תרכובות פנוליות מעלים ופרחים של היביסקוס רוזוס: יישומים פוטנציאליים לעור קוסמטי של מין שלא נחקר

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:השימוש בתמציות צמחים בקוסמטיקה לטיפוח העור הוא טרנד מודרני בשל עושרם בפוליפנולים הפועלים כמולקולות אנטי אייג'ינג. ורד היביסקוס הוא זן רב שנתי שהתאזרח באיטליה, עם פרחים ורודים רכים ויפים; ההרכב הפנולי והפעילות הביולוגית שלו לא נחקרו עדיין. מטרת מחקר זה הייתה לאפיין ולכמת את הפנולים ולהעריך את נוגדי החמצון, גורם ההגנה מפני השמש (SIPF) ואנטי-קולגנאז של התמציות האתנוליות של עלי H. roseus (HL) ופרחים (HE).p- נגזרות חומצות קומאריות, כלורוגניות וטרנס-פרוליות, כמו גם פלבנואידים של קוורצטין וקאמפרול, היו התרכובות הפנוליות העיקריות שזוהו. זוהו קטצ'ין, אפיקטכין, קאמפרול-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-glucoside, kaempferol-7-O-glucoside, salidroside, oenin ו-peonidin-3-O-glucoside רק ב-HF, בעוד ש-phloridzin היה בלעדי מ-HL, שגם הראה כמויות גדולות יותר של נגזרות של חומצה הידרוקסינמית. HF היה עשיר יותר בפלבנואידים ובסך הכל פנולים, וגם הפגין יכולת נוגדת חמצון גדולה יותר.ביופלבנואידיםפעילות ה-SPF והאנטי-קולגנאז של שתי התמציות היו דומות והשוות לאלו של סטנדרטים סינתטיים. התוצאות הכוללות מוכיחות שתמציות H. roseus הן מקורות מבטיחים לתרכובות פנוליות ביו-אקטיביות שיכולות להיות מיושמות כסוכני אנטי-אייג'ינג בקוסמטיקה לטיפוח העור.

מילות מפתח:אנטי-קולגנאז; נוגד חמצון; פלבנואידים; פרחים; קוסמטיקה צמחית; חומצות הידרוקסינמיות; LC-MS/MS-MRM; משאיר; טיפול בעור; הגנה מפני השמש

1. הקדמה

השימוש בקוסמטיקה עתיק יומין, וההיסטוריה שלו מתעצבת במקביל לזו של האנושות [1,2]. מוצרי קוסמטיקה לטיפוח העור הם חלק מהמוצרים החשובים ביותר, היא הקטגוריה העיקרית בתעשייה זו [1,3]. לכן, העניין בטיפוח העור הפך נפוץ, מה שעורר את הדרישה למוצרים יעילים שמקורם במקורות טבעיים [2].

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

המודעות האחרונה לגבי איכות הסביבה, שירותי הבריאות והשימוש הקטן בכימיקלים סינתטיים הובילה להתעניינות גוברת בקוסמטיקה מהצומח, המייצגת כעת שליש ממגזר הקוסמטיקה כולו [1A]. לפיכך, השימוש בתמציות צמחים ובמרכיבים הפיטו-מרכיבים שלהן כמרכיבים פעילים הוא גישה "פרו-אקולוגית" מודרנית [5,6]. הביקוש הגובר למוצרים אלו יכול לנבוע מהפחתת תופעות הלוואי שלהם, קשת הפעולה הרחבה שלהם בשילוב עם יעילות גבוהה ומחיריהם הנמוכים בדרך כלל [7,8].

צמחים עשירים במספר מחלקות של תרכובות ביו-אקטיביות, בהיותם אחד המקורות הרבים ביותר של מרכיבים חדשים האחראים לטיפול במחלות רבות [9,10]. בנוסף, צמחים הם גם מקור לחומרי לחות, חומרי טעם וריח ופיגמנטים טבעיים, מה שהופכים אותם למעניינים מאוד עבור יישומים קוסמטיים לעור [5]. לבסוף, תמציות צמחים נחשבות בדרך כלל בטוחות ועומדות בדרישות הרשויות הרגולטוריות [10,11].

בין התרכובות הקיימות בתמציות צמחים, פנולים זכו לתשומת לב מיוחדת כמרכיבים פעילים[12,13], בעיקר בגלל שהם בולטים כנוגדי דלקת, אנטי מיקרוביאליים ונוגדי חמצון[14,15]. תכונות אלו הופכות אותן למולקולות מניעה וריפוי אידיאליות עבור הפרעות עור, המיושמות בקוסמטולוגיה ודרמטולוגיה [16]. פעילות נוגדת החמצון הניכרת של פנולים אחראית חלקית להשפעות האנטי-אייג'ינג שלהם, אשר נובעות אולי מיכולתם להפחית את פירוק הקולגן ולהעניק הגנה מפני UV [16]. לכן, השימוש בתמציות טבעיות עשירות בפנולים עם יכולת נוגדת חמצון גבוהה נחקר ועודדו להחלפת נוגדי חמצון סינתטיים במוצרי עור [12].

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

מוצרים טבעיים המופקים מצמחים ממשפחת Malvaceae נמצאים בשימוש ברחבי העולם, והסוג Hibiscus זכה לתשומת לב רבה בשל הפעילויות הפרמקולוגיות המרובות של התמציות שלהם ובשל השפע הפנולי הגבוה שלהם [17-19]. Hibiscus spp. מכיל כ-240 מינים של עשבים, שיחים או עצים פורחים חד-שנתיים או רב-שנתיים, המופצים באזורים שונים בעולם [20]. תמציות היביסקוס יושמו ברפואה המסורתית כמרככים לטיפול בהפרעות עור וכוויות רבות[19,21].לקנות cistancheבהתבסס על נתוני ספרות אלו, תמציות מ- Hibiscus sp. צמחים עשויים להיות מרכיבים פעילים מעניינים לניסוחים קוסמטיים לעור, המגנים על התאים מלחץ חמצוני, פירוק קולגן וההשפעות המזיקות של קרינת UV.

למרות שהסוג היביסקוס כולל מינים רבים, פחות מ-10 אחוז מהם נחקרו עד כה [17]. Hibiscus roseus Thore (syn. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) הוא מין עשבוני רב-שנתי שהתאזרח באיטליה [22,23]הזיהוי והתיאור של H. roseus עדיין תחת ויכוח[ 20,23]. לפי הספרות, המין H. moscheutos subsp. palustris הוצג מוקדם מאוד באירופה ואילו בצרפת, הוא תואר כמין חדש, H. roseus, על ידי Thore בשנת 1807 [23]. מין זה לא אופיין בשל הרכבו הפנולי ונחקר בשל פעילותו הביולוגית, מה שהופך אותו למקור פוטנציאלי בלתי נחשף של תרכובות ביו-אקטיביות למוצרי טיפוח העור.

השימוש העממי בטיפולי עור והספקטרום הרחב של פעילויות ביולוגיות של מיני היביסקוס מצדיקים את החשיבות של מחקרים חדשים המתמקדים בסוג הצמח הזה [17]. לכן, מטרת מחקר זה הייתה לאפיין את ההרכב הפנולי ולהעריך את יכולת נוגד החמצון, ההגנה מפני השמש ופעילות עיכוב הקולגנאז של תמציות אתנוליות של עלים ופרחים של H. roseus. התוצאות שלנו מציגות לראשונה את ההרכב הפנולי והפעילות הביולוגית הקשורה לאנטי-אייג'ינג של H. roseus, מה שמצביע על הפוטנציאל של מין זה שלא נחקר בשימושים רפואיים וקוסמטיים כנוגד חמצון ותוסף אנטי-אייג'ינג.

2. תוצאות ודיון

2.1.אפיון וכימות פנולי

ניתוח יעד, המבוסס על LC-MS/MS-MRM (כרומטוגרפיית נוזלים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם הפועלת במצב ניטור ריאקציה מרובה), נערך כדי לזהות באופן טנטטיבי את התרכובות הפנוליות הקיימות בתמציות אתנוליות של H. roseus מאז ההרכב הפנולי של מין זה עדיין לא דווח בספרות. 19 תרכובות פנוליות שתוארו בעבר בסוג Hibiscus שימשו כסטנדרטים (טבלה משלימה S1) לפיתוח שיטת MRM, כאשר בחירת המעברים הטובים ביותר תוכננה על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים האינסטרומנטליים ועל ידי נתוני ספרות [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9.3 דקות, טבלה 1).

13 מתוך תשע עשרה תרכובות פנוליות היעד זוהו באופן אותנטי בתמציות שנותחו על ידי LC-MS/MS במצב MRM (טבלה 1).cistanchה-MRM הוא דרך רבת עוצמה לקביעה בו-זמנית של מספר רכיבים, המבוססת על יחס מסה למטען (m/z) של היון המולקולרי (((MH] ) ויון הבת המקביל לו. הוא מאפשר שיפור הסלקטיביות ורגישות של ניתוחי LC-MS/MS [30]מתודולוגיה זו אמינה מאוד ומתאימה לניתוחים של תמציות צמחים ותערובות מורכבות אחרות המובילות לספציפיות הגבוהה ביותר, רגישות מעולה ויכולת ריבוי קיצונית הודות לאפשרות להבחין בין תרכובות בעלות אותם יוני אב אך שברים שונים [31,32]. באמצעות שיטה זו, השגנו הפחתה משמעותית של ריצות כרומטוגרפיות, ספציפיות ודיוק גבוהים יותר הניתנים על ידי הפרדה טובה של תרכובות שזוהו באותם מעברים, תוך הימנעות מאובדן רגישות במקרה של תרכובות שונות שנפלטות יחד או עבור תרכובות הקיימות בריכוז נמוך מאוד [24,334].

בין 13 התרכובות הפנוליות שזוהו תוך שימוש בתקנים אותנטיים (טבלה משלימה S1), עשר היו נוכחות בלעדית בתמציות פרחים (איור 1 קו אדום, טבלה 1 HF): קטצ'ין ואפיקטכין (פסגות 16b ו-23), חומצה כלורוגנית (שיא 18), peonidin-3-O-glucoside ואונין (פסגות 21 ו-22), חומצה טרנס-פרולית (שיא 27), שלוש נגזרות של קמפפרול גליקוזיד (קמפפרול-3-O-rutinoside, kaempferol-7-O- glucoside, ו-kaempferol-3-O-glucoside; פסגות 30,31b ו-32), ו-salidroside (שיא 34). בנוסף, phloridzin (שיא 33b) זוהה רק בתמציות עלים (איור 1 קו כחול, טבלה 1 HL), בעוד רוטין וקוורצטין -3-O-glucoside (פסגות 26b ו-28a) זוהו בשני סוגי התמציות (איור 1, טבלה1HF/HL). נגזרות דומות של קוורצטין, כגון קוורצטין-3-O-sambubioside ואיסוקוורציטרין, נצפו בעבר ב-H.sabdariffa [26,29,35,36] ובתמציות H. rosa-sinensis [18]. חלק מהגליקוזידים הללו יכולים להתאים לנגזרות הקוורצטין שזיהינו ב-H. roseus. בנוסף, tiliroside זוהה בעבר גם בתמציות פנוליות של H. פרחי סבדאריפה [37,38]. Oenin (malvidin-3-O-glucoside) ו-peonidin-3-O-glucoside, שני האנתוציאנינים שזוהו כאן בפרחי H. roseus בפעם הראשונה, היו שונים מאלה שתוארו קודם לכן בפרחי H. sabdariffa, delphinidin 3-sambubioside, delphinidin-3-glucoside ו-cyanidin-3-O-sambubioside [27,35,39,40]. עם זאת, חשוב להזכיר שהחלק הנחקר ביותר של פרחי H. sabdariffa הם הגביע (גביעים), לא עלי הכותרת כפי שנחקרו כאן עבור H.roseus.

בנוסף לתרכובות שזוהו ואושרו על ידי תקני היעד האותנטיים, עוד 27 תרכובות זוהו לכאורה בתמציות עלים ופרחים של H.roseus בהתבסס על ה-MRM שלהן (m/z) ויוני הבת שלהן, ובכך לשקול את תוצרי הפיצול שהתקבלו. מהמבשר (טבלה משלימה S1). בפרט, נוכחות של נגזרות של p-coumaric,trans-ferulic,וכלורוגני חומצה, ונגזרות quercetin, כמו גם נגזרות phloretin ו-phloridzin נמצאו בשתי התמציות (טבלה 1).

הכימות של הפנולים שזוהו בתמציות אלו בוצע על ידי ניתוח HPLC-DAD (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב לזיהוי מערך דיודות; טבלה 2). התוכן של נגזרות חומצה הידרוקסינמית (THC) הייתה גבוהה יותר בעלים מאשר בפרחים, בעוד כמויות גדולות יותר של פלבנואידים (TFC) נמצאו בפרחים מאשר בעלים (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistanche אוסטרליהבדומה לתמציות H. sabdariffa, הקבוצות העיקריות של תרכובות שנמצאו בעלים של H. roseus היו נגזרות כלורוגניות וחומצה p-קומארית וכן חומצות קפאוילקיניות ו-p-קומארוילכיניות [26,40,41]. בנוסף, אנתוציאנינים דווחו באופן בלעדי ב- Hibiscus spp. פרחים וגביעים, יחד עם קטכינים [19,28,35].

לעומת זאת, חומצה פרולית ונגזרותיה דווחו פחות כמרכיבים של Hibis-cus spp. תמציות, אך עשויות להיות להן חשיבות רבה לפעילותן הביולוגית [6,42-44]. ואכן, נגזרות של חומצה פרולית שהתקבלו ממינים שונים של היביסקוס הראו תכונות פרמקולוגיות חשובות כמו פעילויות מעכבות של אנזים הממיר אנגיוטנסין [43,44]. בנוסף, חומצה פרולית תוארה כמולקולה פעילה בתמציות H.mutabilis,H.taivanensis[45,46], ובתמציות גביע H.sabdariffa [28,38].

לגבי היישומים הקוסמטיים הפוטנציאליים, הוכח שחומצה פרולית מעכבת יצירת מלנין [6,42], בעוד שנגזרות של חומצה p-קומארית בעלות דפיגמנטציה [47,48], אנטי דלקתית ופעילויות מעכבות טירוזינאז [49]. בנוסף, חקירות רבות מדגישות תפקידים נוספים של פלבונולים ואנתוציאנינים, שעשויים לפעול כתרכובות הגנה על העור, בפרט לעכב מלנוגנזה [50,51] ובאמצעות פעולתם כתרכובות אנטי-אייג'ינג ומניעת מלנומה [52,53]. בנוסף, ניתן לשפר את היישומים הפוטנציאליים של תמציות H. roseusleaf עבור הפרעות עור על ידי נוכחות של phloridzin, אשר הראה כמפחית את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים המושרים על ידי UVB בעור החשוף ל-UV [54].

2.2. מבחני פעילות נוגדת חמצון

כיום, הוכח באופן נרחב כי הצטברות של מיני חמצן תגובתיים (ROS) אחראית לתהליכי הזדקנות העור, המובילים ליובש, אובדן רקמות תת עוריות והיווצרות קמטים [55,56]. לכן, מציאת תרכובות טבעיות נוגדות חמצון פוטנציאליות שניתן ליישם במוצרי טיפוח העור חשובה מאוד לתעשיות הקוסמטיקה.

התוצאות שלנו הראו כי לתמציות עלי H. roseus הייתה פעילות נוגדת חמצון נמוכה יותר (מתבטאת כערכי ECso) מאשר פרחים (טבלה 3). ואכן, הפעילות נוגדת החמצון של תמציות הנמוכות הייתה גדולה לפחות פי שניים מאלה של תמציות העלים בשני המבחנים (טבלה 3). תוצאות אלו מתאימות להרכב הפנולי ולתכולתם של תמציות אלו (איור 1, טבלאות 1 ו-2), שכן תמציות HF היו עשירות יותר בתרכובות פנוליות (טבלה 2). ואכן, ניתוח המתאם בין ערכי ה-ECso לבין התוכן של המחלקות השונות של פנולים הראה כמשמעותי ושלילי עבור כל התרכובות מלבד THC. ככזה, כמויות גבוהות יותר של פלבנואידים, קטצ'ינים, אנתוציאנינים, דיהידרוג'לקונים ותכולת פנולים כוללת תורמים ליכולות נוגדות חמצון גדולות יותר (ערכים נמוכים יותר של EC50 - טבלה 4).

מבין הפלבנואידים, הקוורצטין ונגזרותיו הם נוגדי החמצון והרדיקלים החופשיים המבוססים ביותר, הפועלים גם כמעכבים יעילים של אוקסידאזים וליפוקסיגנאזים [57]. יתר על כן, דיהידרוכלקונים, כגון phloretin, תוארו גם כנוגדי חמצון רבי עוצמה במבחני 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) לניקוי ו-OH [58]. בנוסף, אנתוציאנינים מבודדים מתמציות היביסקוס הראו כתרכובות נוגדות חמצון עיקריות בתאים אנושיים [59].

תמציות של חלקים שונים של מיני היביסקוס הראו יכולת נוגדת חמצון גבוהה [18,21,27,35,40]. חלקים של תמציות אתנוליות של H. sabdariffa הראו ערכי EC50 נמוכים מאוד במבחני נוגדי חמצון, שהיו בקורלציה לתכולה הגבוהה בחומצה פרוטוקטכואית [21,59], חומצה כלורוגנית, פלבנואידים ואנתוציאנינים [24,60]. בנוסף, מחקר על H. esculentus הראה את פוטנציאל נוגדי החמצון במבחנה של נגזרות קוורצטין וקטכינים הנמצאים בתמציות שלו[61]. לבסוף, ב-H.acetosella, פעילות נוגדת החמצון הייתה בקורלציה חזקה עם תכולת האנתוציאנינים [62].

תוצאות המחקר שלנו על תמציות אתנוליות של H. roseus הראו פעילות נוגדת חמצון שהייתה פי מאה גבוהה מזו שדווחה עבור תמציות מימיות של גביע H. sabdariffl, שעבורן ה-EC היה קרוב ל-45 מ"ג מ"ל- ב-DPPH דומה במבחנה. מודל [56]עם זאת, בהבדל לממצאים שלנו, תכולת הפלבנואידים הכוללת והיכולת נוגדת החמצון של תמציות עלי H. sabdariffa היו גבוהות יותר מאלו של פרחים[63,64]. 2.3. מקדם הגנה מפני שמש (SPF)

קרינה אולטרה סגולה היא אחד הגורמים הסביבתיים המזיקים ביותר המשפיעים על הבריאות והפיזיולוגיה של העור, בהיותה סיבה חיצונית חשובה להזדקנות העור [65,6]חשיפה מתמדת לקרינה אולטרה סגולה מגבירה את הסיכון להפרעות פיגמנטציה ולהזדקנות העור [67]. הדבר נובע בעיקר מהעלייה ברמות ה-ROS, אשר מובילה לגירוי ייצור הקולגנאז ומביאה לפגיעה ניכרת בתפקוד תאי העור [56]. לכן, מרכיבים המגנים על קרינת UV, כולל אלו הקיימים בתמציות צמחים, מיושמים באופן נרחב בקוסמטיקה כדי למנוע חדירת קרינה אולטרה סגולה לעור אך גם למנוע ייצור ROS על ידי פעולה כנוגדי חמצון [56,

שיטה פשוטה לאימות יעילותם של רכיבים טבעיים שונים כמסנני UV היא בדיקת מקדם ההגנה מפני השמש (SPF), שהיא שיטה מהירה ואמינה במבחנה המבוססת על הקרנת הספיגה באזור הספקטרלי UV-B (בין 290 ל- 320 ננומטר), שימושי בשלב מוקדם של בחירת מרכיבים פעילים להגנת הפוטו [69].

התוכן הפנולי הגבוה ופעילות נוגדת החמצון של H.יתרונות cistancheroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2.6±0.15 עבור HL ו-2.4±0.19 עבור HF. תוצאות אלו מבטיחות שכן פורמולציה סטנדרטית של קרם הגנה המכילה 8 אחוז הומוסלט (מסנן קרינה כימי בשימוש נרחב) הראתה ערך SPF של 4[69,70]. התוצאות שנמצאו כאן עבור H.roseus היו דומות לאלו שנמצאו עבור מיני צמחים אחרים[68,69,71,72] והן חשובות בהתחשב בריכוז הנמוך של התמציות המשמשות לבדיקת השפעה זו.

תמציות של H. rosa-Sinensis כבר הראו השפעות חיוביות נגד נזקי קרינה אולטרה סגולה בעור עכבר באמצעות הגנה נוגדת חמצון [73]. מוצרים טבעיים המציגים SPF יחד עם יכולות נוגדות חמצון גבוהות ועיכוב של קולגנאז ואלסטאז הם מועמדים חשובים לשימוש כדי להגן על העור מפני נזקי צילום ולמניעת הופעת קמטים[66,71]. למעשה, הקשר בין שמש מסורתית מאושרת. מסננים ונגזרות אלו של מקורות טבעיים מייצגים מגמה בתעשיית הקוסמטיקה, שכן הצרכנים תופסים מוצרים אלה כבטוחים יותר, בשל תופעות הלוואי של מסנני UV סינתטיים[72].

התכולה הגבוהה יותר של סך התרכובות הפנוליות של תמציות HF (TPC; טבלה 2) יכולה להצביע על פעילות ספיגה גבוהה יותר של UV. עם זאת, גם תמציות עלים וגם פרחים הראו תוצאות דומות מאוד, מה שמצביע על כך שיותר מהתכולה הכוללת של פנולים, הפרופיל הפנולי של התמציות יהיה קשור להגנה מפני UV. בפרט, התכולה הגבוהה יותר של נגזרות חומצה הידרוקסינמית ב-HL( טבלה 2) עשויה לתרום להגדלת ערך ה-SPF שלהם, מכיוון שלתרכובות אלו יש ספיגת UV סביב 300-320 ננומטר [74] אשר מרוכזת לפיכך באזור UV-B. לעומת זאת, לפלבונואידים ואנתוציאנינים, הקיימים בעיקר בתמציות פרחים, יש ספקטרום רחב יותר של ספיגה בו קיימים לפחות שתי פסים, כאשר הרצועה הראשית נמצאת בטווח הנראה או קרוב אליו, בסביבות 350 ננומטר עבור פלבנולים ו-505-550 ננומטר לאנתוציאנינים [53,69]. אכן, נגזרות חומצה הידרוקסינמית מיוצרות על ידי צמחים, במיוחד להגנה מפני קרינת UV [75]. לכן, נגזרות חומצה הידרוקסינמית אלו יכולות לתרום רבות לספיגה של UV-B על ידי עור אנושי [6]. עם זאת, בהתחשב בנוכחותם של אנתוציאנינים ופלבנואידים המכסים טווח גבול של ספיגת אורכי גל, כולל גם אזורי UV-A והאזורים הנראים לעין, תמציות פרחי H. roseus עשויות להיות מבטיחות לניתוח נוסף ולפיתוח מוצרי קוסמטיקה של קרם הגנה. בנוסף, פעילות נוגדת החמצון הגבוהה יותר שנצפתה עבור HF (טבלה 3) יכולה לשפר את השפעות ההגנה מפני השמש בתכשירים נוספים אפשריים [69].

2.4. פעילות עיכוב קולגנאז

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50תמציות פרחים =0.14 ± 0.02 מ"ג מ"ל-1 ו-IC50leaf תמציות =0.13±0.01 מ"ג מ"ל-1, למרות ההבדלים ביניהם בהרכב ובתוכן הפנוליים (טבלאות 1 ו-2). זה יכול להיות בגלל האינטראקציות הסינרגטיות בין הפנולים לקולגנאז, שיכולות למלא תפקיד חשוב במנגנון העיכוב. בנוסף, תרכובות אחרות הקיימות אולי בתמציות H. roseus ואינן מנותחות כאן עשויות לקחת חלק בפעילות האנטי-קולגנאז, כולל ויטמין E וחומצה אסקורבית [71,7]. יתרה מכך, שתי התרכובות הסטנדרטיות שנבדקו, חומצה כלורוגנית וקוורצטין, שנגזרותיהן קיימות בתמציות עלים ופרחים של H. roseus (טבלה 1), הפגינו עיכוב קולגנאז גבוה מאוד, עם ערכי ICso של 5.8±0.5 ו-5.6±0.7 ug מ"ל. -ל בהתאמה. לכן, תרכובות אלו עשויות להיות אחראיות לפעילות האנטי-קולגנאז הנצפית. זה רלוונטי לשים לב שסוגים שונים של פנולים, הקיימים גם בתמציות הצמחים שלנו, כבר הראו פעילות אנטי-אייג'ינג באמצעות עיכוב פירוק הקולגן ותרומה ללחות העור [78]. לדוגמה, חומצה פרולית ונגזרותיה הוכחו כמעניקות לחות לעור וממריצות סינתזה של סיבי קולגן, בשימוש במוצרי קוסמטיקה כגון קרמים נגד קמטים [6]. יתר על כן, פלבנולים, בפרט נגזרות קוורצטין, הם מעכבים חזקים של אנזים הקולגנאז [79].

התוצאות שלנו מראות את ההשפעה המבטיחה של תמציות H. roseus נגד פירוק הקולגן, שהוא אחד מהחלבונים הגדולים שאחראים לאובדן גמישות העור ושלמותם ובהיווצרות קמטים [80,81]. אנזים הקולגנאז מעכב את שמירת גמישות העור וחוזק המתיחה [82]. ואכן, מחקרים שונים הראו את חשיבותם של נוגדי חמצון טבעיים בשל יעילותם בדחיית הזדקנות מוקדמת באמצעות עיכוב פעילות הקולגנאז [78,83].

מחקרים קודמים שהעריכו את ההשפעות של מיני היביסקוס בגירוי ייצור קולגן ובעיכוב פעילות קולגנאז נערכו [56,84,85]. עיכוב פעילות הקולגנאז של תמציות מימיות H. sabdariffa תואר לאחרונה בספרות [56]. בדומה לממצאים שלנו, המחברים לא צפו בהשפעות של עיכוב קולגנאז בריכוזים נמוכים של התמציות אלא רק בריכוזים גבוהים באופן משמעותי [56]. במחקר אחר, ערך ה-ICso בעיכוב קולגנאז של תמציות אתנוליות H. sabdariffin היה 0.75±0.04 מ"ג מ"ל-1[65], שהיא פעילות שהיא פעילות שהיא נמוך כמעט פי שישה מאלה המתוארים כאן עבור H. roseus.

3. חומרים ושיטות

3.1. חומר צמחי

עשרה צמחי Hibiscus roseus Thore, שנרכשו ממשתלה מסחרית בפירנצה (איטליה), נשתלו ב10-עציצי ליטר מלאים באדמה חולית (חול/כבול, 60:40, v/v) ונשמרו בחממה של המחלקה לחקלאות, מזון, סביבה וייעור (DAGRI) - אוניברסיטת פירנצה (UNIFD, Sesto Fiorentino (איטליה, 43949/N,1137/E). הצמחים טופחו בחממה מינואר עד יולי 2019, לפי הוראות שימוש השקיה בקיבולת מים בעציץ. מעשרת הצמחים השונים הללו נאספו עלים ופרחים בשתי בריכות בסוף יולי בתקופת הפריחה ואוחסנו מיד בדרגה -80 עד המיצוי. 3.2. מיצוי בעזרת אולטרסאונד

דגימות ליאופיליזציה (900 מ"ג) של פרחי H.roseus (HF) ועלים (HL) נטחנו בחנקן נוזלי וחולצו עם 3 × 15.0 מ"ל אתנול 75 אחוז (pH2.5 מותאם עם HCOOH) על ידי מיצוי בסיוע אולטרסאונד (איחוד האמירויות הערביות). איחוד האמירויות נערך באמבט קולי (BioClass@ CP104) תוך שימוש בתדר קבוע של 39kHz והספק כניסה של 100 W, למשך 30 דקות, ב-5 מעלות. לאחר צנטריפוגה (5 דקות, 9000 סל"ד, 5 מעלות; ALC@4239R, מילאנו, איטליה), הסופרנטנטים חולקו עם 3×15 מ"ל של n-hexane כדי להסיר תרכובות ליפופיליות שעלולות להפריע לניתוח. הפאזה האתנולית הופחתה ליובש, שוקללה על מאזן אנליטי דיגיטלי (Precisa[ 125A), והשאריות הושעו מחדש בתמיסה מחומצת של מתנול/מים (1:1 v/v,pH2.5 מותאם עם HCOOH). תהליך המיצוי בוצע בשלושה עותקים.

3.3.ניתוח LC-MS: פרופיל פנולי של התמציות

ניתוח LC-MS נערך באמצעות ספקטרומטר מסה ABSciex API3000 משולש מרובע פול (AB Sciex LC, Framingham, MA, ארה"ב) יחד עם מערכת Agilent 1100 HPLC עם משאבה בינארית ודגימה אוטומטית (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA, ארה"ב) ). רכישה והפחתת נתונים בוצעו באמצעות תוכנת Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, ארה"ב).

הפרדת HPLC בוצעה על עמודת Agilent Phenyl (3 × 10 מ"מ; 2.7 אום), והחומרים היו (A) מים מחומצים (ב-pH2.5 מותקנים עם HCOOH) ו-(B)acetonitrile/ מים (90/10, ב-pH2.5 מותאם עם HCOOH). נעשה שימוש במערכת ממס גרדיאנט כדלקמן: 0-3 min,5 percent B;3-18 min,5-40 percent B; 18-28 min,40 percent B;28-38min, 40-80 אחוז B; 38-43דקה, 80 אחוז B,43-45דקה, 80-5 אחוז B, בקצב זרימה של 0.4mLmin -l. ניתוח MS בוצע בתנאי הניסוי הבאים: לחץ אטמוספרי יינון כימי (APCI) באמצעות ממשק נבולייזר מחומם; זרם מחט （NC）,-5 μA; נבולייזר גז (אוויר), 10 (יחידות שרירותיות); גז עזר (אוויר), 3L min-l; טמפרטורת גז עזר (TEM), 550 מעלות; גז מסך (CUR, חנקן), 6 (יחידות שרירותיות); גז התנגשות(CAD, חנקן),9(יחידות שרירותיות, המקבילות ללחץ תא התנגשות של 2.6×10~ Torr).

זיהוי הרכיבים הפנוליים השונים בוצע בגישה ממוקדת, תוך שימוש בשיטת ניטור ריאקציה מרובה (MRM), אופטימלית עם תקנים עבור 19 תרכובות מטרה (נבחרו על סמך מחקרים קודמים של ההרכב הפוליפנולי של Hibiscus spp.[25,35] ): שני פלוואן-3-אולים (קטצ'ין ואפיקטכין), שבעה פלבנולים (קוורצגטין-7-O-glucoside, rutin, quercetin-3-O-glucoside, kaempferol-3-O. rutinoside , kaempferol-7-O-glucoside, kaempferol-3-O-glucoside ו-quercetin), אסטר קינמאט אחד (חומצה כלורוגנית), שתי חומצות הידרוקסינמיות (p-coumaric ו-trans-ferulic acid), שני dihydrochalcones ( phloridzin ו phloretin), אוקסיפלבון אחד (סלידרוזיד), וארבעה אנתוציאנינים (מירטילין, קורומנין, פאונידין-3-O-גלוקוזיד ואונין). זמן השמירה ומעברי ה-MRM היחסיים (מכמת ומסמיך) דווחו בטבלה משלימה S1. יתרה מכך, זיהויים זמניים נוספים נבדקו בגישה לא ממוקדת, סורקת את הקוודרופול מ-m/z 100 ל-100 Da.

3.4.ניתוח HPLC-DAD: כימות של פנולים

ניתוח HPLC-DAD בוצע כדי לכמת את המחלקות השונות של פנולים (נגזרות חומצה הידרוקסינמית, קטכינים, דיהידרוכלקונים, פלבנואידים ואנתוציאנינים) בתמציות. מנות של הדגימות (15 μL) הוזרקו לתוך Perkin Elmer Flexar נוזלי. משאבה רבעונית 200Q/410 וגלאי מערך דיודות LC 200 (DAD) (כולם מפרקין אלמר", ברדפורד, CT, ארה"ב). התנאים הכרומטוגרפיים היו זהים לאלו ששימשו לניתוחי HPLC-MS/MS (סעיף 3.3) .

הכרומטוגרמות נרכשו ב-280,330,350 וב-520 ננומטר (לכימות של אנתוציאנינים). הזיהוי והכימות של התרכובות הפנוליות בוצעו על סמך זמן האחזקה, מאפיינים ספקטרליים של UV והשוואה עם תקנים, וכן על סמך נתוני ספרות [25] ובניתוח LC-MS הקודם. עקומות כיול של חמש נקודות עם סטנדרטים שונים (חומצה כלורוגנית, p-coumaric, רוטין, אפיקטכין, נרינגין ופיונידין-3-O-glucoside, כולם מ-Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה) שימשו כדי לכמת את הפוליפנולים השונים שזוהו ומזוהים בתמציות. אם לא היה תקן מסחרי, הכימות בוצע באמצעות עקומת הכיול של תקנים מאותה מחלקה פנולית, תוך מתן תוכן משוער. הליניאריות של העקומות נקבעה על ידי המקדם של קביעה (R4), גבוה מ-0.99 עבור כל התקנים.

כל התמציות נותחו בשלושה עותקים והתוצאות הכמותיות של הפנולים ניתנו במ"ג גל של משקל יבש (mg gl DW), מבוטא כתכולת נגזרות חומצה קינמית הידרוקסית (THC), תכולת פלבנואידים כוללת (TFC), סך נגזרות קטצ'ין. תכולת (TCD), תכולת דיהידרוכלקונים כוללת (IDC), תכולת אנתוציאנינים כוללת (TAC), ותכולת פנולים כוללת (TPC), אשר נאמדו כסכום התרכובות המזוהות הבודדות השייכות לכל מחלקה.

3.5. מבחני פעילות נוגדת חמצון

בדיקת פעילות נוגדת החמצון בוצעה בשתי שיטות שונות: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ומבחני Hydroxyl Radical (OH)-Scavenging (HRS).

השיטה של ​​Khandi וצ'ארלס [{{0}}] יושמה עבור מבחן DPPH. בקצרה, דגימות מדוללות של התמציות (0.5 מ"ל) נוספו ל-0.5 מ"ל של תמיסת DPPH (0.1 מ"מ במתנול; Sigma-Aldrich@,St. Louis, MI, ארה"ב), והתערובת הושארה להגיב בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות בחושך. זמן זה (40 דקות) הוגדר על סמך תוצאות הניתוחים הקינטיים של כל תמצית והסטנדרטים של חומצה כלורוגנית ורוטין. לאחר זמן התגובה, הספיגה נמדדה ב-518 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר PerkinElmer§ Lambda 25UV/VIS. הספיגות של דגימות ריק (0.5 מ"ל מתנול ו-0.5 מ"ל) ושל הביקורת השלילית (0.5 מ"ל מתנול ותמיסת DPPH 0.5 מ"ל) הוערכו גם הם. כל הניתוחים נערכו בשלושה עותקים. אחוז הפעילות נוגדת החמצון חושב באופן הבא (1).

4. מסקנות

מטבוליטים משניים הם מרכיבים פעילים פוטנציאליים לניסוחים חדשים קוסמטיים. בין אלה, תרכובות פנוליות המופקות מצמחים עשויות להיות בעלות תכונות נוגדות חמצון ואנטי-אייג'ינג נהדרות, שהן יעילות בעיכוב של אנזימים עוריים (למשל, קולגנאז) ובספיגת UV. לכן, תמציות צמחים שנחקרו מעט, כמו אלה של H. roseus, יכולות לייצג מקורות לא נחשפים של מולקולות ביו-אקטיביות.

הדגמנו שהעלים והפרחים של H.roseus עשירים בנגזרות חומצה הידרוקסינמית ובפלבנואידים, כאשר לפרחים יש כמויות גדולות יותר של גליקוזידים של קאמפרול, קטצ'ינים, דיהידרוקלקונים ואנתוציאנינים, כל התרכובות הללו אינן מתוארות עדיין בספרות למין זה. . היכולת האנטי-אוקסידנטית הגדולה, במיוחד של תמציות פרחים, יחד עם ההגנה מפני השמש ופעילות אנטי-קולגנאז של תמציות עלים ופרחים כאחד, מצביעים על השימוש המבטיח של המין שנחקר בצורה גרועה ביישומי טיפוח העור. לסיכום, התוצאות שלנו הראו את הפוטנציאל של פרחים ועלים של H. roseus כמקורות לפנולים, כמו גם את פעילות התמציות שלהם כסוכני אנטי אייג'ינג העשויים לשמש כמרכיבים למוצרי קוסמטיקה פונקציונליים.

מאמר זה מופק מצמחים 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants