חלק ראשון|מעכב של NF-KB ואגוניסט של AMPK: חיזוי רשת ושילוב מולטי-Omics כדי להפיק נתיבי איתות עבור אקטאוזיד נגד מחלת אלצהיימר

חלק ראשון|אקטאוזידים: כיצד להתייחס למחלת אלצהיימר כאחד המרכיבים היעילים של Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* ו-Fei Li1,2 * מפתח מדינה אחד מעבדה לרפואה טבעית, האוניברסיטה לתרופות סין, נאנג'ינג, סין, המכללה לרוקחות 2, האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג, אורומצ'י, סין

מחלת אלצהיימר (AD) היא הסוג השכיח ביותר של דמנציה.אקטאוזיד (פעולה) היא תרכובת המבודדת מCistanche tubulosa, בעל תכונות נוירו-הגנה מצוינות. עם זאת, המנגנון הבסיסי שלפעולהבוויסות הקיטוב של מיקרוגליה נותר לא מוגדר. לכן, הוקם מודל רשת חישובית כדי לזהות את יעדי ההנעה שלפעולהולחזות את המנגנון שלו על ידי שילוב מסדי נתונים זמינים מרובים. מודל AD המושרה על ידי AlCl3- בזחלי דג הזברה הוקם בהצלחה כדי להדגים את היעילות הטיפולית של ACT. לאחר מכן, תאי BV-2 המושרים על ידי LPS חשפו את התפקיד החיובי של ACT בקיטוב M1/M2. מסלולי NF-KB ו-AMPK אושרו עוד יותר על ידי ניתוח טראנסקריפטומי, ניתוח מטבולומי, טכניקות ביולוגיה מולקולרית ועגינה מולקולרית. המחקר סיפק מנגנון אינפוזי של ACT וחשף את הקשר בין מטבוליזם לקיטוב מיקרוגליה מנקודת המבט של תפקוד המיטוכונדריה. חשוב מכך, הוא סיפק גישה שיטתית ומקיפה לגילוי מטרות תרופות, כולל השינויים בגנים, מטבוליטים וחלבונים.

מילות מפתח: אקטאוזיד, תאי BV-2, מטבוליזם, RNA-seq, מיטוכונדריה, דלקת עצבית

למידע נוסף, צור קשר עם: ali.ma@wecistanche.com

לחץ ל- Cistanche DHT לזיכרון

מבוא

עם ההזדקנות והגידול המהיר של האוכלוסייה, מספר מקרי הדמנציה בעולם הראה מגמת עלייה.מחלת אלצהיימר(AD) היא מחלה נוירודגנרטיבית שכיחה המלווה בהפרעות קוגניטיביות ודיסקינזיה (Perea et al., 2020), שהיא הסוג השכיח ביותר של דמנציה. הוא מאופיין באובדן עצבי חמור, פלאקים סניליים וסבכים נוירו-פיבריריים (Shiao et al., 2017). הפתוגנזה שלמחלת אלצהיימרהוא רב מימדי ומקשר לדלקת עצבית. דלקת עצבית מונעת על ידי הפעלה של תאי גליה, אשר קשורה קשר הדוק להתרחשות ולהתפתחות AD (Hanslik and Ulland, 2020; Linnerbauer and Rothhammer, 2020). במהלך ההתקדמות וההחמרה של דלקת עצבית, מיקרוגליה נחשבת לגורם מפתח. מיקרוגליה הם תאי החיסון העיקריים במערכת העצבים המרכזית, אשר קשורים קשר הדוק למפל של תהליכים כגון התפתחות המוח, תחזוקה של הסביבה העצבית, כמו גם תגובות לפציעה ותיקון (Perea et al., 2020). יתר על כן, ניתן לעורר מיקרוגליה לפנוטיפ M1 ולהגביר את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים כאשר מתרחשות מחלות הקשורות לדלקת עצבית כגון AD (Tsukahara et al., 2020). מחקרים גם מראים שהקיטוב לפנוטיפ M1 מלווה לעתים קרובות בהפרעות מטבוליות (Li L. et al., 2020), מה שמוביל לחוסר איזון של חילוף החומרים באנרגיה ולחוסר תפקוד מיטוכונדריאלי (Agrawal ו-Jha, 2020). שינויים שליליים אלו נובעים מניוון עצבי, אפילו ממחלת אלצהיימר.

אקטאוזיד (ACT), a פנילתנואיד גליקוזיד, נגזר בעיקר מCistanche tubulosa. עדויות מתגברות העלו כי ל-ACT יש פעילויות תרופתיות רבות, כוללנוירו-פרוטקטיבי(Wei et al., 2019),אנטי דלקתי(Lai et al., 2019), וכןנוגד חמצון(Ji et al., 2019) השפעות. בפרט, הוכח כי Acteoside יכוללשפר את הלמידה והזיכרוןפגיעה וכן להגביר את חילוף החומרים באנרגיה בחולדות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין (Chen J. et al., 2020). בנוסף, זה יכול גם לעכב מוות של תאים אפופטוטיים עצביים ונזק מיטוכונדריאלי בעכברים אוטואימוניים אנצפלומיאליטיס ניסיוניים (Li W. et al., 2020). עם זאת, ההשפעה של ACT על קיטוב M1/M2 של מיקרוגליה והמנגנון שלה מדווחת רק לעתים רחוקות. עד כה, המנגנונים כמו תיקון תפקוד המיטוכונדריה וויסות חילוף החומרים בתאים אינם ברורים ויש צורך במחקר מדעי נוסף כדי להבהיר את המנגנון המדויק.

מטרת הדו"ח הנוכחי היא לחקור את היעילות הטיפולית של ACT וכן את המנגנון המולקולרי הבסיסי של ACT על AD. כאן, שיטת סיליקו שיטתית של זיהוי יעדי תרופה מבוססת על מאגרי המידע המאוחדים. אנו חוקרים עוד את המנגנונים האפשריים של ACT ברמה הביולוגית המולקולרית על ידי שילוב רצף RNA (RNA-seq) עם שיטות מטבולומיות וטכניקות ביולוגיה מולקולרית. השילוב של אסטרטגיות סקר שיטתיות בסיליקו, in vivo ו-in vitro מספק פרוטוקול חדש לגילוי אובייקטיבי של תרכובות מרובות מטרות של הרפואה הסינית המסורתית.

חומרים ושיטות

דוגמנות רשת

ארבע פלטפורמות מקוונות שולבו כדי לחזות ולגלות את המטרות שלאקטאוזיד, כלומר, GeneCards1, גישת אנסמבל דמיון (SEA2), SwissTargetPrediction3 ו-PharmMapper4. כל אסוציאציות הגנים של AD נאספו באופן עצמאי מ-DisGeNET5 ו- GeneCards. לאחר ניתוח אינטראקציות יעד-יעד שנערך על ידי String database6, הרשת שולבה עוד יותר על ידי תוכנת Cytoscape (גרסה 3.8.2). ניתוח העשרה של GO ו-KEGG בוצע במסד הנתונים של DAVID7 כדי להעיר ולכרות את הרשת.

קיבוץ בעלי חיים ודגמים

דג זברה מסוג בר (זן AB, בן 4 חודשים) נבחרו במחקר זה (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). הם נשמרו תחת מחזור אור/חושך של 14/10- שעות ב-28◦C, לפי השיטה הקודמת (Li YQ et al., 2020). כל הניסויים בדגי הזברה בוצעו בפיקוח ועדת האתיקה לבעלי חיים של האוניברסיטה לתרופות בסין. זחלי דג הזברה חולקו לשש קבוצות וטופלו מ-3 ימים לאחר ההפריה (dpf) עד 7 dpf: קבוצת ביקורת, קבוצת מודל, דגם בתוספת דונפזיל הידרוכלוריד (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) דגם פלוסאקטאוזיד(טוהר HPLC גדול או שווה ל-98 אחוז, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) קבוצות. קבוצת הביקורת נשמרה במדיום עם 0.2% DMSO וקבוצת המודל טופלה ב-150 µM AlCl3 (pH 5.8). קבוצת המודל בתוספת DPZ טופלה יחד עם AlCl3 ו-8 מיקרומטר DPZ. הדגם פלוסאקטאוזידקבוצות טופלו יחד עם AlCl3 וריכוזים שונים של ACT (200, 100 ו-50 מיקרומטר).

ניתוח התנהגות

תנועות זחלי דג הזברה תועדו על ידי מנתח התנהגות ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) בטמפרטורה של 28◦C. בקצרה, הפרמטרים ההתנהגותיים ועיבוד התוצאות היו עקביים עם השיטה שהקמנו קודם לכן (Li YQ et al., 2020). כאן, מהירות ממוצעת (AS), שינוי מהירות (1S), שיעור התאוששות דיסקינזיה (DRR) ויעילות תגובה (RE, אחוזים) נבחרו להערכת התאוששות דיסקינזיה בדגי הזברה.

קביעת פעילות אצטילכולין אסטראז וכולין אצטילטרנספראז

לאחר טיפול מ-3 עד 7 dpf, זחלי דג הזברה נאספו כדי למדוד פעילויות אצטילכולין אסטראז (AChE) ו- Choline Acetyltransferase (ChAT). בהתבסס על הפרוטוקול של היצרן, הפעילות זוהתה על ידי ערכות ה-Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)

תרבויות תאים וטיפולים

קו התא BV-2 נרכש מ-American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ארצות הברית). הם תורבו ב-DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, סין). המדיום קיבל תוספת של 10 אחוז FBS (Gibco, Grand Island, NY, ארצות הברית), 100 U/ml פניצילין ו-100 מ”ג/מ”ל סטרפטומיצין, מלווה ב-95 אחוז אוויר/5 אחוז CO2 בטמפרטורה של 37◦C. תאי BV-2 הודגרו עם ACT (50, 25 ו-12.5 מיקרומטר) או גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS, 1 מיקרוגרם/מ"ל; Sigma Aldrich, St Louis, MO, ארצות הברית) למשך 24 שעות. התאים נצפו תחת מיקרוסקופ הפוך (Nikon ECLIPSE Ti2, יפן).

בדיקת כדאיות תאים

בדיקת ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, סין) שימשה להערכת כדאיות התא. בקצרה, הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר עם קורא microplate (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, ארצות הברית).

מבחן ייצור תחמוצת החנקן

תחמוצת החנקן (NO) נקבעה על ידי מדידת רמות ניטריט בסופרנטנט של תרבות BV-2 באמצעות ריאגנט Griess. בקצרה, המדיום (100 µl) הועבר לצלחת באר 96- חדשה, אותו נפח של ריאגנט Griess הוסף לכל באר והגיב במשך 15 דקות בחושך. הקליטה ב-540 ננומטר נקבעה על ידי קורא Microplate.

רמות ציטוקינים דלקתיים בסופרנטנט

הריכוזים של TNF-, IL-1 ו-IL-10 בסופרנטנט של תאי BV-2 נקבעו על ידי ערכות ELISA לפי הוראות היצרן.

קביעת מטבוליזם תאי על ידי ניתוח HPLC-Q-TOF-MS

תאי BV{{0}} נזרעו בצלחת עם שש בארים בנפרד (n=6/קבוצה). לאחר הטיפול, המדיום הוסר, והתאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS קר. לאחר מכן הם נחשפו מיד לחנקן נוזלי כדי לדכא את חילוף החומרים בתאים. התאים נקצרו עם 8{{30}} אחוז מתנול קר. כדי להקל על משקעי חלבון, תאים עברו מערבולת נמרצת למשך דקה אחת ועברו צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד (15 דקות, 4◦C). תרחיף התא יובש תחת זרם של חנקן. השאריות המיובשות שוחזרו ב-150 µl של אצטוטריל 25 אחוז מקורר מראש. על מנת להבטיח את היציבות והדיוק של ניתוח הרצף, כל דגימת תא בנפח שווה (10 µl) שולבה כדגימות בקרת איכות. במהלך זיהוי מטבוליטים, דגימות אלו הוזרקו לאחר כל שש דגימות כדי לאשר את יציבותן. מנה של 1-µl הוזרק עבור HPLC-Q-TOF-MS. הניתוח בוצע על מערכת Agilent 1290 HPLC המחוברת ל-Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) ספקטרומטר מסה (Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארצות הברית). ההפרדה בוצעה על עמודה ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 דקות × 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר). השלב הנייד הורכב מ-0.1 אחוז חומצה פורמית-מים (v/v; A) ואצטוניטריל (B). קצב העמית נקבע ל-0.4 מ"ל/דקה עם תנאי השחרור הגרדיאנט האופטימלי הבא: 0 עד 2 דקות, 5 אחוז B; 2 עד 20 דקות, 5 עד 95 אחוז B (מצב יון חיובי); 0 עד 2 דקות, 5 אחוז B; 2 עד 20 דקות, 5 עד 95 אחוז B (מצב יונים שליליים). פרמטרי הפעולה של ספקטרומטר המסה נקבעו כדלקמן: טמפרטורת הגז, 320◦C; גז ייבוש, 10 ליטר לדקה; נבולייזר, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragment, 120 V. הנתונים הגולמיים הופעלו תחת MassHunter Workstation Software גרסה B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארצות הברית). הנתונים הגולמיים עובדו מראש על ידי פלטפורמת XCMS. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח אבחנה חלקי (PLS-DA) של הנתונים המנורמלים בוצעו עם MetaboAnalyst8. בשילוב עם הספרות, המטבוליטים הדיפרנציאליים (VIP > 1, t-test p < 0.05)="" זוהו="" ב-hmdb9.="" לבסוף,="" ניתוח="" מסלול="" נערך="" עם="">

מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריה

פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי (MMP) זוהה באמצעות בדיקה פלורסנטית FL JC-1 (Beyotime, סין) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, תאים מקבוצות שונות נשטפו עם PBS והודגרו בתמיסת צביעה JC-1 למשך 20 דקות ב-37◦C. לאחר הצביעה, התאים נשטפו פעמיים באמצעות חיץ צביעה. לאחר מכן, אותות פלורסנט FL זוהו על ידי ציטומטריה עמיתים (BD Accuri C6).

מדידת אדנוזין מיטוכונדריאלי 50 -טריפוספט

ריכוז אדנוזין 50 -טריפוספט (ATP) במיטוכונדריה זוהה על ידי ערכת בדיקת ATP (Beyotime, סין). בקצרה, מצע התרבות של תאי BV-2 מקבוצות שונות הושלך, והתאים הומוגגו עם חיץ תמוגה על קרח. הסופרנטנט שהושג לאחר צנטריפוגה (12,000 גרם, 5 דקות) שימש לקביעת ריכוז ה-ATP. הארה זוהתה על ידי EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

מדידה של רמת מיני חמצן תגובתי תוך תאי

ערכת בדיקת מיני חמצן תגובתיים (ROS) (Beyotime, סין) שימשה למדידת רמות ROS. התאים מקבוצות שונות הודגרו עם DCFH-DA (10 מיקרומטר) למשך 20 דקות ב-37◦C. לאחר טעינת הבדיקה, התאים נשטפו שלוש פעמים עם DMEM. לאחר מכן, אותות פלורסנט FL זוהו על ידי ציטומטריה עמיתים (BD Accuri C6).

מיקרוסקופיה אלקטרון העברה

תאי BV-2 נזרעו בצלחת עם שש בארים. המדיום הוסר ו-1 מ"ל של 2.5 אחוז גלוטראלדהיד הוסף במהירות לכל באר. לאחר מכן, התאים נאספו ותוקנו עם 2.5 אחוז גלוטראלדהיד חדש ב-4◦C למשך הלילה. לאחר קיבוע, התייבשות והטבעה, התאים נצפו עם מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת HT7800 (Hitachi, טוקיו, יפן).

RNA-Seq וניתוח נתונים ביואינפורמטי

סך RNA מתאי BV-2 הופץ באמצעות ריאגנט Trizol (Vazyme Biotech, סין). כל הדגימות האנליטיות נשלחו ל-Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) לצורך בדיקת רצף ה-RNA. הנתונים נותחו בפלטפורמה המקוונת של Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 שימש לכימות שפע גנים. בעיקרו של דבר, ביטוי דיפרנציאלי

הניתוח בוצע באמצעות DESeq2/DEGseq/EdgeR עם ערך Q קטן או שווה ל-0.05; דרגות עם|log2FC| > 1 וערך Q פחות או שווה ל-0.05 (DESeq2 או EdgeR)/ערך Q פחות או שווה ל-0.001 (DEGseq) נחשבו לגנים מבוטאים שונים באופן משמעותי. בנוסף, בוצעו ניתוחי העשרה תפקודית, כולל GO ו-KEGG, כדי לזהות אילו DEGs הועשרו באופן משמעותי במונחים ובמסלולים של GO ב-p-value מתוקן בונפרוני, פחות או שווה ל-0.05 בהשוואה לרקע ה-hel-transcriptome. נתוני הרצף המקוריים הוגשו למסד הנתונים של NCBI Sequence Read Archive.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת

ה-RNA הכולל של תאי BV-2 נקצר באמצעות RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, סין), ותגובת שעתוק הפוכה בוצעה עם FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, סין). התגובות בוצעו על פי פרוטוקול היצרן. cDNA היה נתון למבחני שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qRT-PCR) עם פריימרים ספציפיים ו-TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, סין). הפריימרים מפורטים בטבלה משלימה 1 ו-actin שימש כבקרה פנימית. שיטת ה-CT 22 1 1 שימשה לניתוח כמותי.

Western Blot Analysis

תאי BV-2 עברו ליטוש באמצעות חיץ תמוגה של RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, סין) המכיל 1 אחוז קוקטייל מעכב פרוטאז (Thermo Fisher) להשגת חלבון כולל. החלבונים הופרדו על ידי 10 אחוז SDS-PAGE והועברו לממברנות NC. לאחר חסימה עם 5 אחוז חלב רזה/BSA, הממברנות הודגרו עם AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF- κB (ABclonal), או GAPDH (ABclonal) נוגדנים ב-5% TBST ב-4◦C למשך הלילה. הממברנות הודגרו עם נוגדן משני מצומד חזרת פרוקסידאז (ABclonal) בטמפרטורת החדר למשך שעה. מצע סופג ECL Western (Tanon, סין), מערכת הדמיית ג'ל (Tanon, סין) ותוכנת ImageJ שימשו להדמיה וכימות.

עגינה מולקולרית

ניתוח עגינה מולקולרית בוצע באמצעות תוכנת Autodock (גרסה 4.2). הזיקה בין ACT לחלבונים נצפתה על ידי תוכנת AutodockTools. מבני החלבון התלת מימדיים (3D) של AMPK (PDB ID: 5g5j) ו-NF-κB (PDB ID: 4q3j) אוחזרו מ-Protein Data Bank12.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית התקן ומנתחים על ידי תוכנת GraphPad Prism (גרסה 8.0.1). ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי ניתוח שונות של שונות (ANOVA), ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. p < 0.05="" נחשב="" מובהק="">

תוצאות

ACT-AD מטרת רשת אינטראקציה וחיזוי נתיבים

באמצעות איחוד מסדי נתונים מרובים, 253 מטרות של ACT נרכשו, בעוד שסך הכל נאספו 1,697 מטרות הקשורות ל-AD. לאחר מיפוי רשת היעד, סך של 70 מטרות נקלטו ברשת אינטראקציית יעד ACT-AD (איור 1A). ניתוח העשרה של KEGG מרמז כי ל-ACT עשויה להיות אפקט רחב טווח ומגוון יעדים (איור 1B). זה גם הציע של-ACT יש מספר מסלולים, נקודות מטרה ואלמנטים בטיפול ב-AD. סווגו את המסלולים הללו כדי לקבל פרשנות מדויקת של המנגנונים. ACT עשוי להיות מתאם בעיקר עם העברת אותות, המערכת האנדוקרינית, המערכת החיסונית וצמיחת תאים ומוות כדי למלא תפקיד עימות נגד AD (איור 1C). ראוי לציין שרובם המכריע של מסלולים אלו קשורים לתגובות דלקתיות. משערים שהפעולה האנטי דלקתית של ACT עשויה להיות חלק בלתי נפרד מתפקידו העימות נגד AD.

ACT הקל על דיסקינזיה ושיפר את תפקוד המערכת הכולינרגית בזחלי דג הזברה AD

כדי לאמת את מודל הרשת, נעשה שימוש במודל AD המושרה על ידי AlCl3- בזחלי דג הזברה כדי להדגים את ההשפעה של ACT. נצפתה תנועת זחלי דג הזברה בתוך מחזורי אור/חושך, ושבילי השחייה שלהם נרשמו (איור 1D). התוצאות הראו ש-ACT הגביר ביעילות את ה-AS ו-1S של דג הזברה, והאפקט הסינרגי גדל עם הגדלת המינונים (איור 1E). DRR ו-RE חשפו השוואה אינטואיטיבית יותר של ACT ו-DPZ (איור 1F). בהתאם לכך, ACT הקל על דיסקינזיה, והפגין השפעות דומות ל-DPZ. מוסכם על כך שלמערכת הכולינרגית תפקיד חשוב בתהליכי למידה וזיכרון. לפיכך, הפעילויות של AChE ו-ChAT שימשו כדי לחשוף את ההשפעה של ACT. חשיפת AlCl3 בדג הזברה בוצעה עם שינוי כולינרגי במוח (איור 1G). היה משמעותי שטיפול ב-ACT דיכא את הפעילות של AChE. בנוסף, הפעילות של ChAT הפגינה ירידה לאחר טיפול ב-ACT. לכן, ACT הראתה השפעה עמוקה על זחלי דג הזברה AD הנגרמת על ידי AlCl3-.

ACT דוכא קיטוב M1 ומקדם קיטוב M2 בתאי BV-2 המושרים על ידי LPS

כדי לאשר עוד יותר את הרשת, ההשפעה האנטי-דלקתית של ACT נחקרה במבחנה באמצעות תאי מיקרוגליה BV-2. לאחר טיפול ב-LPS במשך 24 שעות, הכדאיות של תאי BV-2 ירדה באופן משמעותי. למרבה המזל, ACT הגביר את הכדאיות התא של תאי BV-2 המושרים על ידי LPS (איור 2A). בנוסף, נצפתה המורפולוגיה של תאי BV-2. לאחר 24 שעות של גירוי LPS, זה הראה שתאי BV-2 עברו מצב קיטוב M1. השינויים המורפולוגיים נמנעו על ידי טיפול משותף ב-ACT (איור 2B).

יתרה מכך, התוצאות הצביעו על כך שבניגוד לתאי BV-2 שגוירו על ידי LPS, תאי BV-2 שטופלו יחד עם ACT דיכאו באופן משמעותי את ביטויי TNF-, IL-1 ו-NO (איור 2C) בסופרנטנט של התא. אלו הם ציטוקינים פרו-דלקתיים קלאסיים כאינדיקטורים לקיטוב M1 microglia. בדומה לתוצאות של ELISA, התוצאות של qPCR גילו שביטויי TNF-, nitric oxide synthase (iNOS), IL-1 ו-CD86 mRNA עוכבו באופן משמעותי על ידי טיפול ACT בהשוואה לקבוצת LPS (איור 2D). יתר על כן, מדדנו את רמת הקיטוב של M2 microglia על ידי ELISA (איור 2C) ו-qPCR (איור 2E), והתוצאות הצביעו על כך ש-ACT העלה משמעותית את רמות הביטוי של סמן הקשורות ל-M2 microglia (IL-10, CD206, TGF- ו- ארג-1). במילה אחת, התוצאות הללו הראו זאתפעולהדיכא את קיטוב M1 microglia וקידם את הפנוטיפ M2.

ACT מווסת קיטוב M1/M2 באמצעות עיכוב של נתיב NF-κB

הניתוח התעתיק בוצע על ידי RNA-seq כדי לחקור את המנגנון של ACT בתאי BV-2 ברמה כוללת. PCA המחיש כי ניתן להבחין היטב בין קבוצות הבקרה, ה-LPS וה-ACT (איור 3A). הוא חשף 899 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEG) בין קבוצת הביקורת לקבוצת LPS, ו-49 DEG בין קבוצת LPS לקבוצת ACT (איור 3B). באופן עקבי, GO (איור 3C) וניתוח העשרה של KEGG (איור 3D) חשפו כי ההשפעה של ACT הייתה מעורבת במסלול NF-KB. מערך הגנים הקשור למסלול NF-κB אושר עוד יותר, וההומאוסטזיס שלהם הושפע בהחלט מ-LPS. כצפוי, ACT השפיע באופן משמעותי על הביטויים שלהם (איור 3E). מסלול NF-κB הוא מסלול קלאסי לווסת את התקדמות הדלקת, וכתוצאה מכך בסופו של דבר לשחרור גורמים מעודדי דלקת. כדי לקבל תמיכה מכניסטית, חלבון המפתח של מסלול NF-κB הוערך על ידי Western blot. גירוי LPS הוביל להפעלה של NF-κB, הקשור לקידום קיטוב M1. בהתאם לניתוח RNA-seq, ACT עיכב זרחון NF-KB מגורה של LPS (איור 3F). לכן, ACT יכול להקל על קיטוב M1 המושרה על ידי LPS דרך מסלול NF-κB בתאי BV-2.

ACT הפרעה ביוסינתזה של ארגינין וכן ביוסינתזה של Pantothenate ו-CoA

חיזוי רשת של ACT גילה שהוא קשור למטבוליזם של ארגינין (Arg) ופרולין (איור 1B). RNA seq הוכיח כי המסלולים המושפעים מ-ACT כללו גם ביו-סינתזה של Arg וכן ביו-סינתזה של pantothenate ו-CoA (איור 3D). הוצע כי הפרעות חילוף החומרים של תאי BV-2 המושרה על ידי גירוי LPS קשורות לקיטוב M1 (Orihuela et al., 2016). לפיכך, נעשה שימוש במטבולום תא לא ממוקד על ידי HPLC-Q-TOF-MS כדי לזהות את ההשפעה של ACT על חילוף החומרים של התא. PCA ו-PLS-DA (איור 3G) המחישו שניתן להבחין היטב בין קבוצות הבקרה, ה-LPS וה-ACT על סמך מטבוליטים תוך-תאיים. הרמות של מטבוליטים שונים בתאי BV-2 המושרים על ידי LPS שונו לאחר טיפול ב-ACT (איור 3H). בהשוואה לקבוצת הביקורת, היו 11 מטבוליטים שהשתנו באופן משמעותי בקבוצת ה-LPS (טבלה משלימה 2), בעוד ש-14 מטבוליטים שונו באופן מובהק לאחר הטיפול ב-ACT (טבלה משלימה 3), הכוללים 11 מסלולים מטבוליים (איור 3I). ההשפעה של ACT כללה בעיקר וויסות חילוף החומרים של חומצות אמינו, מטבוליזם של נוקלאוטידים, חילוף חומרים אנרגטי ומטבוליזם של קו-פקטורים וויטמינים. מעניין לציין שהמסלולים המטבוליים שהתקבלו על ידי מטבולום היו עקביים עם חיזוי רשת ו-RNA-seq, כולל ביוסינתזה של Arg וכן ביו-סינתזה של pantothenate ו-CoA. האמור לעיל הראה ש-ACT יכול לווסת את הביוסינתזה של Arg וכן את הביוסינתזה של pantothenate ו-CoA בתאי BV- 2 מעוררי LPS.

פעולהתפקוד מיטוכונדריאלי מופחת של BV-2 המושרה על ידי LPS

המיטוכונדריה הן בליבת המסלולים המטבוליים. עדויות מתפתחות מראות שהמיטוכונדריה הן שחקן מפתח בקיטוב מיקרוגליאלי M1/M2. סקירה כללית של מצב המיטוכונדריה במורפולוגיה ובהפצת תאים נשפטה על ידי TEM. לאחר גירוי LPS, הכרומטין של תאי BV-2 התעבה, והציטופלזמה והמיטוכונדריה ירדו (איור 4A). בנוסף, הקריסטיות המיטוכונדריאליות של קבוצת ה-LPS לא היו מסודרות או אפילו נעלמו, והפגינו קריסטוליזה חלקית, הפחתת גודל ומורפולוגיה עגולה. מעניין לציין שטיפול ב-ACT יכול להקל על שינויים מורפולוגיים המושרים על ידי LPS במיטוכונדריה. לפי תור, בחנו את תפקוד המיטוכונדריה של תאי BV-2 שטופלו ב-LPS, כולל ייצור MMP ו-ATP. ייצור MMP (איור 4B) ו-ATP במיטוכונדריה (איור 4C) השתפרו באופן משמעותי בקבוצת ה-ACT בהשוואה לאלו בקבוצת ה-LPS. חוסר תפקוד מיטוכונדריאלי עשוי להיות קשור לרמה המוגברת של ROS בתא. ניתוח ציטומטריית זרימה גילה כי התוכן של ROS היה עומס יתר בקבוצת ה-LPS (איור 4D). למרבה המזל, ACT חיסל ROS מוגזם. זה מציע ש-ACT עשוי לשחזר את תפקוד המיטוכונדריה על ידי ניקוי ROS.

ACT שיחזר את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ה-Upregulation של PGC-1 ו-UCP-2

קולטן-קו-מפעיל המופעל על ידי פרוקסיזום -1 (PGC-1) ממלא תפקיד חשוב בביוגנזה של המיטוכונדריה (Bi et al., 2019). הגירוי של LPS הפחית את הביטוי של PGC-1, והראה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. למרבה הפלא, ביטוי ה-mRNA של גן PGC-1 וביטוי חלבון הופכים באופן משמעותי על ידי טיפול ACT בתאי BV-2 שטופלו ב-LPS (איור 4E).

חלבון הניתוק המיטוכונדריאלי-2 (UCP-2) היה ידוע גם כוויסות תפקוד המיטוכונדריאלי. כחלבון במורד הזרם של PGC-1, הוא יכול לשלוט על דה-פולריזציה של MMP המושרה על ידי LPS וייצור ROS. דיווחים אחרונים מצביעים על כך שהוא מרכזי בתהליך של הפעלת מיקרוגליה, עם ויסות הפוך של קיטוב M1 ו-M2 (De Simone et al., 2015). תוצאות הכתם המערבי הראו שרמת החלבון UCP-2 ירדה לאחר גירוי LPS. הטיפול המשותף ב-LPS ו-ACT יכול להגביר את הביטוי של UCP-2 בהשוואה לטיפול ב-LPS. גם רמת ביטוי ה-mRNA של UCP-2 הראתה שינויים דומים (איור 4F). לסיכום, ACT שיחזר את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות וויסות מעלה של PGC-1 ו-UCP-2.

ACT מודחק Microglia M1

קיטוב באמצעות הפעלת AMPK

כחיישן מפתח לאנרגיה תאית, חלבון קינאז המופעל על ידי AMP (AMPK) ממלא תפקיד חשוב בשמירה על איזון חילוף החומרים בתא. יחד עם זאת, PGC-1 הוא חלבון במורד הזרם של AMPK. כפי שמוצג בניתוח מודל הרשת,פעולהעשוי לווסת את מסלול AMPK (איור 1B). התוצאות חשפו ש-LPS עיכב את ההפעלה של AMPK, וכתוצאה מכך הפרעות בחילוף החומרים של התא ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה. ראוי לציין כי ACT יכול להגביר באופן תלוי מינון את ביטוי החלבון של p-AMPK (איור 5A). מוצע ש-ACT עשוי להגביר את הביטוי של PGC-1 ולשחזר את תפקוד המיטוכונדריה על ידי הפעלת מסלול האותות AMPK. במחקר זה, כדי לחקור אם ההפעלה של AMPK תרמה להשפעת הוויסות שלפעולהעל קיטוב M1/M2, נעשה שימוש בתרכובת C (CC) כדי לעכב את ההשפעה של AMPK. בניגוד לרמת ה-NO שהוסרה מטה בקבוצת הטיפול ב-ACT, CC חסם חלקית את ההשפעה של ACT על רמת ה-NO (איור 5B). בהתבסס על תוצאות אלו, ACT יכול לווסת את קיטוב M1/M2 של תאי BV-2 על ידי הפעלה של AMPK.

פעולהקשר ל-NF-κB ומעכב אותו כמו גם AMPK מופעל

עגינה מולקולרית הוחלה כדי לאשר אם ACT נקשר לחלבוני NF-κB ו-AMPK. הממצאים הוכיחו כי אנרגיית הקישור שלפעולהו-NF-κB היה -8.4 קק"ל/מול, בעוד שלפעולהוה-AMPK היה -10.8 קק"ל/מול. זיקות משמעותיות אימתו ש-ACT קשור ישירות ל-NF-kB ו-AMPK (איורים 5C, D, F, G). לאחר מכן, אופני הקישור והאינטראקציות האפשריים בתוך כיסי חומצות האמינו נחקרו עוד יותר, כולל 11 שאריות חומצות אמינו של NF-κB (איור 5E) וכן 12 שאריות חומצות אמינו של AMPK (איור 5H). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-ACT עשוי להשפיע ישירות על NF-κB ו-AMPK כדי להחליש את הקיטוב של BV-2 microglia M1 ולקדם את הפנוטיפ M2.