חלק 3: מודל עכבר ייחודי של תרגיל חיים מוקדמים מאפשר זיכרון היפוקמפל ופלסטיות סינפטית
Mar 15, 2022
לעוד information:ali.ma@wecistanche.com
חומרים ושיטות
חיות. עכברים מסוג בר היו צאצאיהם של סכרי C57Bl6J, שהתקבלו במקור ממעבדות ג'קסון וגודלו עוד יותר במתקני בעלי החיים שלנו. לעכברים הייתה גישה חופשית למזון ולמים והאורות נשמרו במחזור אור / חושך של 12 שעות. עם הגמילה ביום שלאחר הלידה (P) 21, העכברים שוכנו בכלובי מצעים סטנדרטיים או בכלובים המצוידים בגלגל ריצה. גם עכברים זכרים וגם נקבות שימשו לכל ניסויי האימון וההתנהגות. רק עכברים זכרים שימשו למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. כל הבדיקות ההתנהגותיות בוצעו במהלך מחזור האור. הניסויים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה באירווין.
לחץ אלאפקטים של ציסטנצ'ה לשיפור הזיכרון
פרדיגמת גלגל הריצה. עם הגמילה מ-P21, העכברים שוכנו בכלובים סטנדרטיים ללא גלגל או מצוידים בגלגל ריצה נייד או נייח מפלדת אל-חלד (קוטר 4.5 ס"מ, 112 גרם, סטאר מדעי החיים). לבעלי חיים ששוכנו עם גלגלים רצים הייתה גישה חופשית לפרקי זמן קבועים מראש: שבוע אחד במהלך תקופת הנעורים (P21–27; juv ELE), שבוע אחד במהלך גיל ההתבגרות (P35–41; Adol ELE), או שלושה שבועות רצופים של גישה (P21-41; juv-adol ELE). קבוצה נוספת של עכברים שוכנה עם גלגל נייח במהלך P21-41 (sta) כדי לשלוט על העשרה סביבתית מנוכחות גלגל בכלוב. כל גלגל הותקן ברשת פוליאוריתן קלת משקל כדי למנוע מהגפיים הקטנות של עכברים נגמלים להחליק דרך הגלגלים. פעילות הריצה הייתה במעקב באמצעות חיישנים מנוטרים דיגיטלית המחוברים ליציאת נתונים ולמחשב לצורך רכישת נתונים בזמן אמת (Vital View Sofware) באמצעות זיהוי מגנטי של סיבובי הגלגלים. כל גלגל שעבר ניטור דיגיטלי עקב אחר מרחק הריצה של הכלוב (שני עכברים ששוכנו בכל כלוב, ולכן המרחק שעבר לכלוב מייצג את המרחק הכולל שרץ בין שני עכברים). המהפכות כומתו בדקה היומית למשך הריצה והומרו למרחק ריצה לכלוב (ק"מ).
מיקום אובייקטיםזכרוןפרוטוקול (OLM). מיקום האובייקטזכרוןהפרוטוקול ששימש במחקר זה הותאם ושונה מפרוטוקולים קודמים44. ביום ה-36 שלאחר הלידה, עכברים הובאו לחדר בדיקה עם בהירות חדר מופחתת. העכברים טופלו במשך כ-2 דקות כל אחד, במשך 5 ימים רצופים לפני אימון ה-OLM (פעמיים ביום ביומיים הראשונים ולאחר מכן פעם ביום במשך 3 הימים הבאים). מפגשי ההרגלה נמשכו 5 דקות, פעמיים ביום במשך 3 ימים (P38-P40) והתרחשו בתוך תאים שהכילו ארבעה רמזים מרחביים ייחודיים בכל קיר של החדר (קווים אופקיים, X שחור, פס אנכי וקיר ריק). ההרגלה חפפה ליומיים האחרונים של הטיפול. במהלך שלב האימון (P41), עכברים הוכנסו לאותם תאים עם שני עצמים זהים ונחשפו לתקופת אימון תת-קרקעית (3 דקות) או סף (10 דקות); תכנון מחקר המבוסס על עבודה קודמת המדגים כי 3 דקות של אימון בדרך כלל אינן מספיקות לטווח ארוךזכרוןהיווצרות45. עבור עכברים בכלובי התעמלות, גלגלי ריצה ננעלו מיד לאחר אימון OLM כדי למנוע כל השפעה חריפה של פעילות גופנית עלזכרוןאיחוד. ביום הבדיקה (P42; 24 שעות אימון afer), אחד האובייקטים הועבר למיקום חדש בתוך החדר, ולאחר מכן הורשו עכברים לחקור את האובייקטים במשך 5 דקות. זמני ה-Te שבילו עם כל אובייקט נקבעו באמצעות ניתוח עיוור על ידי ניקוד ידני, וערכים שהתקבלו הן בימי האימון והן בימי הבדיקה הומרו לאינדקס אפליה (DI), בהתבסס על המיקום החדשני של האובייקט במהלך הבדיקה: [(הזמן שהוקדש לחקר אובייקט חדש – זמן שהוקדש לחקר אובייקט מוכר)/(סך הזמן לחקור את שני האובייקטים) × 100%]. לא היו הבדלים משמעותיים בזכרוןביצועים בין בעלי חיים יושבניים לבין אלה ששוכנו עם גלגל נייח, כך שקבוצות אלה שולבו והוצגו כ-"no ELE" בכל ניתוחי ה-OLM. ניסויי הרגלה נותחו עבור מרחק שעברו על פני מפגשים באמצעות תוכנת ניתוח התנהגותי של כל מבוך (Stoelting Co). עכברים עם זמני חקירה לא אחידים בין שני העצמים במהלך שלב האימון (DI > 20) או שלא הראו ירידה במרחק הכולל שעברו על פני מפגשי הרגלה לא נכללו בניתוח.
Cistanche יכול לעזור לשפר את הזיכרון
מחקרי אלקטרופיזיולוגיה. ניסויים אלקטרופיזיולוגיים בוצעו כפי שתואר קודם לכן, ומקורן של שיטות אלה פורסם במקום אחר66. רק עכברים זכרים שימשו לניסויים אלקטרופיזיולוגיים. בקצרה, עכברים זכרים מכל קבוצות ה-ELE הוקרבו בין P42–51, ופרוסות נאספו מההיפוקמפוס הרוסטרלי. פרוסות קורונל נחתכו (Leica VT1000 S) בעובי 320um והונחו בתא הקלטה ממשק עם נוזל מוחי מלאכותי שחומם מראש (31 ± 1 °C) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ו- 10 mM d-גלוקוז). הפרוסות נקברו באופן רציף בקצב של 1.75-2 מ"ל לדקה, בעוד שפני השטח של הפרוסות נחשפו ל-95% O2/5% CO2 חמים ולחים. ההקלטות החלו לפחות 2 שעות של דגירה. פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררי שדה (fEPSPs) תועדו מ-CA1b stratum radiatum באמצעות פיפטה מזכוכית אחת (2-3 MΩ) עם 2 M NaCl. פולסים של גירוי (0.05 הרץ) הועברו לתחזיות בטחונות-קומיסיורליות של שפר באמצעות אלקטרודה מגרה דו קוטבית (חוט ניגרום מעוות, 65 מיקרומטר) הממוקמת ב- CA1c. העוצמה הנוכחית הותאמה כדי לקבל 50% מתגובת fEPSP מקסימלית. לאחר שנקבע בסיס יציב, LTP הושרה באמצעות רכבת אחת של התפרצויות תטא fve, שבהן כל פרץ (ארבעה פולסים ב-100 הרץ) הועבר בהפרש של 200 אלפיות השנייה (כלומר, בתדר תטא). עוצמת הגירוי לא הוגברה במהלך TBS. הנתונים נאספו ועברו דיגיטציה על ידי מערכת רכישת הנתונים של NAC 2.0 (Teta Burst). הנתונים באיור ה-LTP נורמלו ל-10 הדקות האחרונות של קו הבסיס והוצגו כממוצע ± SE. מדדי בסיס על עקומות קלט/פלט, הנחיית דופק מזווג ו-LTP נותחו באמצעות ניתוח ANOVA ורגרסיה ליניארית דו-כיווני (תוכנת Graphpad Prism 8).Cistanche יכול לעזור לשפר את הזיכרון.
ניתוחים סטטיסטיים. ANOVAs חד-כיווניים שימשו לניתוח ההשפעה של התזמון של פעילות גופנית מוקדמת בחיים על DIs של רכישת OLM (איור 2d, g), בדיקת OLM DIs (איור 2e, h) ו-OLM Testing סך זמני החקירה (איור 2f, i) בתוך כל מין. ההשוואות המרובות שלאחר ההוק של דאנט שימשו לביצוע השוואות ספציפיות לקבוצת "no ELE" (בישיבה) כאשר נצפו תוצאות משמעותיות של ANOVA. ANOVA דו-כיווני שימש לניתוח משקל העכברים שעלה בתקופת ה-ELE (איור 1b, גורמים של קבוצת ELE ומין). מדדים חוזרים דו-כיווניים (RM)-ANOVAs שימשו לניתוח מרחק ריצה יומי (איור 1c-e, גורמים של יום ומין לאחר הלידה), מפגשי הרגלה (איור 2b, c) ולהשוואת רכישת OLM DI לעומת בדיקת DI עבור כל עכבר להשוואות בתוך הקבוצה. מבחני הפוסט-הוק של סידק שימשו לביצוע השוואות ספציפיות כאשר נצפו אינטראקציות משמעותיות או השפעות עיקריות של קבוצת ריצה או סשן OLM. בנוסף, ANOVA תלת-כיווני בוצע עבור OLM Testing DIs כדי לקבוע אינטראקציות משמעותיות בין שלושה משתנים נומינליים (משך אימון OLM, קבוצת ELE ומין). במקרים נדירים שבהם לא נרשמו נתוני ריצה של 24 שעות ליום מסוים, הערכים הוזנחו על סמך לקיחת ריצת המרחק הממוצעת בשלושת הימים הקודמים, כדי לבצע ניתוחים סטטיסטיים. מבחני t של סטודנט לא מזווג שימשו לניתוח מרחקי הריצה הכוללים עבור כל קבוצת ELE (איור 1f-h), כמו גם להשוואת DIs לבדיקת OLM בין עכברים יושבניים מאומנים של 3 דקות ל-10 דקות. מרחקי ריצה מצטברים מבוטאים כאמצעים ± SD. ההשפעות והאינטראקציות העיקריות עבור כל ה-ANOVAs מתוארות בטקסט ובאגדות האיור, יחד עם המספר הספציפי של בעלי החיים של כל מין המשמשים בכל ניסוי. כל הניתוחים היו דו-זנביים ודרשו ערך α של 0.05 עבור משמעות. סרגלי שגיאות בכל הנתונים מייצגים SEM. עבור כל הניסויים, ערכים ±2 סטיות תקן מהממוצע הקבוצתי נחשבו לחריגים והוסרו מהניתוחים. כל הנתונים הסטטיסטיים בוצעו עם תוכנת GraphPad Prism 8. מספר כולל של עכברים המשמשים בניסויי התנהגות = 152.
Cistanche יכול לעזור לשפר את הזיכרון
התקבל: 16 בינואר 2020; התקבל: 13 במאי 2020;
פורסם: xx xx xxxx
תודות
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ של המכונים הלאומיים לבריאות, תחת מספר הפרס K12NS098482 (הוענק ל- A.S.I.) ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת קליפורניה באירווין, המחלקה לרפואת ילדים. אנו רוצים גם להודות לד"ר מרסלו ווד על הדיונים המדעיים שלהם ועל התשומות הביקורתיות על הפרויקט.
תרומת הכותב
A.S.I., T.Y., S.P., F.S., ו-T.V. ביצעו ניסויי פעילות גופנית והתנהגות וניתחו נתונים; א.ק. ביצע את כל הניסויים האלקטרופיזיולוגיים, ניתח את הנתונים וערך את כתב היד; A.S.I. תכנן מחקר, ניתח נתונים, פירש תוצאות וכתב את כתב היד.
אינטרסים מתחרים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
מידע נוסף
התכתבויות ובקשות לחומרים צריכות להיות מופנות ל-A.S.I.
מידע על הדפסות חוזרות והרשאות זמין בכתובת www.nature.com/reprints.
הערת ההוצאה לאור שפרינגר טבע נותרה נייטרלית בכל הנוגע לטענות שיפוטיות במפות שפורסמו ובזיקות מוסדיות.