חלק 5:מיפוי יחסי הגומלין האפיגנומיים והתעתיקיים במהלך היווצרות הזיכרון והיזכרותו באנסמבל ההיפוקמפוס אנגרם
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
נתונים מורחבים איור 2: DARs יציבים מועשרים בעיקר עבור משפרי סימנים
(א) זרימת עבודה לניתוח ציטומטריית זרימה של האוכלוסיות העצביות השונות מההיפוקמפוס, במהלךזכרוןהיווצרות ושליפה. תוכניות FACS מייצגות המציגות ביטוי של כל האוכלוסייה (לוח שמאלי). בחירה נוספת נעשתה על גרעינים בודדים ואוכלוסיית NeuN+/DAPI+ (לוח אמצעי). לבסוף, הבחירה נעשתה על תת-האוכלוסייה המגודרת; GFP+ (מותאם לכ-2.5% מכל התאים), ARC+/GFP+ (כ-0.15% מכל התאים) וגרעינים מוינו ל-1.5 מ"ל צינורות אפנדורף מצופים ב-200ul של 1% PBS.
לחץ אלאבקת תמצית ציסטנצ'ה משפרת את הזיכרון
(ב) דיאגרמת Venn (משמאל) וטבלה (מימין), ממחישות את החפיפה בין ה- DARs שזוהו בהשוואות הזוגיות השונות במהלךזכרוןהיווצרות והיזכרות.
(ג) ניתוח סטטיסטי מבוסס דגימה מחדש בוצע כדי לקבוע אם ההעשרות של מצבי כרומטין על פני פליטות ChromHMM (שנצפו) הן מובהקות סטטיסטית. ההעשרה הצפויה חושבה על ידי ביצוע 10,000 קבוצות אקראיות של חפיפה (תמורות) בין 'כל האתרים הנגישים' לבין 'כל אתרי השינויים של היסטון (כלומר כל הפליטות)' והוצגה כהיסטוגרמה באיור. גודל מדגם של כל קבוצה אקראית נקבע על ידי גודל ה- DARs מכל מצב. הממוצע וסטיית התקן של המדגם חושבו (טבלה משלימה 3). מספר החפיפות שנצפו בין DARs לבין כל פליטה חושב והוצג כקווים. ציון z חושב כ-fallows; Z = (ערכים נצפים (X) – ממוצע המדגם (μ)))/(סטיית תקן של המדגם (σ)). z-ניקוד בזל לעומת מוקדם; S.E 10.5, W.E 6.9. יציב; S.E 16.9, W.E 12.7, כל p< 0.0001,="" z-score="" early="" vs.="" late;="" s.p="" 91.7,="" w.p="" 38.7.="" late="" vs.="" reactivated;="" s.p="" 26.8,="" w.p="" 28.9,="" all=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">
(ד) תרשים עוגה מציג את אחוז המדינות המשפרות השונות, עבור כל האזורים היציבים. החפיפה של כל אזור יציב בוצעה עם נתוני H3K4me1 ו- H3K27ac ChIP-seq שפורסמו בעבר, שהתקבלו 1h לאחר FS21. מצבי משפרים סווגו כ'ראשוניים' – חפיפה עם אזורים המסומנים ב-H3K4me1 בלבד, 'פעילים' – עם H3K4me1/ H3K27ac או 'סמוי' – ללא חפיפה.
(ה) מוטיבים שזוהו מאזורים נטולי נוקלאוזומים (NFR) על מסלולי ATAC-seq מכל מדינה (בסיסי, מופעל -מוקדם, מופעל -מאוחר ומופעל מחדש). הפסגות חולקו לעמדות שהובאו למקדמים (5kb מ-TSS) ולמשפרים (>5kb מ-TSS). גודל העיגול מציין את אחוז ההעשרה (1-50%). צבע מציין -log (ערך P).
נתונים מורחבים איור 3: טיהור מתואם של המצב האפיגנטי במהלךזכרוןקידוד ו
(א) המאפיינים של אינטראקציות שזוהו בשיקגו בכל שלב (בסיסי, מופעל -מוקדם, מופעל -מאוחר, ומופעל מחדש). הגדרות ברירת המחדל וסף ניקוד של 5 שימשו בשיחות אינטראקציה משמעותיות, שבוצעו במשותף בכל המשכפלים.
(ב) תרשים עוגה מייצג את האחוז של כל האינטראקציות שזוהו בשיקגו המסומנות על ידי H3K27ac/H3K4me1 (67.5% ציוני משפרים), H3K4me3/H3K9ac (46.2% סימון מקדמים), או H3K27me3 (1.1% סימני דיכוי).
(ג) תמונת דפדפן WashU epigenome, המקיפה אזור של כ-500 Kb סביב הגנים Eif4e2. קשתות מציגות משפרים נפוצים משמעותיים (מלבן אדום) ומשפרים ייחודיים (חצים) המקיימים אינטראקציה עם מקדמים (מלבן כחול).
(ד) דוגמאות לאינטראקציות שנקראו על ידי שיקגו. עלילות המציגות את כל ספירות הקריאה מתוך פיתיון-אחר-קצה (משפר), בטווח של 500-700 קילובייט (במעלה הזרם ובמורד הזרם) של מקדמי Grink3 ו-Wwc2. אינטראקציות משמעותיות שזוהו על ידי שיקגו (ציון ≥5) מוצגות באינטראקציות אדומות ותת-סף (3 ≤ ניקוד< 5)="" are="" shown="" in="" blue.="" grey="" lines="" show="" expected="" counts="" and="" dashed="" lines="" the="" upper="" bound="" of="" the="" 95="" %="" confidence="" intervals.="" (e)="" overlap="" enrichment="" analysis="" between="" interacting="" enhancers="" and="" dars,="" using="" a="" permutation="" procedure="" on="" 10,000="" randomized="" sets="" of="" accessible="" sites.="" the="" histogram="" presents="" random="" sampling="" distribution="" of="" accessible="" sites="" for="" each="" condition="" (basal="" vs.="" activated="" -="" early,="" activated="" -early="" vs.="" activated="" -late,="" activated="" -late="" vs.="" reactivated,="" stable).="" the="" number="" of="" overlapped="" loci="" is="" presented="" in="" colored="" lines="" from="" basal,="" activated="" -early,="" activated="" -late,="" and="" reactivated="" neurons.="" dars="" of="" bas="" vs.="" activated="" -early="" (z-score;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" dars="" of="" activated="" -early="" vs.="" activated="" -late="" (z-score;="" −0.1,="" −0.8,="" −2.4,="" −3.2).="" dars="" of="" activated="" -late="" vs.="" reactivated="" (0.4,="" 1.8,="" 0.4,="" −0.2).="" dars="" of="" stable="" (z-score;="" 1.7,="" 2.0,="" 6.5,="">
נתונים מורחבים איור 4: שינויי כרומטין המתרחשים במהלך השלב המוקדם מאפשרים
(א) ניתוח חפיפה בין שמות גנים מהניתוח הדיפרנציאלי הזוגי ונתונים שפורסמו בעבר של i) תאי גרגיר DG מופעלים 1 שעה לאחר חשיפה חדשה32 ii) 24 שעות לאחר FS20 ו- iii) לאחר גירוי ממושך (6 שעות) של נוירונים קליפתיים בתרבית עכברים עם KCl33. הניתוח בוצע על ידי חבילת GeneOverlap R.
(ב) קריאות אקסוניות (אדומות) ואינטרוניות (כחולות) כומתו בנפרד בכל התנאים והושוו לפעילות שעתוק כפי שנמדדה על ידי DEseq2. הקריאות נורמלו (RPKM) ושינויי log2FC מוצגים עבור כל מצב. עלילת הכינור מציינת את הממוצע,
טווח interquartile, ואת המינימום ואת המקסימום, חד כיווני ANOVA (פרמטרי, לא מזווג), בזלת לעומת מוקדם; F (5, 248) = 389.9. מוקדם לעומת מאוחר; F (5, 2374) = 2183. מאוחר לעומת הפעלה מחדש. F (5, 1357) = 945.5, כל Ps< 0.0001.="" bonferroni’s="" multiple="" comparisons.="" n.s="non-significant," ***p=""><>
(ג) יחסי אקסון/אינטרון נמדדו בכל אשכול בכל התנאים (סולם Log2FC). עלילת הכינור מציינת את הממוצע, הטווח הבין-קווי ואת המינימום והמקסימום, ANOVA חד-כיווני (פרמטרי, לא מזווג), F (5, 1143) = 260.2, P<0.0001. bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p=""><>
(ד) ניתוח חפיפה בין DARs ל-DEGs במהלך ניתוחים שוניםזכרוןשלבים. DARs על אזורים אינטרגניים ואינטרונים מופו לגנים המתאימים להם באמצעות מפות האינטראקציה pc-HiC. ניתוח החפיפה בוצע על ידי חבילת GeneOverlap R. ערך P (מספרים) ויחס סיכויים (צבע) מהבדיקה המדויקת של פישר מוצגים במפת החום. n.s – לא משמעותי.
(ה) מתאם פירסון בין ערכי log2FC שלDARs לבין LOG2FC DEGs שהיו מבוארים לאזור זה (אזורים בין-גניים מופו באמצעות ערכת הנתונים pc-HiC). שינויי הנגישות של הכרומטין הושוו עם קריאות אקסוניות מנותחות (קו אדום), קריאות אינטרוניות (קווים כחולים) ושינויים תעתיקיים כוללים (הן בקריאה אינטרונית והן בקריאות אקסוניות) כפי שנמדדו על ידי Desq2 (קו אפור). כל ערכי r ו-p מדווחים בטבלה משלימה 9.
נתונים מורחבים איור 5: שינויי שעתוק בתאי העצב המופעלים-מאוחרים מתואמים גבוה יותר
(a) קריאות אקסוניות (אדומות) ואינטרוניות (כחולות) כומתו בנפרד בכל התנאים של כל אחד מהאשכולות שזוהו באיור 5B. הקריאות נורמלו (RPKM) ושינויי log2FC מוצגים עבור כל אשכול.
(ב) יחסי אקסון/אינטרון נמדדו בכל צביר על פני כל התנאים. תרשים כינור מציין את הממוצע, טווח interquartile ואת המינימום ואת המקסימום, n = 3 דגימות עצמאיות ביולוגית ANOVA חד כיוונית (פרמטרי, לא מזווג), Dw - צביר מאוחר; פ (3, 968)
652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p=""><>
מורחב נתונים תאנה. 6: ברורים באופן זמני תמלול תוכניות הם להיות מסונכרן ל
באופן תלוי בנוכחות טמוקסיפן. בחלונית הימנית, תמונות IHC מייצגות של ה- DG. ירוק – AAV-eYFP, אדום – קשת אנדוגנית. סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר.
(ב) הערכה מורפולוגית של קוצים במהלך שונותזכרוןשלבים. הפאנל הימני מציג פיר דנדריטי eYFP+ יחיד עם סוגים שונים של קוצים (סטובי, רזה, פטריות, פטריות, פטריות מוגדלות). סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. boxplot מציין את הממוצע, טווח interquartile ואת המינימום ואת המקסימום, מופעל -מוקדם: n = 4 עכברים /5 סעיף לכל חיה, מופעל -מאוחר: n = 4 עכברים /4 סעיף לכל חיה, מופעל מחדש: n = 4 עכברים /2 סעיף לכל חיה. ANOVA חד כיוונית (פרמטרית, לא מזווגת), סטובי; F (2, 36) = 2.313, P=0.1135. רזה; F (2, 36) = 35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="">< 0.0001.="" bonferroni’s="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p=""><>
(ג) תמונות IHC מייצגות וכימות של רמות החלבון של בני משפחת EIF; (משמאל) Eif2a ו (מימין) Eif3e. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. נתונים עבור פיר דנדריטי מוצגים כיחס בין המספר לבין האורך (μM). n = 4 עכברים /5 סעיף לכל חיה, boxplot מציין את הממוצע, טווח interquartile ואת המינימום והמקסימום, חד כיווני ANOVA (פרמטרי, לא מזווג) עם מבחן ההשוואות המרובות של Bonferroni, n.s - לא משמעותי, Eif2a Shaft; F (2, 20) = 4.484, P = 0.0246. סומה; F (2, 21) = 19.58, P< 0.0001.="" (activated="" -early="" vs.="" activated="" -late="" *p="0.0142," activated="" -early="" vs.="" reactivated="" *p="">< 0.0001,="" activated="" -late="" vs.="" reactivated="" *p="0.0303)." eif3e="" shaft;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (activated="" -early="" vs.="" reactivated="" *p="0.0057," activated="" -late="" vs.="" reactivated="" *p="">
(ד) תרשים העוגה מציג את אחוז עמודי השדרה של הפטריות המוגדלות (Dh ≥ 3Dn) ואת עמודי השדרה של הפטריות מתאי עצב מופעלים-מאוחרים וממוחזרים מחדש.
(ה) תמונות מייצגות (פאנל שמאלי) וכימות (לוח ימני) של רמות ה-mRNA של Gria1, במהלך שלבים שונים שלזכרון. הנתונים מוצגים כיחס בין מספר פונקטה לבין אורך הפיר הדנדריטי. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. N = 4 עכברים /5 סעיף לכל חיה, boxplot מציין את הממוצע, טווח interquartile ואת המינימום ואת המקסימום, פיר; ANOVA חד-כיווני (פרמטרי, לא מזווג) F (2, 15) = 10.41, P = 0.0015. מבחן ההשוואות המרובות של בונפרוני, **P = 0.0011. לוח תחתון - סומה; ANOVA F חד כיווני (2, 12) = 0.13, P = 0.88.
נתונים מורחבים איור 7: אינטראקציות עם משפרים קומבינטוריים מובהקים מובילות לכיווני
(א) דיאגרמות Venn מציגות את אחוז החפיפה בין נגישות הכרומטין (DARs) בכלזכרוןשלבים (BAS לעומת מעגל רשת מופעל -מוקדם, ירוק בהיר; מופעל -מוקדם לעומת מופעל -מאוחר, עיגול רשת ירוק כהה; מופעל -מאוחר לעומת מופעל מחדש, מעגל רשת כתום) ושינויי שעתוק כוללים מכל האשכולות המזוהים (Dw -מאוחר, למעלה -מאוחר, למעלה -מאוחר, יציב, הפעלה מחדש, מעגל רשת כחול). DARs אינטרגניים ואינטרונים מופו לגנים שלהם באמצעות מפות האינטראקציה pc-HiC. אחוז החפיפה חושב מכל ה- DEGs שזוהו באשכולות (n = 1095).
(ב) ניתוח חפיפה בין DARs (זוגיים) לבין DEGs מכל אשכול. DARs אינטרגניים ואינטרונים מופו לגנים שלהם באמצעות מפות האינטראקציה pc-HiC.
ניתוח החפיפה בוצע על ידי חבילת GeneOverlap R. ערכי P וערכי ז'קארד (צבע) מהבדיקה המדויקת של פישר מוצגים במפת החום (משמאל). אחוז החפיפה חושב מכל ה-DEGs שזוהו באשכולות (מימין).
(ג) תמונה מייצגת של כרומטין ושינויי שעתוק של לוקוס Gabrb3 מהאשכול Dw-late. בעוד שאינטראקציות מצב מוקדמות היו בין מקדם למשפרים עם מפעילי שעתוק (Ap1), אינטראקציות מאוחרות של מצבים היו עם מדכאי שעתוק (Slug). רצועות דפדפן גנום IGV עליונות (סגול - בזאלי, ירוק בהיר - מופעל - מוקדם, ירוק כהה - מופעל - מאוחר וכתום - מופעל מחדש) מציגות שינויי שעתוק (ncRNA-seq), רצועות אמצעיות מראות דינמיקת נגישות כרומטין (ATAC-seq) על המקדם (מלבן אדום) ומשפרים (מלבן אפור). אינטראקציות משמעותיות בין מקדם למשפר מיוצגות כקשתות (רצועות דפדפן WashU). מסלול תחתון מציג מוטיבים שזוהו באמצעות כלי HOMER (Slug, Ap1 ו-Rest).
(ד) חלקות צבירה למוטיבים בודדים. ערכי ההעשרה (מוטיבים ל-bp/per peak) של שישה מוטיבים נבחרים (שני מדכאים, שני מפעילים ושני דו-ערכיים) הוערכו סביב מרכז הפסגות (−/+ 4000bp) מכל אשכול.
נתונים מורחבים איור 8: מודל מוצע של נגישות הכרומטין, אינטראקציה בין מקדם-משפר ודינמיקת שעתוק של נוירוני אנגרם של זיכרון בהיפוקמפוס
אזורים, שבהם יש מוטיבים של מפעילי שעתוק. תכנות מחדש זה של משפר המקדם גורם לביטוי גנים מוגבר שככל הנראה מאפשר את ייצוב ה-זכרון. Recall - נוירוני אנגרמה שהופעלו מחדש השתמשו בתת-קבוצה של אינטראקציות מקדם-משפר ראשוני, הקשורה לשינויי שעתוק המעורבים בהעברת mRNA לתאים סינפטיים ותרגום חלבונים. גורם שעתוק – TF, E(1–3) – משפרים שונים המקיימים אינטראקציה עם אותו מקדם, אדום - מדכאי שעתוק, כחול - מפעילי שעתוק.
חומר משלים
עיין בגרסת האינטרנט ב- PubMed Central לקבלת חומר משלים.
תודות
אנו מודים לא. נידרסט, ג'יי פני, ס. בארקר, ר.ט. סטוט, מ. ויקטור, א. ווטסון, נ. דדיק, א. לוקשין, וחברי ל.ה.ט. מעבדה לדיון מועיל והצעות. אנו מודים למנהלי המעבדות י' ג'ואו, א' מקנמרה על תחזוקת מושבות העכברים. אנו מודים ל- P. Autissier (מכון וייטהד) על העזרה עם FACS. מימון: עבודות אלה נתמכו על ידי מענקי NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, קרן JPB, הקרן לחקר תסמונת אלנה דאון, הקרן לחקר תסמונת דאון LuMind, קונסורציום המעגלים של קרן הריפוי לאלצהיימר, וקרן משפחת רוברט א' ורנה א' בלפר ל-L-H.T. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי מענקי NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 ל- M.K. ו- L-H. T, ו- R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HG009446 ל- M.K. V.D נתמך על ידי מענק AARF-19-618751 מאיגוד האלצהיימר. H.S.M נתמך על ידי קרן בורוז וולקום ומלגת הפוסט-דוקטורט של UNCF-Merck. C. A נתמך על ידי קרן JPB. R.M.R נתמך על ידי מענק NIH T32 5T32HD09806. ערכת ההכנה לספריות Hi-C התקבלה כמתנה נדיבה מ- DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, שיקגו, ארה"ב). אנו מודים לצוות Dovetail על דיון והצעות מועילות.