חלק 1: זיהוי של נוירונים דופמינרגיים שיכולים גם לבסס זיכרון אסוציאטיבי וגם להפסיק את הביטוי ההתנהגותי שלו

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

מייקל שלייר, 1* אליס וויגלין, 1 ג'וליאן ת'ונר, 1 מרטין שטראוך, 2 וולקר הרטנשטיין, 3

מליסה קנטר ויגלט, 1 שרה שולר, 1 טימו סאומובר, 1 קתרינה אייכלר, 4,5,6 אסטריד רווודר, 4,7 דורית מרהוף, 2 מרתה זלאטיק, 5,7 אנדראס ס. ת'ום, 4,8 וברטרם גרבר 1,9 ,10*

1מכון לייבניץ לנוירוביולוגיה, המחלקה לגנטיקה של למידה וזיכרון, 39118 Magdeburg, Germany, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Germany, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute for Biology, 78464 Konstanz, Germany, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, בריטניה, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Germany, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Germany, and 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Germany

מעבר אדפטיבי מחקר הסביבה בחיפוש אחר משאבים חיוניים לניצול משאבים אלה לאחר שהחיפוש הצליח, חשוב לכל בעלי החיים. כאן אנו חוקרים את המעגל הנוירוני המאפשר הזחל תסיסנית מלנוגסטר מכל המינים לנהל משא ומתן על המעבר הזה של חקר-ניצול. אנו עושים זאת על ידי שילוב של התניה פבלובית עם מעקב התנהגותי ברזולוציה גבוהה, מניפולציה אופטוגנטית של נוירונים מזוהים באופן אינדיבידואלי וניתוחים מבוססי נתונים של EM של ארגון סינפטי. אנו מוצאים שהפעלה אופטוגנטית של הנוירון הדופמינרגי DAN-i1 יכולה גם להקיםזיכרוןבמהלך האימון ולסיים בצורה חריפה את התנהגות החיפוש הנלמדת במבחן היזכרות שלאחר מכן. עם זאת, ההפעלה שלו משאירה את ההתנהגות המולדת לא מושפעת. באופן ספציפי, הפעלת DAN-i1 יכולה לבסס זיכרונות אסוציאטיביים בעלי ערכיות הפוכה לאחר אימון מזווג ובלתי מזווג עם ריח, והפעלתו במהלך מבחן ההיזכרות יכולה להפסיק את התנהגות החיפוש הנובעת מכל אחד מהזיכרונות הללו. התוצאות שלנו מצביעות עוד על כך שבמשמעות ההתנהגותית שלה הפעלת DAN-i1 דומה לתגמול סוכר, אך אינה שווה. ניתוחי דנדרוגרמה של כל הקשרים הסינפטיים בין DAN-i1 ושתי המטרות העיקריות שלו, תאי קניון, ונוירון פלט גוף הפטרייה MBON-i1, מצביעים עוד יותר על כך שניתן להעביר את אותות ה-DAN-i1 במהלך האימון ובמהלך בדיקת ההיזכרות. תאי קניון ו-MBON-i1, בהתאמה, בתוך מבנים מסועפים שלא זוהו בעבר, מוגבלים מקומית. זה יספק מוטיב מעגל אלגנטי לסיים את החיפוש עם סיומו המוצלח.

מילות מפתח: דופמין; חקר-ניצול; גוף פטריות; אופטוגנטיקה; תִגבּוֹרֶת; לחפש

Cistancheיכול לשפר את הזיכרון

הצהרת משמעות

במאבק ההישרדות, בעלי חיים צריכים לחקור את סביבתם בחיפוש אחר מזון. עם זאת, לאחר מציאת המזון, כדאי לתעדף את ניצולו על פני המשך חיפוש שעכשיו יהיה חסר טעם כמו חיפוש אחר המשקפיים שאתה מרכיב. הפשרה הזו בין חקירה לניצול חשובה עבור בעלי חיים ובני אדם, כמו גם עבור מכשירי חיפוש טכניים. אנו בודקים אילו מ-10,000 הנוירונים היחידים של זחל זבוב פירות יכולים להטות את האיזון בהחלפה זו, ומזהים נוירון דופמין יחיד בשם DAN-i1 שיכול לעשות זאת. בהתחשב בקווי הדמיון בתפקוד נוירון הדופמין על פני מלך החיות-

dom, זה עשוי לשקף עיקרון כללי של אופן סיום החיפוש לאחר שהוא מצליח.

מבוא

בעל חיים החוקר את סביבתו עשוי להשתמש בניסיון העבר כדי להנחות את חיפושיו אחר מזון. עם זאת, כאשר נמצא מזון, ניתן להסתגל לסיים את החיפוש ובמקום זאת לנצל את מקור המזון. כאן אנו חוקרים את המעגלים המאפשרים הזחל תסיסנית מלנוגסטר לנהל משא ומתן על המעבר הזה של חקר-ניצול. הפשטות המספרית של המוח הזחל, בשילוב עם ביטוי טרנסגן ספציפי לתא וידע על הקישוריות הסינפטית שלו (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), מאפשרים לחקור זאת ברמת הנוירונים המזוהים בנפרד.

זחלי D. melanogaster מקשרים בקלות ריחות עם תגמול מזון (Scherer et al., 2003; Gerber and Hendel, 2006; Schipanski et al., 2008; Rohwedder et al., 2012; Apostolopoulou et al., 2014; Kudow et al. , 2017, 2019). באופן קריטי, התנהגות נלמדת המבוססת על אסוציאציות ריח-מזון נפסקת אם במהלך מבחן היזכרות התגמול קיים (איור 1A). לכן ניתן לראות בהתנהגות נלמדת חיפוש, אשר מסתיים באופן אדפטיבי על ידי התוצאה המבוקשת (כלומר, על ידי התגמול) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). התנהגות ריח מולדת אינה מושפעת באופן דומה (איור 1B), מה שמרמז על כך שהתנהגות מולדת כזו מאורגנת באופן דמוי רפלקס (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). לפיכך, תגמולים טבעיים יכולים לגרום לשתי השפעות: במהלך האימון, הם מספקים אות תגמול שניתן לשייך לרמזים המנחים לאחר מכן את חיפוש התגמול; ובמהלך בדיקת ההיזכרות, הם יכולים להפסיק את החיפוש המלומד הזה בצורה חריפה, ולמנוע מהחיות להיסחף ממשאב ברגע שהוא נמצא. מעבר זה משקף אפוא מעבר באסטרטגיה להשגת תגמול, לא שינוי במוטיבציה (כלומר, לא אובדן עניין בתגמול).

חסרי חוליות וחסרי חוליות כאחד, נוירונים דופמינרגיים (DANs) מספקים אותות מחזקים ללמידה אסוציאטיבית (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun and Rothenfluh, 2017). ב-D. melanogaster, קבוצות נפרדות של DANs משדרות חיזוק מעורר תיאבון ואברסיבי, בהתאמה (זחלים: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; adult flies. Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (תרחיש דומה עשוי להיות גם חסרי חוליות מתעוררים: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al. אל., 2018). תוך יצירת מבנה תאים, DANs אלה חוצים את הסיבים המקבילים של תאי קניון (KCs), הנוירונים הפנימיים של מרכז הריח מהסדר הגבוה ביותר של החרקים, הנקראים גוף הפטריות. תוך כיבוד אותו מבנה תאים, נוירוני פלט גוף פטריות (MBONs) אוספים מידע על פני ה-KCs ושולחים אותו לעבר מעגלים efferent (ראה איור 2A-D) (זחלים: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 ; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; מבוגרים: Sejourne et al., 2011; Places et al., 2013; Aso et al., 2014a,b; Oswald and Waddell , 2015; Takemura et al., 2017). יש לציין, שחזור מיקרוסקופ אלקטרוני לאחרונה גילה של-DAN יש שתי מטרות עיקריות: ה-KCs וה-MBONs (ראה איור 2B) (זחלים: Eichler et al., 2017; מבוגרים: Takemura et al., 2017).

ב-D. melanogaster הזחל, הפעלה של DANs מאשכול pPAM יכולה להפעיל אפקט מתגמל במהלך האימון (Rohwedder et al., 2016). מארבעת הימים של אשכול זה, שניים יכולים להעניק אפקט מתגמל כזה בנפרד (DAN-h1 ו-DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). כאן, בחרנו להתמקד

איור 1. סוכר יכול להעניק אותות תגמול וסיום חיפוש. זחלים אומנו כך שריח הוצג או מזווג או לא מזווג עם סוכר. בבדיקת ריקול לאחר מכן, הם נבדקו לגבי העדפת הריח שלהם בהיעדר או בנוכחות הסוכר (סקיצה לכיוון העליון). בדיקה בהיעדר סוכר גילתה ריח אסוציאטיביזיכרון, מכמת כ-PI חיובי. הביטוי ההתנהגותי לכךזיכרוןהופסק בנוכחות סוכר. לפיכך, סוכר יכול להעניק שני סוגים של אותות: במהלך האימון, הוא מספק אות תגמול שניתן לשייך לריח כדי להדריך את החיות בהמשך חיפוש התגמול שלהם; ובמהלך בדיקת ההיזכרות, הסוכר כפרס המבוקש מספק איתות לסיים את החיפוש המלומד הזה. גדלים לדוגמה: N=29, N =28. B, הזחלים נבדקו להעדפת ריח מולדת, אם בהיעדר או בנוכחות סוכר (סקיצה לכיוון העליון). סוכר לא השפיע על התנהגות הריח המולדת, מה שמרמז על הארגון דמוי הרפלקס שלו. גדלים לדוגמה: N=20 כל אחד. אותיות שונות מעל עלילות התיבה מצביעות על מובהקות זוגית (מבחן Mann–Whitney U, p, 0.05, מתוקן לפי Bonferroni-Holm). *משמעות מאפס (בדיקת סימן מדגם אחד, p, 0.05, מתוקן לפי בונפרוני-הולם). ns, לא משמעותי. כל הבדיקות הסטטיסטיות והתוצאות שלהן מדווחות יחד עם נתוני המקור באיור הנתונים המורחבים 1-1. לערכי העדפת הריח העומדים בבסיס ציוני ה-PI של ניסוי זה, ראה איור 9A.

איור 2. המעגלים של מטריצת DAN-KC-MBON. כיאזמה של האונה המדיאלית. מידע ריח מעובד כדי לגרום לגישה מולדת, כמו גם לכיוון אזור הגביע של KCs גוף הפטריות (סגול; מוצג במלואו הוא דוגמה אחת KC בצד ימין). מידע על תגמול הטעם מעובד גם כדי להנחות התנהגות מולדת, כמו גם באמצעות נוירונים מודולטוריים אמנרגיים בעיקר (המוצג DAN-i1, טורקיז/שחור) לעבר תאים בודדים של אונות גוף הפטריות (בצד שמאל, תאים מסומנים). כל אחד מארבעת התאים של האונה המדיאלית (hk) מקבל קלט מ-DAN בודד שגם מעיר את אותו תא בהמיספרה הנגדית. ה-MBONs של האונה המדיאלית שואבים מתאים בודדים, בדרך כלל משתי ההמיספרות (המוצג MBON-i1, מגנטה/צהוב), ומספקים את הפלט שלהם, בתצורות השונות בין התאים, על פני החלוקה ההמיספרית. ביחד, ה-MBON אחראיםזיכרוןהתנהגות חיפוש מבוססת. הנתונים מבוססים על Eichler et al. (2017) ו-Saumweber et al. (2018). ב, מטריצת DAN-KC-MBON בתא ה-i. DAN-i1 ורוב ה-KCs מקימים סינפסות כימיות הדדיות, וגם DAN-i1 וגם KCs מספקים פלט ל-MBON-i1. למען הפשטות, רק סינפסות עם הנוירונים DAN-i1 ו-MBON-i1 השמאלי מוצגות בפירוט. אותה קישוריות נמצאת ברוב התאים האחרים, אם לא בכולם (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (טורקיז) מקבל קלט מחוץ לגוף הפטרייה (אפור כהה) איפסילטרלית לגוף התא שלה (אזור המסומן 1) ולאחר מכן מעיר את תא ה-i בשתי ההמיספרות (מסומן 2 ו-3). MBON-i1 (מגנטה) חוצה את קו האמצע פעמיים; הוא מקבל קלט בתא ה-i של שתי ההמיספרות ומספק פלט באזורים הסמוכים לגוף הפטרייה של שתי ההמיספרות. D, זהה ל-C, אך במבט מעט מוטה, המראה שחזורי שלד של הנוירונים השמאליים DAN-i1 ו-MBON-i1 ודוגמה אחת KC (שחור). הנתונים מבוססים על Eichler et al. (2017). E, דנדרוגרמה של נוירון DAN-i1 השמאלי. נקודות צבעוניות מייצגות סינפסות פלט מ-DAN-i1. משולשים מייצגים סינפסות קלט ל-DAN-i1. צבעים מייצגים את הנוירון השותף של הסינפסה המתאימה. כל הסינפסות האחרות בתוך גוף הפטרייה מסומנות בתווית "אחר". לא מוצגות סינפסות שיוצרות DAN-i1 עם נוירונים מחוץ לגוף הפטרייה, במיוחד באזור 1 (Eschbach et al., 2020). קווים מסומנים מציינים אזורים שבהם הנוירון חוצה את קו האמצע של המוח. F, זהה ל-E, אבל עבור הנוירון MBON-i1 השמאלי. לא מוצגות סינפסות שיוצרות MBON-i1 עם נוירונים מחוץ לגוף הפטרייה. עבור גרסאות ברזולוציה גבוהה של הנוירונים DAN-i1 ו-MBON-i1 של שתי ההמיספרות, כמו גם כל ה-KCs הבוגרים, ראה איורי נתונים מורחבים 2-1, 2-2 ו-2-3, בהתאמה .

על DAN-i1 מכיוון שהוא נותח בעבר ביתר פירוט (Saumweber et al., 2018) ומכיוון שהוא מניב אפקט מתגמל חזק יותר מאשר DAN-h1 (Saumweber et al., 2018; נתונים שלא פורסמו). תחילה אנו מספקים תיאור מפורט של הסידור המרחבי של כל הסינפסות בין DAN-i1 לשני שותפי הפלט העיקריים שלו, MBON-i1 וה-KCs. לאחר מכן, אנו שואלים האם הפעלה אופטוגנטית של DAN-i1 יכולה לתווך לא רק אות תגמול במהלך האימון אלא גם איתות להפסקה חריפה שלמדו לחפש את התגמול במהלך מבחן ההיזכרות.

פיתוח גוף cistanche

חומרים ושיטות

מודל ניסוי ופרטי נושא. בכל שלב נעשה שימוש בזחלים משני המינים בשלב האכלה (D. melanogaster), בני 5 ימים לאחר הטלת הביצים. זבובים נשמרו על מדיום סטנדרטי, בתרבית המונית ב-25 מעלות, 60 אחוז -70 אחוזי לחות יחסית, ומחזור אור/חושך של 12/12 שעות. לקחנו כף של מדיום מזון מבקבוקון מזון, בחרנו באקראי את המספר הרצוי של הזחלים, שטפנו אותם בקצרה במי ברז, והתחלנו בניסוי.

השתמשנו בזחלים מהונדסים כדי לבטא את תעלת היונים המגודרת לאור ChR2-XXL ב-DAN. לשם כך, זן האפקטורים UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (סופק באדיבות על ידי R. Kittel, University Leipzig), הועבר לאחד משני זני נהג: או 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016) (Bloomington Stock Center מס' 41347) או זן הנהג המפוצל-Gal4 SS00864 (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018) כדי להשיג צאצאים הטרוזיגוטיים כפולים. נהג שולט בזני הנהג הועברו לעותק מקומי של w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). כמשפיעור שולט זן הנושא את אתרי הנחיתה המשמשים ל-Gal4 (attP2) או ל-Split-Gal4 (attP40/attP2), אך ללא תחום Gal4 שהוכנס ("ריק") (Pfeiffer et al., 2010), UAS- ChR2-XXL. אישרנו את דפוס הביטוי של 58E02 ו-SS00864 על ידי הצלבתם ל-pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). מכיוון ש-ChR2-XXL רגיש מספיק כדי להיות מופעל באור יום (לא מוצג), זבובים הועלו בבקבוקונים שהוחשכו כל הזמן על ידי עטיפת קרטון שחור. עבור הניסוי המוצג באיור 8E, UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) נחצה ל-58E02-Gal4.

הגדרה נסיונית. לצורך ניסויים התנהגותיים, זחלים אומנו בצלחות פטרי בקוטר פנימי של 9 ס"מ ונבדקו בצלחות פטרי בקוטר פנימי של 9 או 15 ס"מ (שתיהן מסארסטדט) כפי שהוזכר באגדות האיור, בכל המקרים מלאות ב-1 אחוז אגרוז (דרגת אלקטרופורזה). ; רוט). כמו הריח, השתמשנו ב-n-עמיל אצטט מדולל 1:20 בשמן פרפין (AM; CAS: 628-63-7; Merck), ובמקרים מסוימים בנוסף לא מדולל 1-אוקטנול (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).

ניסויים בוצעו בתוך קופסה מקיפה של 43 43 73ס"מ מצוידת בשולחן תאורה בהתאמה אישית הכוללת מערך LED 24 12 (470nm; Solarox) וצלחת דיפוזיה בעובי 6-מ"מ של פרספקס חלבי למעלה כדי להבטיח אור כחול אחיד להפעלת ChR2-XXL (120mW/cm2). צלחות פטרי הונחו ישירות על גבי צלחת הדיפוזיה. צלחות הפטרי הוקפו בטבעת דיפוזיה מפוליאתילן; מאחורי טבעת הדיפוזיה הותקנו 30 נוריות אינפרא אדום (850 ננומטר; Solarox) כדי לספק תאורה שלא הייתה נראית לזחלים אך אפשרה את ההקלטה והמעקב אחר התנהגותם לניתוח לא מקוון. לשם כך, הוצבה מעל צלחת הפטרי מצלמה (Basler acA204090umNIR; Basler) המצוידת במסנן אינפרא אדום. לפרטים נוספים לגבי מערך הניסוי, ראה Saumweber et al. (2018).

פיתוח גוף cistanche

לימוד ריח-סוכר אסוציאטיבי. ניסויי למידה עקבו אחר פרוטוקולים שנקבעו (Michels et al., 2017). מיכלי ריח הוכנו מראש על ידי הוספת 10 מ"ל של חומר ריח למיכלי טפלון בהזמנה אישית (5 מ"מ קוטר פנימי עם מכסה מחורר עם 7 חורים בקוטר 0.5 מ"מ כל אחד). צלחות פטרי כוסו במכסים שונה מחוררים במרכז ב-15 חורים בקוטר 1 מ"מ כל אחד כדי לשפר את האוורור.

לצורך אימון ריח-סוכר, 20 זחלים הונחו באמצע צלחת פטרי מלאה באגרוז שהכילה 2מול/ליטר D-פרוקטוז (CAS: 57-48-7; רוט) כפרס (1) וצוידו בשני ריחות. מיכלים בצדדים מנוגדים, שניהם מלאים ב-AM (AM1). לאחר 2.5 דקות, הזחלים הועברו אל צלחת פטרי טרייה עם אגרוז רגיל וחסר טעם, מצויד בשני מיכלים ריקים (EM), שם הם גם בילו 2.5 דקות. בוצעו שלושה מחזורי אימון "מזוגים" כאלה, בכל אחד מהמקרים באמצעות צלחות פטרי טריות. במחצית מהמקרים, האימון התחיל עם צלחות פטרי המכילות תגמול כמצוין (AM1/EM), בעוד שבחצי השני של המקרים הרצף היה הפוך (EM/AM1). עבור כל קבוצה של זחלים שאומנו AM1/EM (או EM/AM1), קבוצה שנייה אומנה באופן הדדי, כלומר על ידי הצגות "לא מזווגות" של ריח ותגמול (AM/EM1, או EM1/AM, בהתאמה).

לאחר האימון, הזחלים הועברו לאמצע צלחת פטרי בדיקה ונבדקו לגבי העדפת הריח שלהם. חשוב לציין, בדיקת ההיזכרות נערכה על צלחת פטרי רגילה כדי להעריךזיכרון- התנהגות חיפוש מבוססת או על צלחת פטרי המכילה פרס כדי לקבוע אם נוכחות הפרס הפסיקה אתזיכרוןחיפוש מבוסס. בכל מקרה, צד אחד של צלחת הפטרי הבדיקה צויד במיכל AM והצד השני במיכל EM. מספר הזחלים משני הצדדים נקבע מתמונת המצלמה ב-3 דקות לאחר תחילת הבדיקה. ממספרים אלה, חושבה העדפת ריח באופן הבא:

לפיכך, ערכי PI יכולים לנוע בין 1 ל-1, כאשר ערכים חיוביים מצביעים על כך שהזחלים העדיפו את הריח יותר לאחר אימונים מזווגים מאשר לא מזווגים. ערכי PI חיוביים מצביעים בהתאם על אסוציאטיבית מעוררת תיאבוןזיכרוןזה עדיף לפרש כמוזיכרוןהתנהגות חיפוש מבוססת. ערכי PI שליליים, לעומת זאת, מצביעים על אסוציאטיבי אברסיביזיכרון.

למידה אסוציאטיבית על ידי הפעלת DAN אופטוגנטית. עבור ניסויים אופטוגנטיים, אימון ובדיקה בוצעו באופן אנלוגי. עם זאת, כל צלחות הפטרי היו מלאות באגרוז רגיל (כלומר, לא נעשה שימוש בטעמים מתגמלים). במקום זאת, עבור אימון מזווג, AM הוצמד לגירוי מתמשך של אור כחול כדי להפעיל 58E02-DAN או 864- DAN למשך 2.5 דקות, ואחריו 2.5 דקות של חושך ללא ריח (AM1/EM). עבור אימון לא מזווג, הצגת ריח וגירוי אור התרחשו בנפרד (AM/EM1). עבור הניסוי המוצג באיור 8E, ריח ואור הוצגו במשך 5 דקות כל אחד; הניסוי הזה פעל לפי הנהלים שתוארו על ידי Rohwedder et al. (2016).

לאחר שלושה מחזורי אימון כאלה, בוצעה מבחן ההיזכרות, והעדפת ריח ו-PI חושבו כמתואר. באופן קריטי, בדיקת ההיזכרות נערכה ללא הפעלת אור כחול כדי לקבוע אם ה-DAN מתווך אות תגמול במהלך האימון או עם הפעלת אור כחול כדי לקבוע אם, בנוסף, ה-DANs יכולים לתווך אות לסיום החיפוש.

וריאציות של פרוטוקול זה מצוינות באגדות הדמות.

התנהגות ריח מולדת. מיכלי ריח וצלחות פטרי הוכנו כמתואר לעיל. קבוצות של 20 זחלים נאספו מהבקבוקון, נשטפו לזמן קצר במי ברז והונחו על צלחת פטרי עם מיכל AM בצד אחד ומיכל ריק בצד השני. לאחר 3 דקות, העדפת הריח המולדת נקבעה על פי משוואה 1. בדיקת העדפה זו נערכה בהיעדר או בנוכחות סוכר, או בהיעדר או בנוכחות הפעלת אור כחול, כדי לקבוע אם תנאי הבדיקה הללו משתנים התנהגות ריח מולדת.

ניתוח של מודולציות התנהגותיות לאחר אימון עם 864-הפעלת DAN. התנהגות הזחל עוקבה בווידאו ונותחה כמתואר בפירוט על ידי Paisios et al. (2017). בקצרה, שני היבטים של כימוטקסיס הזחל נותחו. ראשית, אפנון סירוס הראש (HC לשנייה) (HC/s) חושב באופן הבא:

במדד זה, זווית הכיוון (HA) מתארת ​​את כיוון ראש החיה ביחס לריח, כאשר זוויות כיוון מוחלטות (ABS (HA)) של 0 מעלות או 180 מעלות, למשל, מצביעות על כך שהריח נמצא בחלק הקדמי או האחורי של הזחלים, בהתאמה. מדד זה מניב אפוא ציונים חיוביים עבור המשיכה (כלומר, כאשר ה-HC מכוון את הזחלים לכיוון ולא הרחק מיעד הריח), בעוד שהוא מניב ציונים שליליים עבור סלידה.

אימונוהיסטוכימיה. מוחות הזחל נותחו בתמיסת מלח ללא Ca{{0}}וקובעו בתמיסת בואין מדולל 1:2 בתמיסת מלח ללא Ca{21- למשך 7 דקות. שלושה שלבי כביסה (כל 10 דקות) ב-PBST (0.3 אחוז Triton-X 100 ב-PBS) ואחריו דגירה עם הנוגדנים העיקריים למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר שלוש שטיפות (כל 10 דקות) ב-PBS, הרקמה הודגרה עם הנוגדנים המשניים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שלבי כביסה אחרונים ב-PBS (כל 10 דקות), הותקנו דגימות ב-Vectashield (מעבדות וקטור). ההכנות נבדקו תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי DM 6000 CS (Leica Microsystems).

פיתוח גוף cistanche

כנוגדנים, השתמשנו נוגדן חד שבטי לעכבר אנטי-FASII (DSHB, מדולל 1:50 בתמיסת חסימה המכילה 4 אחוזים סרום עזים תקין) ובנוגדן לארנב נגד GFP (A11122, Invitrogen, מדולל 1:1{ {28}}00 בתמיסת חסימה המכילה 4 אחוז סרום עז תקין) כנוגדנים ראשוניים ונוגדנים נגד עכברים Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ואלקסה-488 נגד ארנב נוגדן (A11034, Invitrogen), שניהם מדוללים 1:200 ב-PBS, כנוגדנים משניים; או שהשתמשנו נוגדן חד שבטי עכבר אנטי ChR2 (ProGen Biotechnik) מדולל 1:100 ב-0.3 אחוז PBST כנוגדן ראשי, נוגדן Cy3 אנטי עכבר (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), מדולל 1:300 ב-0.3 אחוז PBST , כנוגדן המשני, ואנטי-HRP Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories), מדולל 1:300 ב-0.3 אחוז PBST, לצביעה נגדית.