PARTⅠ: השפעות הגנה חדשות של תמצית Cistanche Tubulosa נגד רטינופתיה ניוונית הנגרמת על ידי אור כחול בהירות נמוכה

איש קשר: אודרי הוaudrey.hu@wecistanche.com

מאן-רו וו צ'נג-הוי לין ג'או-דר הוב ג'ורג' הסיאו, יו-ון צ'נג

בית הספר לרוקחות, המכללה לרוקחות, האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טאיפיי, המחלקה לרפואת עיניים, האוניברסיטה הרפואית של טייפה, טאיפיי, המחלקה לפרמקולוגיה, בית הספר לרפואה, המכללה לרפואה, האוניברסיטה הרפואית של טייפה, טאיפיי, המכון לתואר שני למדעי הרפואה, המכללה לרפואה רפואה, האוניברסיטה הרפואית של טייפה, טייפה, Ph.D. תוכנית במחקר ופיתוח ביוטכנולוגיה, המכללה לרוקחות, האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טייפה, טייוואן

תַקצִיר

רקע/מטרות:פוטו-רעילות הנגרמת על ידי דיודה פולטת אור כחול (BLL) ממלאת תפקיד חשוב במחלות עיניים וגורמת לניוון רשתית ולאפופטוזיס בתאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושיים (RPE).תמצית Cistanche tubulosa (CTE)היא רפואה סינית מסורתית עם תכונות הגנה מועילות רבות; עם זאת, מחקרים מעטים בדקו את תפקידי ההגנה על העין של CTE. במחקר זה, חקרנו את המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות של CTE על אפופטוזיס המושרה על ידי BLL in vitro ו-in vivo. שיטות: תאי RPE יושמו במחקר הנוכחי במבחנה, וכדאיות התא נקבעה על ידי 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,{{6} }בדיקת דיפנילטטרזוליום ברומיד. ביטוי חלבון הקשור לאפופטוזיס נקבע על ידי אנליזה של Western blot וצביעת אימונופלוארסצנציה. חולדות נורווגיה חומות שימשו לבחינת חשיפה ל-BLL זמין מסחרית in vivo. צביעת המטוקסילין ואאוזין, תיוג דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז מסוף dUTP nick end (TUNEL) ומבחנים של Western blot שימשו לבחינת דפורמציה מורפולוגית ברשתית. תוצאות: CTE עיכב באופן משמעותי את נזקי RPE הנגרמים על ידי מי חמצן, tertbutyl hydroperoxide, נתרן אזיד ו-BLL. יתר על כן, CTE הפחית את הביטוי של סמנים אפופטוטיים כגון קספאז מפוצל-3 וצביעת TUNEL לאחר חשיפה ל-BLL על ידי ביטול מסלולים אפופטוטיים, כפי שמוצג באמצעות צביעה אימונופלואורסנטית. בנוסף, CTE עיכב את הזרחון המושרה על ידי BLL של c-Jun N-terminal kinase, קינאזות נוספות הקשורות לאותות 1/2 ו-p38 בתאי RPE. In vivo, מתן אוראלי של CTE הציל 60-ימים תקופתיים של חשיפה ל-BLL בעובי הרשתית והפחית את מספר התאים החיוביים ל-TUNEL במודל החולדות החום של נורבגיה. מסקנה: CTE הוא סוכן מניעתי פוטנציאלי נגד פוטו-רעילות הנגרמת על ידי BLL

Cistanche tubulosa

מבוא

מחקרים על ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) דיווחו כי 8.7 אחוזים מאוכלוסיית העולם סובלים ממחלה זו [1]. AMD היא מחלה נוירודגנרטיבית הגורמת לדפורמציה של קולטן פוטו, ניוון פיגמנט אפיתל ברשתית (RPE), אפופטוזיס של תאי גנגליון ואובדן ראייה מרכזי באוכלוסיית הקשישים, והופכת לנטל חברתי עולמי. AMD מסווג לצורה יבשה או רטובה [2, 3]. שיפורים בטכנולוגיה הביאו לכך שאנשים מבלים יותר זמן בשימוש במכשירים דיגיטליים מודרניים, וכתוצאה מכך, אנשים נחשפים לפליטות אור כחול (BL) לאורך תקופות ארוכות. עם זאת, הנושא של פוטו-רעילות הנגרמת על ידי BL ברשתית אינו נחקר היטב. חשיפת יתר ל-BL באורך גל קצר (450-495 ננומטר) גורמת ליצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS), כגון רדיקלי סופראוקסיד והידרוקסיל, הגורמים לעלייה בצריכת החמצן וגורמים נזק ל-DNA המיטוכונדריאלי. הצטברות ROS גורמת לעקה חמצונית ולהצטברות נרחבת של אדדוקטים רטינואידים, הפוגעים ברשתית עוד יותר [4]. מחקרים הראו שלחץ חמצוני הוא גורם מוביל בפתוגנזה של AMD יבש [5]. יתר על כן, הקרנת BL מפחיתה את הביטוי של אנזימים נוגדי חמצון ברשתית, כגון סופראוקסיד דיסמוטאז וקטלאז, על ידי תיווך אינטראקציות חלבון Bax/Bcl-2 וקידום ייצור ROS אנדוגני. ככאלה, תאי RPE והמיטוכונדריה החיצונית של קולטני הפוטו סובלים מפציעה הנגרמת על ידי קרינה BL [6, 7]. בנוסף ליצירת ROS, הקרנת BL מפעילה מיטוגן חלבון קינאז (MAPKs), אשר ממלאים תפקיד חשוב בהישרדות התא ובאפופטוזיס. חלבונים פרו-אפופטוטיים הקשורים לאפופטוזיס הקשורים למיטוכונדריה, כגון Bax ו-caspase-3, מופעלים על ידי הקרנת BL-emitting diode light (BLL) דרך המסלולים c-Jun N-terminal kinase (JNK) ו-p38 ב RPE ותאי גנגליון ברשתית [8]. יתרה מכך, המסלולים האנטי-אוקסידטיביים התלויים ב-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt וגורם גרעיני אריתרואיד 2-תלויים בגורם 2 (Nrf2) הם מרכיבים של מערכת ההגנה של תאי RPE [{{34} }].

תמצית Cistanche tubulosa (CTE)מכיל נגזרות של phenylethanoid glycoside ומשמש כתרופה סינית מסורתית במשך עשרות שנים. Echinacoside, Acteoside ו- Isoacteoside הם שלוש תרכובות פעילות עיקריות של CTE המתאפיינות כבעלי תכונות נוירו-פרוקטטיביות, משפרות זיכרון, מווסתות מערכת החיסון ואנטי פיברוזיס בכבד [13, 14]. Echinacoside הוא סופח ROS ומגן מפני יון 1-מתיל-4-פנילפירידיניום (MPP plus ) המושרה באפופטוזיס במודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון [15, 16]. אקטאוזיד מגן מפני נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי עמילואיד ומפחית דלקת מגורה של ליפופוליסכרידים, המיוחסת לטרנסלוקציה של Nrf2 מהציטופלזמה לגרעין וקשירה לאלמנטים של תגובה נוגדת חמצון. הטיפולים הזמינים הנוכחיים עבור AMD רטוב, כגון pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab ו-aflibercept, משמשים לעיכוב אנגיוגנזה מוגזמת [17, 18]. עם זאת, לא קיימים טיפולים יעילים ל-AMD יבש, בשל הסיבוכים הפתולוגיים המרובים של מחלה זו.

במחקר זה, אנו מדגימים את ההשפעות המגנות של CTE בתאי RPE וחולדות נורווגיה חומות (BN). בנוסף, הפעלנו חשיפה ל-BLL עם בהירות נמוכה ארוכת טווח על מודלים במבחנה וגם על מודלים in vivo כדי להעריך את ההשפעות המגן של CTE. מצאנו ש-CTE הפחית את הביטוי של חלבונים הקשורים לאפופטוזיס לאחר חשיפה ל-BLL. יתרה מכך, CTE הפחית את מספר התאים החיוביים של deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) ברשתית של חולדות BN לאחר חשיפה ארוכת טווח ל-BLL עם בהירות נמוכה. מחקר זה מספק תובנות נוספות לגבי ההשפעות האנטי-אפופטוטיות החדשות של CTE ומידע לגבי אסטרטגיה חדשה לטיפול בניוון רשתית.

תמצית Cistanche tubulosa (CTE): פנילתנואיד גליקוזיד

חומרים ושיטות

כימיקלים ומוצרים

CTE סופקה בנדיבות על ידי Sinphar Pharmaceutical Company (ילאן, טייוואן). ערכות לזיהוי מוות של תאי באתר (מספר קטגוריה 11-684-817-910) נרכשו מ-Roche (מנהיים, גרמניה).

תרבית תאי RPE

תאי RPE (ARPE{{0}} ו-ATCC® CRL-2302™) נרכשו מ-American Type Culture Collection (מנאסס, וירג'יניה) ותופחו במדיום של Dulbecco שונה של Eagle's (Gibco, Grand Island, NY) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי באווירה לחה של 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות. תאי ARPE-19 במעבר 19-30 נשמרו על צלחות תרבית תאים של 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, בלגיה). לאחר מעבר עם 0.05 אחוז חומצה טריפסין-אתילן-דיאמין טטרה-אצטית (Gibco), התאים עברו ציפוי מחדש ביחס של 1:4. לפני הבדיקה, זרעו תאי ARPE-19 על גבי 48-צלחות באר (Orange Scientific) לצורך ניתוח כדאיות תאים בצפיפות של 1.0 ×105 תאים/מ"ל ועל גבי צלחות של 6-ס"מ (Orange Scientific) ) עבור ניתוחי סופג מערביים בצפיפות של 2.0 × 105 תאים/מ"ל למשך 24 שעות. לאחר שתאי ARPE-19 הגיעו ל-80 אחוזים, בוצעו הניסויים הבאים.

טיפול תרופתי ובדיקת כדאיות תאים

תאי RPE במעבר 19-30 זרעו על גבי צלחות באר 48- וטופלו במשך 24 שעות עם ריכוזים שונים של CTE, מי חמצן (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) ונתרן אזיד ( NaN3). לאחר מכן התאים תורבו עם 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) בריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל ​​ודגירה במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסף דימתיל סולפוקסיד (200 μL) לכל באר כדי להמיס את התאים. הספיגה נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מבחני אימונוסורבנט המקושר אנזים ספקטרופוטומטר Sunrise (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). הערכים תוקנו עבור ספיגת הרקע על ידי הפחתת החסר המתאימים. הנתונים הם מחמישה מבחנים עצמאיים.

פרוטוקול חשיפה BL במבחנה

מקור האור ולוחות התא הונחו במרחק של 25 ס"מ זה מזה, כפי שתואר במחקר הקודם שלנו [19]. הבהירות נמדדה באמצעות מד אור (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL הגיע לשיא של 460 ננומטר (60 לוקס) במשך הזמן המצוין (0-48 שעות), בהתאם לתכנון הניסוי.

סופג מערבי

לאחר טיפול משותף של 0–48- שעות עם חשיפה ל-CTE ו-BLL, התאים נשטפו פעמיים עם מי מלח מלוחות פוספט קר כקרח (PBS) והוקפאו מחדש במאגר תמוגה לבדיקת רדיואימוניות (1 אחוז Nonidet) P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM אתילן גליקול-ביס (-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid, 1 mM NaF , וקוקטייל מעכבי פרוטאז/פוספטאז). ה-lysate התא הושג באמצעות צנטריפוגה ב-12, 000 × g למשך 35 דקות, והסופרנטנט נאסף כדי לקבוע את ריכוזי החלבון באמצעות מגיב ברדפורד (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). כמויות שוות של דגימות חלבון הופרדו על ידי אלקטרופורזה של 10-12 אחוז נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל ולאחר מכן הועברו על גבי ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד. לאחר שהממברנה נחסמה עם 5 אחוז חלב נטול שומן והודגרה במי מלח מבוצר Tris עם Tween 20 (TBST) למשך שעה אחת, בוצעה אימונובלוטינג עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לקספאז מפוצל -3, phospho-JNK, JNK , phospho-p38, p38, phospho-extracellular sign-related kinase (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-associated protein with death domain (FADD), caspase-8 (GeneTex, Irvine , קליפורניה), פאס-ליגנד (אבקם, קיימברידג', בריטניה), ו-b-אקטין (סיגמה-אלדריץ', סנט לואיס, מונטריה). הכתמים הודגרו עם נוגדנים משניים מצומדים של צנון פרוקסידאז (1:6000 ב-TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. באמצעות ערכת chemiluminescence משופרת (Millipore, Billerica, MA), עוצמת הרצועות על כל כתם נותחה עם תוכנת Image J לאחר נורמליזציה ל-b-actin.

אימונופלואורסצנטי

תאי RPE נקבעו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות. Triton X-100 ב-PBS (0.2 אחוזים) נוספה לאחר מכן לתאים למשך 15 דקות, ואחריו 5 אחוזים של סרום בקר עוברי ב-PBS למשך 30 דקות; לאחר מכן, התאים הודגרו עם נוגדן קספאז-3 אנטי-מבוקע ביחס של 1:250 למשך 24 שעות (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). נעשה שימוש בנוגדן משני מסוג IgG נגד ארנבות (Dylight 594) ביחס של 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). גרעיני תאים נצבעו ב-4′-6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). שינויים בקרינה נצפו עם מערכת הדמיית מיקרוסקופ ספקטרלית קונפוקלית CS SP5 לייזר (Leica, Teban Gardens, Singapore).

מכתים TUNEL

שברי DNA, שניתן לזהות באמצעות בדיקת TUNEL, הם סימן היכר משמעותי של אפופטוזיס. השתמשנו בערכה לזיהוי מוות של תאים במקום (מספר קטגוריה 11-684-817-910; Roche) למדידת מוות תאי RPE מתוכנת אפופטוטי לפי פרוטוקול היצרן. בקצרה, תיקנו תאי RPE עם 4 אחוז פרפורמלדהיד וסימנו את שברי גדיל ה-DNA בתגובה אנזימטית לזיהוי תאים חיוביים ל-TUNEL, שהוצגו עם כתם פלואורסצנטי ירוק. התאים המוכתמים נסרקו ונותחו עם מערכת הדמיה של רקמות FAXS-plus (TissueGnostics, וינה, אוסטריה). עשרת אלפים אירועים נספרו באזור ה-RPE המגודר, וניתחנו את התמונות למספר התאים החיוביים ל-TUNEL עם תוכנת TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).

ניסויים בבעלי חיים

חולדות BN זכרים (300-350 גרם משקל גוף) נרכשו מהמרכז הלאומי למעבדה לבעלי חיים (טאיפיי, טייוואן) והוחזקו במשך 2-3 חודשים. החולדות נשמרו במחזור של 12-שעות/12-שעות אור/חושך ב-26 ± 1 מעלות, יחס לחות יחסי של 35-47 אחוזים וגישה חופשית למים ולמזון. חולדות לא מטופלות נשמרו בחושך כדי לשמש כבקרות. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של טייפה (מספר אישור: LAC-2016-0442). כל הליכי הניסוי הכוללים שימוש בבעלי חיים עמדו בהצהרות האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר ניסויי עיניים וראייה.

מודל חולדות המושרה על ידי BLL של ניוון רשתית

השתמשנו במודל תקופתי של ניוון רשתית הנגרמת על ידי חשיפה ל-BLL בעל עוצמה נמוכה, כפי שתואר במחקר הקודם שלנו [19]. בקצרה, חולדות BN חולקו לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת, שנשמרה בתנאי חשיכה; קבוצה חשופה ל-BLL, אשר נחשפה ל-BLL תקופתית בחושך ללא הרחבת אישונים (460 ננומטר, 150 לוקס) למשך 3 שעות ביום למשך 60 יום; וקבוצה שטופלה ב-CTE בתוספת BLL, אשר טופלה מראש ב-CTE (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) למשך 14 ימים ולאחר מכן טופלה יחד עם חשיפה תקופתית ל-BLL למשך 3 שעות ביום למשך 60 יום. כל החולדות הוחזרו למושבות החיות ומחזור האור/חושך הרגיל (250 לוקס, 12 שעות/12 שעות) חודש בסוף תקופת הניסוי.

ניתוח סטטיסטי

הבדלים מובהקים חושבו באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות ואחריו מבחן הפוסט הוק של Tukey ומבחן השוואות מרובות. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי ערכי p של<>

מוצרי Cistanche tubulosa

תוצאות

CTE מגן על תאי RPE מפני נזקי עקה חמצונית

כדי להעריך את הציטוטוקסיות של CTE באמצעות מבחן MTT, הוחלו מספר ריכוזים של CTE ({{{{20}}}}-500 ug/mL) על תאי RPE. לטיפול ב-CTE לא היו השפעות רעילות ברורות על כדאיות תאי RPE בכל אחד מהריכוזים שנבדקו (איור 1A). לכן, 50 ו-100 ug/mL CTE שימשו בניסויים הבאים. כדי לחקור את ההשפעות האנטי-אפופטוטיות של CTE, מעוררי חמצון שונים (H2O2, t-BHP ו-NaN3) ניתנו יחד עם CTE לתאי RPE במשך 24 שעות. H2O2, NaN3 ו-t-BHP הפחיתו את כדאיות התא ופגעו בתאי RPE באופן תלוי מינון (פסים חתוכים, איור 1B, 1C ו-1D); כדאיות התא הייתה נמוכה משמעותית בתאים שטופלו ב-0.03 mM H2O2, 0.3 mM NaN3 ו-0.3 mM t-BHP מאשר בקבוצת הביקורת.

עם זאת, טיפול משותף עם 50 ו-100 ug/mL CTE החליש את ה-H2O2-, NaN3-, ו-t-BHP-induced נזק לתאי RPE והפך את הירידה בכדאיות התא (פסים שחורים, איור .1B, 1C ו-1D). הנתונים לעיל מצביעים על כך ש-CTE מציל תאי RPE מנזק של עקה חמצונית.

CTE מעכב מוות של תאי RPE המושרה על ידי BLL

במחקר הקודם שלנו, מצאנו ש-BLL הוא ציטוטוקסי לתאי RPE, דבר שניתן לייחס לשינויים בביטוי של Bcl-2 ו-Bax. במחקר הנוכחי, בחנו עוד את ההשפעות המגנות של CTE על נזק לתאי RPE המושרה על ידי BLL. הנחנו שתי לוחות LED חשמליים כחולים בחממה של תרבית תאים. המרחק בין מקור האור ללוחיות התא היה 25 ס"מ, ועוצמת ה-BLL הייתה 60 לוקס, כפי שנמדד במד אור (איור 2A). בדיקת MTT הוכיחה שחשיפה ל-BLL לפרקי זמן שונים (6-48 שעות) גרמה למוות של תאי RPE באופן תלוי זמן (איור 2B). הפחתות הנגרמות על ידי BLL בכדאיות התא לאחר 24 ו-48 שעות נחלשו באופן משמעותי כאשר התאים טופלו יחד עם CTE (100 ug/mL) (איור 2C). נתונים אלה מצביעים על כך ש-CTE מגן על תאי RPE מפני פוטו-רעילות הנגרמת על ידי BLL.

CTE מעכב אפופטוזיס המושרה על ידי BLL בתאי RPE על ידי ויסות מסלולי Bcl-2/Bax ו-Fas/FasL

על בסיס השפעות ההגנה הפוטנציאליות של CTE בתאי RPE, חקרנו עוד את המעורבות האפשרית של CTE בתהליך זה. שני מסלולי איתות אפופטוטיים נבדקו, כלומר, מסלולי Bax/Bcl{{0}} ו-Fas/Fas ligand (FasL), וחלבונים קשורים (למשל, פרו-קספאז-8 ופרו-קספאז -3; איור 3A ו-3B). נמצא כי חשיפת BILL (6-48 שעות) מגדירה את ביטוי החלבון של Bax/Bcl-2, FasL ו-FADD באופן תלוי זמן (איור 3A). יתרה מכך, BLL הוריד את ביטוי החלבון של procaspase-3 ו-procaspase-8, וכתוצאה מכך צורות מחשוף רבות יותר של caspase-3 ו-caspase-8 לאחר חשיפה ל-BLL, מה שעולה בקנה אחד עם שלנו מחקר קודם [19]. כדי להעריך את ההשפעות המגן של CTE עוד יותר, ריכוזים שונים של CTE יושמו על תאי RPE שנחשפו ל-BLL (איור 3B). לאחר 48-h חשיפת BLL, CTE (50 מיקרוגרם/מ"ל) הפחית את יחס ה-Bax/Bcl-2. יתר על כן, CTE (100 µg/mL) הפחית את ביטוי החלבון של FasL ו-FADD, אך העלה באופן משמעותי את רמות הפרוקספאז-8 והפרוקספאז-3 (איור. 3C ו-3D). מחקרים הראו שהפעלת caspase-3 היא סמן של אפופטוזיס בתאי RPE [20]. כדי לאשר עוד יותר את ההשפעות המגן של CTE, ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של קספאז מפוצל-3. חשיפה ל-BILL במשך 48 שעות נמצאה כגורם לביקוע קספאז-3 וטרנסלוקציה לגרעין, וכתוצאה מכך לאפופטוזיס של תאי RPE (חצים צהובים, איור 4A). עם זאת, כאשר תאים שנחשפו ל-BLL טופלו יחד עם CTE (100 מיקרוגרם/מ"ל), הביטוי המושרה על ידי BLL של קספאז מפוצל -3 עוכב. כדי להבין טוב יותר את ההשפעות האנטי-אפופטוטיות של CTE, השתמשנו בצביעה של TUNEL כדי לזהות שברי DNA בתאי RPE. לאחר חשיפה ל-BLL של 48- שעות, תאים חיוביים ל-TUNEL עלו מ-1.78 ± 0.36 אחוז ל-23.82 ± 0.33 אחוז; השפעה זו נחלשה על ידי טיפול משותף עם CTE (23.82 ± 0.33 אחוז עד 2.22 ± 0.11 אחוז; איור 4B, 4C ו-4D). תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול ב-CTE מגן חזק על תאי RPE מפני אפופטוזיס המושרה על ידי BLL על ידי תיווך מסלולי Bax/Bcl-2 ו-FasL/FADD.

CTE מעכב זרחון המושרה על ידי BLL של חלבוני תגובת לחץ בתאי RPE

מחקרים קודמים הוכיחו שמסלולי MAPK, כגון ERK, JNK ו-p38 MAP, מופעלים בתאי RPE וברשתית לאחר חשיפה לאור אולטרה סגול או BL [21, 22]. לפיכך, כדי לחקור את ההשפעות הרגולטוריות של CTE על מסלול תגובת הלחץ של MAPK לאחר חשיפה ל-BLL, 100 מיקרוגרם/מ"ל CTE הוחלו על תאי RPE בזמני חשיפה שונים ל-BLL (איור 5A). אנליזה של Western blot הצביע על כך ש-ERK, JNK ו-p38 מפוספסים הופעלו בחשיפה ל-BLL, אך עוכבו באופן משמעותי בטיפול משותף עם CTE בתאי RPE (איור 5B). התוצאות לעיל מצביעות על כך ש-CTE מעכב נזק לתאי RPE המושרה על ידי BLL, אשר עשוי להיות קשור לעיכוב של MAPK בתאי RPE.

CTE מציל נזק לרשתית שנגרם על ידי BLL לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח במודל של חולדה

כדי להעריך את ההשפעות המגנות של CTE, חשפנו חולדות BN לחשיפה ארוכת טווח של BLL למשך 60 ימים והערכנו את ההשפעות של CTE. כפי שמוצג בתרשים המוצג באיור 6A, חולדות BN חולקו לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת, קבוצת BLL חשופה וקבוצת CTE פלוס BLL (איור 6A). בקבוצת CTE פלוס BLL, חולדות BN קיבלו תוספת רציפה של CTE (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי מתן דרך הפה פעם ביום במשך 14 ימים לפני החשיפה ל-BLL. ביום 0, חולדות BN טופלו יחד עם CTE (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ונחשפו ל-BLL במשך 3 שעות ביום במשך 60 ימים. לאחר 60 יום של חשיפה ל-BLL, החיות הוקרבו לצורך ניתוח כתם מערבי וצביעה אימונוהיסטוכימיה. בקבוצת CTE פלוס BLL, הביטוי של חלבון procaspase-3 בהומוגניות של עיני חולדה היה גבוה יותר לאחר טיפול ב-CTE מאשר בקבוצת BLL (איור 6B ו-6C). נתונים אלה ממחישים ש-CTE מונע לטווח ארוך פוטוטוקסיות רשתית הנגרמת על ידי BLL באור נמוך בהארה נמוכה ואפופטוזיס על ידי עיכוב ההפעלה של קספאז מפוצל-3. צביעת אימונוהיסטוכימיה סיפקה ראיות נוספות בנוגע להשפעות המגן של CTE על המבנה והמסלולים הפיזיולוגיים של הרשתית (איור 7). יתרה מכך, לאחר חשיפה ל-BLL מצאנו ששכבת הנוירון הפנימית פחתה ונצפתה עיוותים מורפולוגיים בשכבת הנוירון החיצונית (ONL), כולל המקטע הפנימי/מקטע החיצוני ברשתית המרכזית והפריפריאלית, מה שעולה בקנה אחד עם המחקר הקודם שלנו ( איור 7ב). חשוב לציין, CTE מנע דפורמציה של תאי RPE, נזק לתאי עצב ודילול כללי של הרשתית בקבוצת CTE פלוס BLL (איור 7C). יתר על כן, לא צפינו בתאים חיוביים ל-TUNEL ברשתית המרכזית והפריפריאלית של חולדות רגילות (איור 8Ab ו-8Bb). לעומת זאת, לאחר חשיפה ל-BLL במשך 60 יום, תאים חיוביים ל-TUNEL זוהו לעתים קרובות ב-ONL של הרשתית המרכזית והפריפריאלית (איור 8Ae ו-8Be). צביעת DAPI של ה-ONL של הרשתית המרכזית ירדה באופן ניכר בקבוצת BLL (איור 8Ad). עם זאת, הנוכחות של תאים חיוביים ל-TUNEL נחלשה וצביעת DAPI של הרשתית המרכזית והפריפריאלית ONL גדלה בקבוצת CTE פלוס BLL (איור 8Ai ו-8Bi).

מוצרי Cistanche tubulosa

המשך החלק הבא Ⅱ