חלק Ⅰ ההשפעות של רמות חלבון וסיבים תזונתיים על ביצועי גדילה, התרחשות גאוט, קהילות חיידקים במעיים, וויסות חיסוני בציר הכליות של גוזלים

תַקצִיר

המחקר הנוכחי העריך את ההשפעות של רמות חלבון וסיבים תזונתיים על ביצועי גדילה, התרחשות גאוט, קהילות מיקרוביאליות במעיים וויסות חיסוני בציר המעי-כליות של גוזלים. תכנון פקטוריאלי אקראי לחלוטין של 2 £ 3 אומץ עם 2 רמות CP (180 [18CP] ו-220 [22CP] גרם/ק"ג) ו-3 רמות סיבים גולמיים (CF) (30 [CF נמוך], 50 [אמצע CF], ו-70 [CF גבוה] גרם/ק"ג). הדיאטות הגבוהות של CP או CF נמוך הובילו את הגוזלים למחלת גאוט. הדיאטות עתירות החלבון החמירו את תפקוד הכליות; ריכוזי UA ו-Cr בנסיוב, כמו גם פעילות XOD ב9-אווזים בני יום שניזונו ב-22% דיאטות CP, עלו באופן משמעותי. למרות שרמות CF מ-3 עד 7 אחוזים לא השפיעו ישירות על בריאות הכליות, הגדלת רמות ה-CF עשויה להאיץ את העלייה של פרוביוטיקה בעורף של גוזלים ולמנוע חיידקים זדוניים, ולהקל על דיסביוזיס המעיים הנגרמת על ידי דיאטות עתירות חלבון. ניתוח של המיקרוביוטה הצקלית באמצעות רצף RNA 16Sr גילה ששפע ה-Enterococcus בקבוצת 22CP היה גבוה יותר מזה בקבוצת 18CP אך ירד עם עלייה ברמות ה-CF ב-d 9. השפע של לקטובצילוס עלה עם עליית רמות ה-CF. בנוסף, ריכוזים גבוהים יותר של LPS וציטוקינים פרו-דלקתיים בנסיוב ורמות ביטוי mRNA מווסתות ברקמות הצקל, השקדים והכליות הצביעו על כך שדיאטות עתירות חלבון יכולות להפעיל את מסלול TLR4/MyD88/NFkB ולגרום לדלקת מעיים וכלייתית אצל גוזלים צעירים. נמצא כי ריכוזי LPS בסרום ב-d 9 יורדים עם עלייה ב-CF, אם כי שינוי ברמות ה-CF בתזונה לא השפיע ישירות על מדדי החיסון בסרום של גוזלים. לסיכום, דיאטת ה-CP הגבוהה הפעילה השפעה שלילית על התרחשות גאוט, קהילות מיקרוביאליות וויסות חיסוני בציר המעי-כליה של גוזלים, בעוד שרמות סיבים תזונתיות מוגברות כראוי סייעו לשמור על איזון המעי והפחתת ריכוז ה-LPS בסרום. אנו מציעים דיאטה של ​​18 אחוז CP בשילוב עם CF של 5 אחוז כשילוב האופטימלי להאכלת גוזלים.

מילות מפתח

סיבים גולמיים, חלבון, צנית גזעית, קהילות מיקרוביאליות במעיים, ציר מעי-כליה,היתרונות של Cistanche.

לחץ כאן כדי לדעתמהן ההשפעות של Cistanche על הכליות

מבוא

אווזים, שהם אוכלי עשב, תלויים בסיבים תזונתיים כדי לבצע פעילויות רגילות. ידוע שרמות מתונות של סיבים גולמיים (CF) בתזונה מגבירים את העמידות למחלות ומעודדים צמיחה בעופות על ידי וויסות האיזון המיקרו-אקולוגי של המעי ושיפור תפקודי החיסון (Jha and Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). דיווח כי הכללת פקטין תזונתית העלתה את ביטוי ה-IL- 12 ברירית האיליאלית והגדילה את ייצור האינטרפרון-g בשקדים הצוקיים. מספר מחקרים הצביעו על כך שתזונה דלת CF מפחיתה את המגוון המיקרוביאלי וכן את השפע היחסי של מיקרוביוטה מועילה באוזים ceca ב- d 70, ובכך משפיעה לרעה על ביצועי הגדילה, ניצול החומרים התזונתיים וחסינות רירית המעיים של אווזים אלה (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). CF תזונתי עשוי לסייע בשמירה על תפקוד מחסום המעי על ידי חיזוק המבנה והתפקוד הרירי, כמו גם על ידי הגדלת אוכלוסיית וגיוון החיידקים הקומנסאליים במערכת העיכול. חשוב מכך, על פי הדיווחים, ציפורים צעירות רגישות יותר לשינויים בחומרים מזינים תזונתיים ובקהילות מיקרוביאליות במעיים מאשר מבוגרים (Gao et al., 2017). עם זאת, מחקרים על ההשפעה של רמות CF בתזונה על מיקרוביוטה של ​​המעיים ועמידות למחלות אצל גוזלים הם נדירים.

ביצועי גדילה בציפורים רגישים פחות לשינויים ברמות החלבון מאשר לשינויים באנרגיה התזונתית במזון כדי לספק את הטבע הנדיף המקורי שלהם (Shi et al., 2006). דווח כי לא נצפה הבדל משמעותי בעלייה במשקל באווזים עם רמות חלבון בתזונה שנעות בין 16 ל-22 אחוזים, מה שנראה כללי מדי בהיקפו (Summers et al., 1986). לעומת זאת, ריכוזי החלבון התזונתיים משפיעים חזק על איזון פלורת המעיים ועמידות למחלות בעופות (Lee et al., 2020). גאוט קרביים, המופיע בעיקר בציפורים, היא מחלה מטבולית הנגרמת כתוצאה מפגיעה בתפקוד הכליות, ולאחריה הצטברות של גבישי אורט באיברים שונים (Zhang et al., 2018). מחקר קודם שלנו הראה שדיאטות עתירות חלבון היו מעורבות בפגיעה בכליות ובדיסביוזה של מיקרוביוטה של ​​המעי הקשורה לגאוט אצל גוזזים (Xi et al., 2020a). תוצאות מחקר זה הראו שבהשוואה לאוזנים שניזונו בדיאטה של ​​16 ו-18 אחוז חלבון גולמי (CP), אווזים שניזונו בדיאטת CP של 22 אחוזים סבלו מפגיעה בתאי אפיתל במעי ודיסביוזיס של מיקרוביוטה cecal, מה שהוביל לפציעה של כליות, או אפילו גאוט. נראה כי המיקרוביוטה של ​​מערכת העיכול והמטבוליטים שלה ממלאים תפקיד מרכזי בחיזוק החסינות של ציר המעי-כליה בעופות (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). לפיכך, זיהוי תוכנית תזונתית מתאימה, המתמקדת בהשפעות של רמות CF ו-CP בתזונה, עשויה לסייע במזעור השכיחות של גאוט ולהגביר את החסינות על ידי שמירה על איזון מיקרו-אקולוגי של המעי ושיפור הוויסות החיסוני היחסי אצל גוזלים.

המיקרוביום של המעי מפעיל השפעה עמוקה על ויסות מערכת החיסון של המעי, המשפיע על חסינות מערכתית ותורם לאיזון חיסוני. שינויים בהרכב התזונתי, כולל רמות ה-CP וה-CF, משפיעים על ההרכב והפעילויות המטבוליות של מיקרוביוטה המסתגלות לסביבת המעיים (Liu et al., 2014). בעופות, כל שיבוש במיקרוביום עלול לגרום לחוסר איזון בחסינות המערכתית, לתרום לירידה בעמידות למחלות. במחקר קודם שלנו, מצאנו שדיסביוזיס של מיקרוביוטה של ​​המעי הגבירה את הסיכון לגאוט קרביים אצל גוזלים על ידי הגברת הדלקת וכן טרנסלוקציה של ליפופוליסכריד שמקורו במעי (LPS) בציר המעי-כליה. במפל מורכב זה, קשירת LPS מפעילה את הגורם הגרעיני, משפר שרשרת-קאפ-קלה של מסלול תאי B המופעל (NF-kB) וייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון אינטרלוקין 1b (IL1b) וגורם נמק של גידולים a (TNFa), ובכך מקדם התפתחות של סבילות אימונולוגית הן במעיים והן בכליות של גוזלים (Xi et al., 2019). המחקר הנוכחי התמקד בחקירת הקהילות המיקרוביאליות המאכלסות את המעי של גוזלים שניזונו ברמות שונות של CP ו-CF תזונתיים, ומדד שינויים בהופעת גאוט על ידי ניתוח הרגולציה החיסונית והתגובות הדלקתיות הנגרמות בציר המעי-כליה.

Cistanche סטנדרטי

חומרים ושיטות

1. אישור אתי

המחקר אושר על ידי ועדת המחקר של האקדמיה למדעי החקלאות בג'יאנגסו ונערך על פי תקנות מינהל העניינים לגבי חיות ניסוי (צו מס' 63 של האקדמיה למדעי החקלאות בג'יאנגסו ב-8 ביולי 2014). כל הניסויים נערכו על פי הנחיות של ARRIVE (מחקר בעלי חיים: דיווח על ניסויים ב-Vivo).

2. עיצוב ניסוי

מחקר זה נערך בין ה-2 ל-17 בנובמבר, 2020, במרכז החיות הניסוי של האקדמיה למדעי החקלאות של ג'יאנגסו (נאנג'ינג, סין). בסך הכל 1,620 אווזי Taizhou בני יום אחד (Anser domestica, 100 אחוז ,), שסופקו על ידי Tianzhijiao Breeding Geese Company Limited (צ'וז'ו, סין), הוקצו באקראי 6 קבוצות ניסוי. לכל טיפול היו 6 שכפולים, וכל שכפול הכיל 45 ציפורים. לניסוי נעשה שימוש אקראי לחלוטין בתכנון פקטוריאלי בסך 2 £ 3. הוכנו שש דיאטות עם 2 רמות CP ושלוש רמות CF (טבלה 1). 2 רמות ה-CP היו 180 (18CP) ו-220 (22CP) גרם/ק"ג ושלוש רמות ה-CF היו 30 (CF נמוך), 50 (אמצע CF) ו-70 (גבוהה) CF) גרם/ק"ג. כל הגוזלים גודלו בבית תרמוסטטי עם כלובי נירוסטה בגודל זהה (1.20 ליש"ט 1.00 ליש"ט 0.50 מ"ק, 9 אווזים לכלוב, צפיפות גרב: 7.5 עופות/מ"ר), שהונחו בגובה 0.50 מ' מעל פני הקרקע. הגוזלים הוזנו בתנאי ניהול סטנדרטיים עם הזנת גלולה ומים אד ליביטום. מספר המזינים התלויים ושותי הפטמות בכל כלוב היה מספיק לאורך כל המחקר. טמפרטורת הסביבה נשמרה על 30 מעלות מ-d 0 עד 3, 29 מעלות מ-d 4 עד 6, 28 מעלות מ-d 7 עד 9, ו-26 מעלות מ-d 10 עד סוף הניסוי. הלחות היחסית לאורך 21-תקופת הניסוי הייתה כ-60 אחוזים. מקורות האור (אור לבן, 400 -760 ננומטר) הושוו לעוצמת הארה של 15 § 0.3 לוקס ברמת ראש הציפור, עם לוח זמנים של אור של 22 שעות אור מ-d 0 עד 3, 18 שעות אור מ-d 4 עד 14, ו-16 שעות של אור מ-d 15 עד 21 במחזור של 24- שעות.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>אחוז אחד מהמזון הטרי) שנרכש באקראי מ-5 מקומות עורבבו לצורך ניתוח. CP ו-CF נמדדו לפי GB/T6432 (תקן סיני לאומי: קביעת חלבון גולמי במזון) ו-GB/T6434 (תקן לאומי סיני: קביעת סיבים גולמיים במזון).

ה-ADFI וה-BW (משקל חי) של גוזלים תועדו באמצעות משקל אלקטרוני (YP60001, Hengji, שנחאי, סין) לפני האכלה במהלך הבדיקה ו-ADG ויחס המרת מזון (FCR) חושבו בסוף הניסוי. בנוסף, התחלואה המצטברת של גאוט של כל המשכפלים (כל שכפול הכיל 45 ציפורים) בין הטיפולים השונים סוכמה לאחר תקופת הניסוי. תקן הבחירה לגאוט הוגדר כאווז המציג נגעים בכליות גס וריכוז חומצת שתן בסרום (UA) מעל הערך השולי של ריווי-על של אורט (זכר, 416 ממול/ליטר ונקבה, 357 ממול/ליטר). הנגעים הגסים השולטים של הכליות הם חיוורים, מנומרים ונפוחים, והצינוריות והשופכנים הכליות מתנפחים עם עודף urates (Xi et al., 2020a).

הרבה סיסטאנצ'ה

3. מדידת מטבוליטים בסרום

36 אווזים (n=6 אווזים/טיפול) נבחרו באקראי לאיסוף דם מיידי (5 מ"ל/אווזית), לאחר עריפת ראש, דרך צינורות לאיסוף דם ללא נוגד קרישה ב-D 9 ו-18, ​​בהתאמה. כל דגימות הדם הודגרו ב-37 מעלות למשך 2 שעות לאחר האיסוף ועברו צנטריפוגה ב-1,5{{10}}0 £g למשך 15 דקות. הסרה שהושגה אוחסנה בשפופרות של 0.6 מ"ל Eppendorf ב-80 מעלות עד לניתוח נוסף. רמות UA בסרום נקבעו באמצעות קולורימטריה של חומצה פוספוטונגסטית. ריכוזים של קריאטינין (Cr) וחנקן אוריאה (UN), כמו גם פעילות קסנטין אוקסידאז (XOD) נקבעו באמצעות קולורימטריה אנזימטית באמצעות ספקטרופוטומטר של מיקרופלט (Promega Corporation, Madison, WI). ערכות אלה סופקו על ידי המכון הביו-הנדסי Jiancheng (נאנג'ינג, סין); הקודים היו C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) ו-A002 (XOD). ריכוזי IgM, IgA ו-IgG בסרום באווזי הניסוי נמדדו באמצעות ערכות אימונוגלובולין ELISA של אווז שנרכשו מ- Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (שנחאי, סין). קומפלקסים חיסוניים במחזור הדם (CIC), IL-1b וריכוז TNF-a נקבעו באמצעות ערכת ELISA אווז מסחרית (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, סין). הפעילות של דיאמין אוקסידאז (DAO) נמדדה באמצעות קולורימטריה אנזימטית באמצעות מנתח ביוכימי אוטומטי (Hitachi, טוקיו, יפן). סרום LPS נמדד באמצעות מבחן Limulus המסורתי (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., שיאמן, סין). טווחי הזיהוי של LPS במבחן Limulus נעו בין 0.015 ל-0.6 EU/mL. כל החומרים ששימשו לאיסוף דם ולמדידת אנדוטוקסינים היו נטולי פירוגנים. כל המבחנים בוצעו לפי הוראות היצרן. דגימות סרום נבדקו בשלושה עותקים. מקדמי וריאציה תוך-ובין-מבחן עבור המבחנים היו<10% and <15%, respectively.

4. תצפית היסטומורפולוגית

ה-ceca (אורך {{0}} ס"מ) של 36 אווזים (n=6 אווזים/טיפול) נאספו לאחר איסוף דגימת דם ב-D 9 ו-18 לצורך ניתוח היסטולוגי. דגימות שנאספו מגוזליות נקבעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד, הוטבעו בפרפין וחתכו (עובי פרוסה: 3 מ"מ; 4 פרוסות לכל גוזלית). שינויים פתולוגיים במעי הרחם (כ-7 ס"מ מרוחק מהסוגר הפילורי) נבדקו במיקרוסקופ אור (OLYMPUS, טוקיו, יפן) לאחר צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE). גובה הווילוס ועומק הקריפטה של ​​המעי הגס נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.8.0; המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD). נרשמו שמונה מדידות של villi שונים שלמים לכל פרוסה (8 מדידות ב-3 שדות ראייה עוקבים). ניתוחים סטטיסטיים של מדידות היסטולוגיות בוצעו בהתבסס על ממוצע של 32 מדידות לכל גוזלית (4 פרוסות לכל גוזלית ו-8 מדידות לפרוסה). צפיפות תאי הגביע חושבה כספירת תאי הגביע חלקי אורך הווילוס המתאים, אשר לאחר מכן הוערך בממוצע והובע כמספר תאי הגביע לכל 100 מ"מ של אורך וילוס.

Cistanche tubulosa

5. רצף rRNA של 16S של תוכן המעי הגס

תכולת המעי הגס של אווזים (6 אווזים/טיפול 6 פאונד קבוצות פאונד דגימה פעמיים=72 גוזלים) נאספה ב-d 9 ו-d 18 בבקבוקונים קריוגניים סטריליים עם הברגה פנימית של 2 מ"ל, ואוחסנה מיד בחנקן נוזלי לניתוח 16S rDNA . DNA מדגימות תכולת המעי החולץ באמצעות MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) בהתאם להוראות היצרן. דגימות ריקות המורכבות מספוגיות שאינן בשימוש עובדו באמצעות מיצוי DNA, והן נבדקו כדי לא לייצר אמפליקון 16S. ה-DNA הכולל נחלץ ב-50 מ"ל של חיץ elution באמצעות הליך שונה שתואר על ידי היצרן (QIAGEN, דיסלדורף, גרמניה) ואוחסן ב-80 מעלות.

באמצעות ה-DNA הכולל של דגימות כתבנית ו-16S rDNA פריימרים (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30), הגבירנו את אזור V3-V4 של חיידקים 16S rRNA. כל התגובות בוצעו בתערובת של 25 מ"ל (נפח כולל) המכילה 25 ננוגרם של תמצית DNA גנומי, 12.5 מ"ל של PCR Premix, 2.5 מ"ל מכל פריימר ומים בדרגת PCR כדי להתאים את הנפח. מוצרי PCR נורמלו באמצעות AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA), שאיפשר לדלג על שלב הכימות, ללא קשר לנפח ה-PCR שנשלח לרצף. בריכות Amplicon הוכנו לרצף באמצעות חרוזי AMPure XT (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; מבוצע על ידי OebioTech Co., Ltd, שנחאי, סין). הגודל והכמות של ספריית האמפליקון הוערכו באמצעות LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) וערכת כימות ספריית Kapa עבור Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA), בהתאמה. ספריית ה-PhiX Control (v3) (Illumina) שולבה עם ספריית האמפליקון (צפי ל-30 אחוז). הספרייה הייתה מקובצת בצפיפות של כ-570 K/mm2. הספריות עברו רצף בריצות 300PE MiSeq, כאשר ספרייה אחת רצתה עם שני הפרוטוקולים באמצעות פריימרים סטנדרטיים לרצף Illumina, ובכך ביטלה את הצורך בקריאה שלישית (או רביעית) באינדקס. הקריאות סוננו באמצעות תובנות כמותיות לגבי מסנני איכות אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME;). צינור CDHIT שימש לבחירת יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) על ידי הכנת טבלת OTU. רצפים בעלי דמיון של 97 אחוז הוקצו ל-OTUs. רצפים מייצגים נבחרו עבור כל OTU, ונתונים טקסונומיים הוקצו לאחר מכן לכל רצף מייצג באמצעות מסווג Ribosomal Database Project (RDP). מספר ההצטרפות ל-GenBank של רצפי נוקלאוטידים אלה של OTU הוא SAMN21014082. כדי להעריך גיוון אלפא, טבלת ה-OTU שודרגה, וחושבו 4 המדדים הבאים: מדד Chao1 להערכת עושר; מדד המינים שנצפה כספירה של OTUs ייחודיים שנמצאו במדגם; מדד שאנון; ומדד סימפסון.

6. PCR בזמן אמת

ings (n {0}} אווזים/טיפול) נאספו ב-d 9 ו-18 לניתוח PCR בזמן אמת (RT-PCR). RNA כולל הוצא מהרקמות, באמצעות ריאגנט TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY), ותעתיק לאחור באמצעות ערכת רמות תעתיק לאחור (TaKaRa, Dalian, סין), לפי פרוטוקול היצרן. b-actin שימש כבקרה בלתי משתנה. פריימרים תוכננו באמצעות תוכנת Primer Premier 5.0 והרצפים שלהם מפורטים (טבלה 2). RT-PCR בוצע באמצעות SYBR Premix Ex Taq (רושה, באזל, שוויץ). כל RT-PCRs בוצעו בשלושה עותקים. רמות הביטוי היחסיות של גני המטרה נקבעו באמצעות 2 שיטות DDCt.

7. ניתוח נתונים

נתוני ניסוי שנגזרו מ-6 שכפולים לכל טיפול נותחו באמצעות תוכנית IBM SPSS Statistics 16 (IBM Corporation, Somers, NY). כל שכפול נחשב כיחידה ניסיונית וההליך הסטטיסטי בו נעשה שימוש היה ניתוח רב משתנים של שונות תוך שימוש בהליך המודל הליניארי הכללי (GLM). כאשר נקבעו הבדלים משמעותיים, אמצעי הטיפול הופרדו והשוו באמצעות מבחן ריבוי הטווחים של Duncan. מבחן דו-זנבתי נחשב למובהק סטטיסטית ברמת הסתברות של פחות מ-5 אחוזים (P < 0.05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang,y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan *, ו-Zhendan Shi *.

* מעבדת מפתח לחקלאות משולבת גידולים ובעלי חיים של משרד החקלאות וענייני הכפר, המכון לגידול בעלי חיים, האקדמיה למדעי החקלאות של ג'יאנגסו, נאנג'ינג 210014, סין;

# המכללה למדעי בעלי החיים, אוניברסיטת ז'ונגקאי לחקלאות והנדסה, גואנגג'ואו 510000, סין.