כיצד אכינאקוסיד מונע את מחלת פרקינסון

איש קשר: emily.li@wecistanche.com

חלק Ⅰ: מנגנון של ויסות אוטופגיה בעכברי PD המושרים על ידי MPTP דרך מסלול האותות של MTOR מאת Echinacoside

תַקצִיר:

מטרה: המחקר הנוכחי נועד לחקור את ההשפעה שלechinacoside(ECH) על אינדיקטורים הקשורים לאוטופגיה דרך מסלול האיתות mTOR, במיוחד ההשפעה על פינוי מצע אוטופגיה P62 ו-synuclein, תוצרי הליבה הפתולוגיים שלמחלת פרקינסון(PD), לספק אסטרטגיות חדשות לטיפול ב-PD (מחלת פרקינסון). שיטות: מודל עכבר של PD תת-חריף(מחלת פרקינסון)הוקמה על ידי הזרקה תוך צפקית של 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP). ראשית, התסמינים הנוירו-התנהגותיים בעכברים מכל קבוצה הוערכו, והנוירוטרנסמיטורים המונואמינים בסטריאטום בכל קבוצה נמדדו עם שלב נוזלי בעל ביצועים גבוהים. צביעה כפולה של אימונופלואורסצנציה אומצה כדי לצפות בביטוי של טירוזין הידרוקסילאז (TH), - synuclein ו-LC3. מיקרוסקופ אלקטרוני ההולכה שימש כדי לצפות בשינויים במבנה האולטרה ב-substantia nigra וביצירת אוטופגוזומים. לאחר מכן, הביטויים של TH, -synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR והחלבון במעלה הזרם AKT זוהו באמצעות Western blot. תוצאות: בהשוואה לקבוצת המודלים, התפקוד הנוירו-התנהגותי השתפר משמעותית ב-ECH (אכינאקוסייד)הקבוצה (P < {0}}.01),="" יחד="" עם="" ביטוי="" מוגבר="" של="" th,="" da="" ו-dopac="" במוח="" (p="">< 0.01).="" בתוך="">ECH (אכינאקוסייד)הקבוצה, בעוד שהביטויים של Beclin 1 ו-LC3-II עלו (P <{2}}.01), רמות הביטוי של P62 ו-synuclein ירדו באופן משמעותי (P <0.01).ECH (אכינאקוסייד)יכול לווסת את רמת הביטוי של אות ההישרדות p-AKT/AKT ולהפחית את הביטוי של mTOR. סיכום:ECH (אכינאקוסייד)יכול להגביר את האוטופגיה על ידי עיכוב הביטוי של mTOR, ובכך לקדם את הפינוי של -synuclein ואת השפלה של מצע האוטופגיה P62 ולהפעיל את ההשפעה הנוירו-פרוקטיבית.

מילות מפתח: מחלת פרקינסון, MPTP,echinacoside, -synuclein, P62, autophagy, mTOR

Cistanche יכול לטפל במחלת פרקינסון

מבוא

מחלת פרקינסון (PD)היא מחלה נוירודגנרטיבית כרונית ומתקדמת. תכונה פתולוגית טיפוסית של PD(מחלת פרקינסון)הוא היווצרות של גופי לוי, ו-synuclein ו-ubiquitin הם המרכיבים העיקריים של גופי לוי. יותר ויותר עדויות מראות שהפרעה בוויסות האוטופגיה מובילה בסופו של דבר להצטברות של חלבונים שלא מקופלים בצורה שגויה ואברונים פצועים.54 מסלול האוטופגיה-ליזוזום יכול לא רק לפרק חלבונים שלא ניתן לפרק על ידי מסלול האוביקוויטין-פרוטאזום אלא גם דרך המסלול. יכול לפרק -סינוקלאין. לכן, ויסות האוטופגיה עשוי לספק אסטרטגיה חדשה לטיפול ב-PD (מחלת פרקינסון). אוטופגיה היא המסלול העיקרי לפירוק של אגרגטים תוך תאיים, ו-mTOR קינאז הוא אתר רגולטורי מרכזי לאוטופגיה. לכן, יש משמעות תיאורטית ומעשית להבהיר את הקשר בין PD(מחלת פרקינסון) ואוטופגיה מווסתת על ידי מסלול האיתות mTOR. מאחר שהפירוק של -synuclein תלוי בעיקר במערכת האוטופגיה-ליזוזומלית עם סילוק החלבונים החריגים כמטרה, פיתוח של תרופות נוירו-פרוטקטיביות המסוגלות לווסת אוטופגיה עשויה לספק הנחיות לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות. ECH (אכינאקוסייד) יש נוסחה מולקולרית של C35 H46 O20. זהו המרכיב העיקרי של הרפואה הסינית Cistanche phenylethanoid גליקוזידים. הוא בודד לראשונה על ידי Stoll וחב' משורש ה-אכינצאהאנגסטיפוליה DC.ECH (אכינאקוסייד)יש מגוון רחב של השפעות פרמקולוגיות. יש לו אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון, הגנה על עצבים, שיפור למידה וזיכרון, הגנה על הכבד, ויסות חיסוני והשפעות אנטי גידוליות. המחקר הנוכחי, החל ממנגנוני הליבה הפתולוגיים של PD(מחלת פרקינסון), שמטרתו לחקור את הרגולציה של ההשפעות הנוירו-פרוקטטיביות שלECH (אכינאקוסייד)ב-PD של עכבר(מחלת פרקינסון)מודל המושרה על ידי MPTP מהמסלול האוטופגיה-ליזוזומלי.

חומרים ומכשור

חיית ניסוי

קבוצת הניסוי כללה 108 עכברים זכרים C57BL/6J עם דרגת SPF, בני שמונה שבועות, במשקל 20-22 גרם, ארבעה עכברים לכל כלוב, נשמרים ב-22-25 מעלות. העכברים סופקו על ידי מרכז שנחאי לחיות מעבדה, האקדמיה הסינית למדעים, השוכנת באוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית, ובעלי חיים קיבלו טיפול אנושי על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות, בחדר כיתה SPF עם טמפרטורה של 22- 25 מעלות, לחות יחסית של 55 אחוז, ותחת 12-המקצב הצירקדי של השעה. העכברים היו חופשיים לקבל מזון ומים.

ריאגנטים עיקריים

MPTP (Sigma Company), נוגדן חד שבטי עכברים אנטי-TH (Sigma Company), Alexa Fluor 555 anti-rabbit anti-body (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 anti-arb antibody (Biyuntian Institute of Biotechnology), HRP -נוגדן משני לעז נגד ארנב (Biyuntian Institute of Biotechnology), ארנב polyclonal - נוגדן סינקליין (Cell Signaling Technology Company), נוגדן משני HRP-עז נגד עכברים (Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(אכינאקוסייד) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), נוגדן אנטי-p-AKT (Ser473) ארנב (Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), ארנב פוליקלונלי נוגדן LC3 (חברת Abcam), נוגדן P62 פולישבטי ארנב (Enzo Life Science Company), נוגדן חד שבטי -אקטין עכברים (חברת סנטה קרוז), נוגדן רב שבטי של Beclin 1 (חברת אבקם).

מידע על החומרים:

MPTP (אמריקה, חברת סיגמא), נוגדן חד-שבטי עכברים אנטי-TH (אמריקה, חברת סיגמא), נוגדן פוליקלונלי-סינוקלאין לארנבים (אמריקה, חברת טכנולוגיית ה-Cell Signaling Technology), נוגדן משני HRP-עז נגד עכברים (סין, Biyuntian Institute of Biotechnology ),ECH(אכינאקוסייד) (סין, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), נוגדן אנטי-p-AKT ארנב (Ser473) (אמריקה, Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (אמריקה, Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (America, Sigma Company), וורטמנין (אמריקה, חברת סיגמא), נוגדן LC3 פולישבטי לארנבים (אמריקה, חברת אבקם), נוגדן P62 פולישבטי לארנבת (אמריקה, אנזו Life Science Company), נוגדן חד שבטי עכברים - נוגדן אקטין (אמריקה, חברת סנטה קרוז), נוגדן רב שבטי של Beclin 1 ( אמריקה, חברת אבקם).

טיפול Echinacosideמחלת פרקינסון

שיטות ניסוי

קיבוץ חיות ניסוי

108 עכברי C57BL/6J חולקו באופן אקראי לשש קבוצות, עם 18 עכברים בכל קבוצה. הפרטים היו כדלקמן: קבוצת הביקורת הרגילה (קבוצת המלח הרגילה, קבוצת N), קבוצת המודל (קבוצת MPTP, קבוצת M),ECH(אכינאקוסייד) קבוצה (MPTP פלוסECH (אכינאקוסייד), קבוצת EH), קבוצת האוטופגיה המושרה (MPTP פלוס Rapamycin, קבוצת RA), קבוצת מעכבי האוטופגיה A (MPTP plusECH (אכינאקוסייד)פלוס קבוצת כלורוקין, קבוצת CQ), קבוצת מעכבי האוטופגיה B (MPTP plusECH (אכינאקוסייד)פלוס קבוצת וורטמנין, קבוצת WO). המינון של MPTP היה 30mg/kg/d, הוזרק ברציפות למשך 7 ימים.ECH (אכינאקוסייד) ניתנה במינון של 30 מ"ג/ק"ג/ד, במתן תוך קיבה.9

דוגמנות של חיות ניסוי ותרופות

קבוצת N וקבוצת EH קיבלו תמיסת מלח רגילה וECH(אכינאקוסייד) שלושה ימים לפני הדוגמנות, בהתאמה, עד שבעה ימים לאחר הדוגמנות. Rapamycin,10 wortmannin,11 וכלורוקין ניתנו במשך שבעה ימים רצופים לאחר ההזרקה האחרונה של MPTP. המינון של הזרקת rapamycin לווריד הזנב חושב כ-2mg/kg/d. המינון של הזרקה תוך צפקית של כלורוקין בעכברים היה 50 מ"ג/ק"ג/יום. המינון של הזרקת וורטמנין לווריד הזנב בעכברים היה 0.7 מ"ג/ק"ג/ד (איור משלים 1).

התצפיות הנוירו-התנהגותיות

על פי הספרות,12 בשינוי מינורי, המכשיר מתוצרת עצמית לבדיקת המוט היה כדלקמן: המכשיר היה צינור PV באורך 55 ס"מ, בקוטר 1 ס"מ, בקוטר של 2 ס"מ הקרנה כדורית בחלק העליון של מכשיר כנקודת חיבור לעכברים. המכשיר היה מכוסה בסרט שחור כדי למנוע את נפילת העכברים. כל עכבר הונח על הנקודה הבולטת הכדורית עם ראשו כלפי מעלה במהלך הבדיקה. נרשמו משך הזמן מהחלק העליון של המוט המוצב ועד לראש להסתובב למטה (T-turn) והזמן הכולל מהחלק העליון של המוצב המוצב לטיפוס לתחתית הצינור לנחיתה (T-total).

הפעילות הספונטנית

פעילות ספונטנית, הידועה גם בשם פעילות השדה הפתוח, היא אינדיקטור נפוץ לזיהוי הפעילות הנדירה לאחר פגיעה ב-MPTP.13 במחקר הנוכחי, אומצה מערכת ניתוח וידאו לניסוי שדה פתוח. הפעולות הספציפיות היו כדלקמן: לפני הניסוי, ארבעה עכברים מאותה קבוצה הוכנסו לקופסת תצפית (באורך של 25 ס"מ, רוחב של 25 ס"מ וגובה של

25 ס"מ) להסתגלות למשך 30 דקות. לאחר מכן הם הוקלטו בווידיאו ברציפות במשך 30 דקות. בחלון זמן התצפית של 30-דקות, מספר התנועות האנכיות (מספר גידול) נספר בנפרד בשלושה מרווחים לא רציפים של חמש דקות. מערכת ניתוח הווידאו ניתחה אוטומטית את מסלול הפעילות של העכבר וקיבלה מרחק כולל של 30-דקות (Total Distance) כאינדיקטור לתנועה אופקית.

ניתוח ההליכה

ניתוח הליכה: על פי הספרות,14 נעשה שימוש במכשיר לניתוח הליכה מתוצרת עצמית. מכשיר זה היה כדלקמן: שביל עץ (באורך של 42 ס"מ, רוחב של

4.5 ס"מ וגובה 12 ס"מ), קצה אחד היה פתוח, הקצה השני הוביל לכלוב הסנאי. כלוב הסנאי היה מכוסה בבד שחור. דיו כחול טבל בתחתית רגלי העכבר. לאחר מכן הונח העכבר על הקצה הפתוח של השביל. העכבר עבר באופן טבעי לקצה כלוב הסנאי שהיה מכוסה בבד שחור. שלושת הצעדים הארוכים ביותר בגפיים הקדמיות והאחוריות נמדדו בהתאמה, והערכים הממוצעים נלקחו.

מבחן רוטרוד

העכבר הונח על רוטרוד בעל מהירות משתנה, כאשר מהירות הרוטרוד מותאמת לעלייה מארבעה סיבובים/דקה ל-40 סיבובים/דקה תוך חמש דקות. הזמן מתחילת סיבוב ה-rotarod ועד לצניחה של העכבר מה-rotarod בכל פעם נרשם כחביון לנפילה. קביעת התוכן של מונואמין נוירוטרנסמיטורים בסטריאטום על ידי זיהוי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC-ECD)

דגימה וטיפול

העכברים הורדמו, והסטריאטום הופרד במהירות על קרח ונשקל. לפי היחס של 1 מ"ל של חומצה פרכלורית 5 אחוז ל-0.1 גרם של המוח (משקל רטוב), הדגימות של כל קבוצה הוכנסו לכוס המכילה את הנפח המתאים של חומצה פרכלורית והומוגגו בשפופרת תמיסה. . ההומוגנט עבר צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה עם 13,000 סל"ד לדקה למשך 20 דקות. הסופרנטנט נלקח, והצנטריפוגה חזרה על עצמה. הסופרנטנט הוכנס למקרר בטמפרטורה נמוכה לגילוי נוסף. התנאים עבור HPLC-ECD היו כדלקמן. הכרומטוגרפיה האלקטרוכימית של Couloehemlll 5300 אומצה. אמצעי הזיהוי היו תאים של 5020 ו-504 פאונד, עם העמודה הכרומטוגרפית של MD-150 (3.0*150 מ"מ; 3 אום), השלב הנייד של MDTM-2 והרגישות של 2uA. קצב הזרימה נקבע ל-0.6 מ"ל/דקה, הפוטנציאל של האלקטרודה נקבע ל-220mV, וטמפרטורת העמודה נקבעה ל-30 מעלות. נפח ההזרקה היה 20 ul (מדולל תחילה עשר פעמים).

התוכן של הנוירוטרנסמיטורים הבאים זוהה דופמין (DA), חומצה דיהידרוקסיפנילאצטית (DOPAC), חומצה ונילית גבוהה (HVA), נוראפינפרין (NE), {{0}}Hydroxytryptamine (5-HT), 5-Hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA). הצביעה האימונופלואורסצנטית של TH, -Synuclein, LC3 ו-p62 העכברים (n=6 לכל קבוצה) הורדמו בהרדמה עמוקה (5 אחוזים כלורליים) וזלפו עם 0.9 אחוז נתרן כלוריד, ואחריו 4 אחוז פרפורמלדהיד דרך חדר הלב השמאלי. מוחות הוסרו במהירות והוסרו לאחר קיבוע למשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו ל-PBS המכיל 30 אחוז סוכרוז ב-4 מעלות צלזיוס עד שהם שקעו. רקמה הוטבעה בפרפין, וחתכים קורונאליים (30 מיקרומטר) נחתכו דרך ה-substantia nigra pars compacta (SNc; −2.8 עד −3.8 מ"מ זנב לברגמה) באמצעות מיקרוטום של מזחלת. הקטעים עברו שחרור משעווה והוסרו לחות, והפרוקסידאז האנדוגני הופסק עם 0.3 אחוז H2O2 למשך 30 דקות. לאחר שליפת אנטיגן המושרה בחום, השקופיות הודגרו עם 0.5 אחוז Triton-X100 ולאחר מכן 5 אחוז אלבומין בסרום בקר למשך 30 דקות כל אחת. לאחר מכן הדגירה המקטעים עם נוגדן אנטי- -סינוקלאין, נוגדן אנטי-TH, נוגדן אנטי-LC3, נוגדן אנטי-p62, והנוגדנים המשניים הפלורסנטים המתאימים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש כביסה של חמש דקות ב-PBS , החתכים הודגרו בנוגדנים משני ביוטיניל למשך שעה אחת, ולאחר מכן קומפלקס אבידין-ביוטין למשך 30 דקות. פעילות פרוקסידאז הוצגה עם 3.3-דיאמינובנזידין.

הגילוישל חלבון מאת Western Blot

חלבון SNc הוצא (n {{0}} עכברים לקבוצה), הופרד באמצעות 12-15 אחוז SDS-PAGE, והועבר לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם חלב 5 אחוז ללא שומן למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר והודגרו עם נוגדנים נגד TH, synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR ו-GAPDH ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. . למחרת, הממברנות נשטפו עם תמיסת מלח טריס שהכילה 0.1 אחוז Tween 20 והכלאה עם נוגדנים משניים מתאימים למשך 1.5 שעות. חלבונים הוצגו באמצעות כימילומינסנציה משופרת, ורצועות אימונטיביות נותחו בעזרת תוכנת ניתוח תמונה (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA) כדי לחשב את הצפיפות האופטית של פסי-synuclein ו-TH המנורמלים ל-GADPH.

מידע על נוגדנים: נוגדן LC3 polyclonal ארנב: 1:1000. נוגדן P62 polyclonal ארנב: 1:1000. נוגדן פוליקלונאלי של Beclin 1: 1:1000. עכברים נוגדנים חד-שבטיים נגד TH: 1:1000. נוגדן polyclonal -synuclein של ארנב: 1:1000.

תצפית על המבנה האולטרה של ה-Substantia Nigra על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני הולכה

עכברים (n=6 לכל קבוצה) הורדמו עם 5 אחוז כלור הידרט וזרפו דרך החדר השמאלי עם PBS קר כקרח, ואחריו 4 אחוז פרפורמלדהיד ו-1 אחוז גלוטאראלדהיד ב-PBS. מוחות הוסרו וקובעו לאחר מכן ב-2.5 אחוז גלוטראלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. ה-SNc נחתך לגושים של כ-1 מ"מ וקיבוע ב-PBS המכיל 2.5 אחוז גלוטראלדהיד ונשמר ב-4 מעלות צלזיוס לעיבוד נוסף. הפרגמנטים היו מקובעים לאחר 1 אחוז אוסמיום טטרוקסיד באותו חיץ, התייבשו באמצעות אלכוהול מדורג, והוטמעו ב-Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX). קטעים דקים במיוחד (50 ננומטר) נחתכו באמצעות אולטרה-מיקרוטום, נצבעו באמצעות אורניל אצטט וציטראט עופרת, ונותחו תחת מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת (Leica TCS SP2CLSM, מרכז האלקטרונים של בית הספר לרפואה, אוניברסיטת פודן).

ניתוח סטטיסטי

כל נתוני המדידה במחקר הנוכחי באו לידי ביטוי בצורה של אמצעים ± שגיאות סטנדרטיות, והניתוח הסטטיסטי עובד על ידי תוכנת GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). פ<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

לחץ כאן לחלק Ⅱ