, M. TGF-01 מווסת את ביטוי המטריצה metalloproteinase-13 בתאי סטלט כבד על ידי מנגנונים מורכבים הכוללים p38MAPK, PI3-kinase, AKT ו-p70S6k. אמ. J. Physiol. גסטרואינטסט כבד פיזיול. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; טאנג, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load מסדיר את יצירת העצם ואת ביטוי הסקלרוסטין באמצעות מנגנון תלוי TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. פסח, מ.; מארה, י. Prunier, C.; Ferrand, N.; לאלמנד, פ.; מאוויאל, א.; Atfi, A. C-Jun מתחבר לאונקופרוטאין Ski ומדכא פעילות שעתוק Smad2. ג'יי ביול. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. דינג, נ.; יו, RT; סוברמאניאם, נ.; שרמן, MH; וילסון, סי; ראו, ר.; לבלאן, מ.; קולטר, ש.; הוא, מ.; סקוט, סי; et al. קולטן ויטמין D/מעגל גנומי SMAD משער תגובה פיברוטית בכבד. תא 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. יאנג, צרפת; פאנג, BW; Lou, JS השפעות של Fufang Biejia Ruangan Pills על פיברוזיס בכבד in vivo ו-in vitro. World J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. סקאידה, א.; Hironaka, K.; קימורה, ט.; תראי, ש; יאמאסקי, ט.; Okita, K. צמחי מרפא Sho-saiko-to (TJ-9) מגבירה ביטוי מטריצת מטלופרוטאינים (MMPs) עם ביטוי מופחת של מעכב רקמות של metalloproteinases (TIMPs) בתאי סטלט של חולדה. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. חן, מ.; חן, ג'; צאי, סי; וואנג, ו.; צ'אנג, ד.; טו, ד"ג; Hsieh, HY התפקיד של TGF-01 וציטוקינים באפנון של פיברוזיס בכבד על ידי Sho-saiko-to במודל קשירת צינור המרה של חולדה/ים. J. Etnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. בולארין, DM; Azinge, EC סמנים ביוכימיים, רכיבים תאיים בפיברוזיס בכבד ושחמת הכבד. ניג. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. קונג, ד.; ג'נג, ש.; Lu, Y. מקור ותפקידם של מיופיברובלסטים בפיברוזיס בכבד. סַנְטֵר. פרמקול. שׁוֹר. 2011, 27, 297-300.
22. דה לאבור, MSL; Binda, NS; פוקושימה, FB; קלדיירה, FMC; דה סילבה, JF; סילבה, CMO; דה אוליביירה, ק"מ; Martins Bde, C.; טורס, BB; Rosado, IR; et al. מודל איסכמיה-פרפוזיה חוזרת בחוט השדרה של חולדה: מחקר של כדאיות תאים ומחקר איתות אפופטוזיס. Int. ג'יי קלין. Exp. פאתול. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. בהדר, ח.; מקבול, פ.; ניאז, ק.; Abdollahi, M. רעילות של ננו-חלקיקים וסקירה של מודלים ניסויים נוכחיים. איראן ביומד. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
