חלק 1 זיהוי של ציסטאנצ'ים Herba (Rou Cong Rong) מוצרים רפואיים באמצעות חתימות נוקלאוטידים ספציפיות למין

למידע נוסף אנא צור קשר:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* ו-Shi-lin Chen 3

מעבדה מרכזית אחת לחומרים ביו-אקטיביים ומשאבים ניצול של רפואת צמחי מרפא סינית, משרד החינוך, המכון לפיתוח צמחי מרפא, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה וה-Peking Union Medicinal College, בייג'ינג, סין, 2 NHP Research Alliance, המכון למגוון ביולוגי של אונטריו (BIO ), אוניברסיטת Guelph, Guelph, ON, קנדה,

3 מעבדת מפתח של בייג'ינג לזיהוי והערכת בטיחות של רפואה סינית, המכון למטריה סינית, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית, בייג'ין, סין

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

Cistanches Herbaהוא צמח מרפא בעל סגולות ניקוי רעלים ונמצא בשימוש נפוץ באסיה. בגלל חוסר האיזון בין היצע וביקוש, נואפים מתווספים לעתים קרובות למטרות רווח. עם זאת, אין פיקוח רגולטורי מכיוון שכלי בקרת איכות אינם מספיקים לזיהוי מוצרים מעובדים בכבדות. לפיכך, פותח כלי מולקולרי חדש המבוסס על חתימות נוקלאוטידים ופריימרים ספציפיים למין. אזורי ITS2 מ-251Cistanches Herbaודגימות נואפות רוצו. על בסיס אתרי SNP פותחו ארבע חתימות נוקלאוטידים בטווח של 30-37 bp ושישה פריימרים ספציפיים למין, והם אושרו על ידי תערובות ניסוי מלאכותיות המורכבות משישה מינים שונים ויחסים שונים. שיטה זו יושמה גם לזיהוי 66Cistanches Herbaמוצרים בשוק, לרבות תמציות ותרופות פטנט סיניות. התוצאות הדגימו את התועלת של חתימות נוקלאוטידים בזיהוי חומרים נואפים בתערובות. מחקר השוק גילה זיוף של 36.4 אחוזים: 19.7 אחוזים כללו זיוף עם Cynomorium songaricum אוCistancheSinensis, ו-16.7 אחוזים היו מעורבים בהחלפה עם Cy. songaricum, Ci. sinensis, או Boschniakia rossica. התוצאות גם חשפו כי Cy. songaricum היה הנואף הנפוץ ביותר בשוק. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש בחתימות נוקלאוטידים ספציפיות למין לוויסות זיוף ואימות הבטחת האיכות של שרשראות אספקת מוצרים רפואיים, במיוחד עבור מוצרים מעובדים שה-DNA שלהם מושפל.

מילות מפתח: Cistanches Herba, רפואת פטנט סינית, חתימת נוקלאוטידים, DNA מושפל, בקרת איכות רפואה

מבוא

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) היא תרופה ידועה שנרשמה בפרמקופיה באסיה (ועדת הפרמקופיאה הסינית, 2015; אמנת הפרמקופפיה של יפן, 2016); תרופה זו מופקת מגבעולים עסיסיים מיובשים שלCistanche deserticolaYC מא אוCistanche tubulosaטוניק, מכיוון שהוא אינו רעיל וניתן ליטול אותו לפרקי זמן ארוכים (Li et al., 2016). יתר על כן,Cistanchesהרבה זכתה בכבוד לקבל את השם "ג'ינסנג מדברי" בשל ערכו הרפואי הרב, במיוחד בחיזוק התפקוד המיני הגברי (Zhang and Su, 2014; Gu et al., 2016). יש יותר מ-100 תרופות פטנט סיניות רשומות בוועדת הפרמקופיה הסינית (2015) ובתקנים מקומיים רשמיים אחרים שפורסמו (Wang et al., 2012). ככל שאוכלוסיית הקשישים גדלה, יש ביקוש ניכר לCistanches Herbaוהמוצרים הרפואיים שלה. עם זאת, משאבי חומרי גלם הופכים נדירים יותר ויותר. למעשה, שני המינים המקוריים שלCistanches Herbaנוספו לספר הנתונים האדומים של צמח סין כצמחי בר המוגנים על ידי המדינה (קטגוריה II) (Fu, 1991). החומרים הרפואיים בשוק מעובדים בעיקר בצפון מערב סין.

בשל חוסר האיזון הניכר בין ההיצע והביקוש שלCistanchesהרבה, נואפים רבים נכנסו לשוק; הנואפים הללו אינם עולים בקנה אחד עם הסטנדרטים ועלולים לאיים על ביטחון הסמים. הנואפים הידועים כוללים את הגבעולים העסיסיים המיובשים של Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang בסינית),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan, ו- Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). לנואפים אלה יש מאפיינים מורפולוגיים דומים לאלו שלCistanchesהרבה, מקשה על זיהוי טקסונומי מסורתי, במיוחד לאחר עיבוד החומר למוצרים רפואיים. זיהוי מיקרוסקופי אינו זמין בגללCistanchesהרבהאין לו מאפיינים מיקרוסקופיים סופיים או ייחודיים. כלי כימיה אנליטית נוכחיים אינם מספיקים לזיהוי זיוף של Cistanches Herba מכיוון שתרכובות דומות קיימות גם בתוך המאייפים הידועים Ci. סלסה (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) ו- Ci. sinensis (Liu et al., 2013). לכן, פיתוח שיטה מולקולרית מהירה לאימות Cistanches Herba ומוצריה נחוצה בדחיפות למערכות בקרת איכות נאותות ברפואת הפטנטים הסינית ובתעשיות תרופות אחרות.

חן וחב'. הציע לראשונה spacer מתומלל פנימי 2 (ITS2) בתור ברקוד אוניברסלי לצמחי מרפא (Chen et al., 2010). Sun et al. אימת את אזור ITS2 כברקוד DNA עדיף לזיהויCistanchesהרבה והנואפים שלה (Sun et al., 2012). עם זאת, לא ניתן להשתמש ב-ITS2 כדי להבחין בין רפואת פטנט סינית לבין DNA מושפל. לאחרונה, מספר הולך וגדל של מחקרים הראו ש"מיני ברקוד" הוא שיטה שימושית להגברת DNA מושפל (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). עם זאת, חתימות נוקלאוטידים מתאימות יותר ממיני ברקודים, מכיוון שהראשונים מתייחסים לנוקלאוטידים אחד או יותר שהם ייחודיים למין אחד וניתן לנצל אותם ביעילות על ידי טכניקות מולקולריות רבות, כגון בדיקות DNA, מיקרו-נוזליות והגברה איזותרמית בתיווך לולאה ( de Boer et al., 2015). האן וחב'. פיתח חתימות נוקלאוטידים לג'ינסנג Panax, Angelica Sinensis ו-Lonicera japonica וזיהה בהצלחה את תרופות הפטנטים הסיניות הקשורות (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

מוצרים פונקציונליים המכיליםCistanchesהרבה. באופן ספציפי, פיתחנו (1) ארבע חתימות נוקלאוטידים ושישה זוגות פריימר ספציפיים להבדיל בין אותנטיותCistanchesהרבה וחומרי נואפים ידועים, (2) אימתו את ארבע חתימות הנוקלאוטידים בניסויים, כולל תערובות של שוברים טקסונומיים ידועים המשמשים להכנת מוצרי Cistanches Herba המכילים מרכיבים אותנטיים ומזויפים, ו-(3) ביצעו סקר שוק של 66Cistanchesמוצרי הרבה באמצעות חתימות הנוקלאוטידים שלהם.

Cistancheבעל השפעות רבות ויכול לשפר את תפקוד הכליות

חומרים ושיטות

איסוף והכנת דוגמאות

בסך הכל נאספו 251 דגימות ממונגוליה הפנימית, שינג'יאנג ו-נינגשיה, בין היתר; דגימות אלו כללו 214Cistanches Herbaו-37 נואפים ומפורטים בטבלה משלימה S1. דגימות שובר תואמות אושרו על ידי טקסונומים והופקדו בעשבון של המכון לפיתוח צמחי מרפא, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, בייג'ינג, סין. בסך הכל 35 קבוצות של אבקות, תבלינים ותמציות שלCistanchesהרבה נרכשה מחנויות מקוונות ובתי מרקחת בבייג'ינג ובצ'נגדו (טבלה 1). בסך הכל, 31 אצוות של רפואת פטנט סינית המכילותCistanchesהרבה נרכשה מבתי מרקחת שונים (טבלה 2), וההרכבים המוצהרים של תרופות פטנט סיניות שונות מוצגות בטבלה משלימה S3. המאפיינים המורפולוגיים השונים של צורות מינון שונות מוצגים באיור 1.

דגימות מעורבות: אבקות של Ci.מדברית, Ci.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica ו-O. coerulescens עורבבו באופן מלאכותי בשילובים שונים (ביחס של 1:1) לפני החילוץ. הפרטים של דגימות מעורבות אלה מוצגים באגדה של איור 3. בנוסף, אבקות של ארבעה נואפים היו מעורבבים עם ה-Ci האמיתי. deserticola ביחסי משקל שונים: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 ו-60000:1 (טבלה 3). ושני המוצרים המקוריים מעורבבים באותן פרופורציות.

מרתח: פרוסות סי. deserticola וסי. סונגריקום שימש להכנת המרתח. הפרוסות (10 גרם) הורתחו ב-300 מ"ל מים מזוקקים כפולים במשך 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ו-240 דקות ולאחר מכן שימשו למיצוי DNA.

מיצוי DNA, הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ורצף

דגימות, מרתח ודגימות מעורבות: הדגימות (40-50 מ"ג) נטחנו לאבקות עדינות באמצעות טחנת מערבל מעבדה Retsch MM400 (Retsch Co., גרמניה) בתדירות של 30 הרץ. ה-DNA הגנומי חולץ לאחר מכן עם ערכת DNA גנומית אוניברסלית לצמח (Tiangen Biotech Beijing Co., סין) לפי הוראות היצרן. ITS2 הוגבר על ידי הפריימרים האוניברסליים 2F/3R (Chen et al., 2010).

במקביל לכל אצווה. אבקת רפואת הפטנטים הסינית נשטפה עם 700 µL של חיץ קדם-שטיפה [100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 20 mM חומצה אתילן-דיאמין-טטרה-אצטית (EDTA), pH 8.0;

700 mM NaCl; 2 אחוזים פוליווינילפירולידון (PVP)-40; ו-0.4 אחוז -מרקפטואתנול] מספר פעמים עד שהסופרנטנט היה צלול וחסר צבע, ולאחר מכן התערובת עברה צנטריפוגה ב-7500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. המשקע שימש לאחר מכן להפקת ה-DNA הגנומי באמצעות ערכת ה-DNA הגנומית האוניברסלית של הצמח (Tiangen Biotech Beijing Co.) לפי הוראות היצרן. בסופו של דבר, DNA מכל אצווה רוכז לצינור אחד. שישה זוגות פריימר ספציפיים למין - SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR ו-LDF/LDR - תוכננו באמצעות Primer Premier

6.0 תוכנה (Premier Co., קנדה) להגברת Cistanches Herba והנואפים שלה (הפרטים מוצגים בטבלה 4). PCR בוצע בתגובה של 50 µL בנפח המכילה 1 µL של

KOD FX (Toyobo Co., יפן), 25 μL של חיץ 2 × PCR, 10 μL של dNTPs (2 mM), 1.5 μL מכל פריימר (10 μM), ו-4 μL (~50 ng) של תבנית DNA; הנפח הנותר היה מורכב ממים מזוקקים כפולים. התגובות בוצעו על ידי

מחזור תרמי (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., ארה"ב); התכניות התרמיות מפורטות בטבלה 4. מוצרי ה-PCR נבדקו באמצעות אלקטרופורזה של 3% אגרוז ג'ל וטיהרו לרצף דו-כיווני עם רצף ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) בהתאם לשיטת הרצף Sanger. לאחר מכן, הרגישות של ששת הפריימרים נבדקה באמצעות מבחן PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR) עם מערכת בזמן אמת CFX96 (Bio-rad Lab., ארה"ב). ספי המחזור חושבו אוטומטית על ידי המערכת באמצעות מודל "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR בוצע בתגובה בנפח 15 μL המכילה 7.5 μL של SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., יפן), 1.0 µL מכל פריימר (10 µM), ו-1.0 µL של תבנית DNA כאשר הנפח הנותר מורכב ממים מזוקקים כפול. ה-qRT-PCR בוצע עם שלושה שכפולים טכניים שעל פיהם חושבה שגיאת תקן.

ניתוח רצפים: הרצפים נערכו והורכבו באופן ידני באמצעות CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., ארה"ב).

רצפי ITS מ-GenBank סומנו באמצעות מודל Hidden Markov (HMM) כדי להשיג את רצפי ITS2 (Keller et al., 2009). הרצפים יושרו לאחר מכן על ידי תוכנת MEGA 5.0 באמצעות שיטת היישור "שריר" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Cistancheבעל השפעות רבות ויכול לשפרכִּליָהפוּנקצִיָה

תוצאות

פיתוח של חתימות נוקלאוטידים וצמדי פריימר ספציפיים למין עבור ציסטאנצ'ים צמחים ומנופים

שיעורי הצלחת ההגברה והרצף של PCR של 251 הדגימות היו 100 אחוזים כאשר נעשה שימוש בזוג הפריימר 2F/3R. האורך המיושר של ה-Cy. רצפי songaricum ITS2 היו 229 bp (איור משלים S1). ניתוח הרצפים ממינים עשבוניים ואלו של מינים קרובים שאוחזרו מ- GenBank (טבלה משלימה S2) גילה שני אתרי פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד (SNP) עבור Cy. songaricum. על בסיס ה-SNPs, Cy אחד. פותחה חתימת נוקלאוטיד 30- bp ספציפית ל- songaricum (5'-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') (איור 2A). תוצאות של כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) ב-NCBI הוכיחו שחתימת נוקלאוטידים זו הייתה ייחודית ל-Cy. songaricum (טבלה 5). עם ניתוח דומה של הרצפים ממינים קרובים, אחד עד שניים SNPs התגלו מ-Ci. sinensis, B. rossica ו-O. coerulescens. על בסיס ה-SNPs, גם חתימות הנוקלאוטידים עבור שלושת הנואפים האחרים פותחו באופן דומה, כולל חתימה של 34 bp (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3') עבור Ci. Sinensis, חתימה של 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') עבור B. rossica, וחתימת 31 bp (5'-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgctt2gttg} g. (איורים 2BD). ניתוח BLAST ב-NCBI גילה גם שחתימות הנוקלאוטידים הללו היו ספציפיות ולא נוכחות באף מין אחר (טבלה 5).

Cistanches Herbaוהנואפים שלו יכלו להיות מוגברים בו זמנית מתערובות באמצעות זוג ה-primer האוניברסלי 2F/3R. לפיכך, עיצבנו פריימרים ספציפיים למין להגברת חתימות נוקלאוטידים על ידי יישור רצפי ITS2. ארבעה זוגות פריימר ספציפיים - SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR ו-LDF/LDR - תוכננו להגביר את חתימות הנוקלאוטידים של Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis, ו-O. coerulescens, בהתאמה (טבלה 4). אורכי האמפליקונים היו 123, 72, 131 ו-71 bp, בהתאמה.

בנוסף, נותחו סך של 214 רצפי ITS2 מחומרי Cistanches Herba ניסיוניים. שני פריימרים ספציפיים קצרים - HMRCF/HMRCR ו-GHRCF/GHRCR עבור Ci. deserticola ו-Ci. tubulosa, בהתאמה - תוכננו להגביר את האזורים הקצרים של הדגימות המושפלות (טבלה 4). אורכי האמפליקונים היו 132 ו-134 bp, בהתאמה.

אימות של חתימת הנוקלאוטידים ושיטת פריימר ספציפית על בסיס תערובות מלאכותיות ומרתח

יעילות ההגברה של זוגות הפריימרים החדשים אומתו מהתערובת. תוצרי PCR הושגו באמצעות כל זוג פריימר עבור כל מין ממוקד, כפי שמוצג

ניתן היה להשיג ערכי cq של B. rossica או O. coerulescens אפילו ששיעור הדגימות היה 30000:1 או 40000:1, ותוצאות ההגברה של Ci. sinensis, Ci.tubulosa, וניתן לזהות את Ci deserticola כשהיחס היה 20000:1. אבל לא ניתן היה להשיג תוצאות ניתנות לזיהוי עבור Cy. songaricum כאשר הוא היווה את הפרופורציה של 20000:1.

כדי לוודא אם שיטת חתימת הנוקלאוטידים מתפקדת עם חומרים מעובדים, מרתחים של Ci. deserticola וסי. הוכנו סונגריקום. התוצאות הראו שהברקוד הקצר מ-Ci. ניתן היה להגביר את deserticola, גם לאחר שהדגימות רותחו במשך 210 דקות. בנוסף, חתימת הנוקלאוטידים של Cy. ניתן היה להגביר את songaricum לאחר רתיחה של הדגימות במשך 150 דקות, בעוד שלא זוהו תוצרי PCR לאחר רתיחה של הדגימות במשך 210 או 240 דקות (איור 4). תוצאות הרצף הוכיחו שחתימת הנוקלאוטיד הקצר הושגה בהצלחה מהמרתח.

סקר שוק של זיוף באמצעות חתימת נוקלאוטידים ופריימרים ספציפיים

השיטה לעיל יושמה לזיהוי שלCistanchesמוצרי הרבה בשוק. שלושים וחמש קבוצות שלCistanchesפרוסות, אבקות ותמציות של הרבה הוגברו ורצפו באמצעות שישה פריימרים ספציפיים מעוצבים (תוצאות האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז מוצגות באיור משלים S2 והרצפים מפורטים בגיליון נתונים משלים 1). ניתוח של הרצפים באמצעות חתימות הנוקלאוטידים שלהם גילה שחמש קבוצות של פרוסות היו אותנטיות. אצווה פרוסה אחת ומנת אבקה אחת הוחלפו ב- Cy. songaricum ותמצית אחת הוחלפו ב-Ci. סיננסיס. שש קבוצות האבקות האחרות היו תערובות: חמש הושחתו עם Cy. songaricum ו-Ci. sinensis ואחד הוסיפו עם Cy. songaricum (טבלה 1). בנוסף, אצווה פרוסה אחת הוחלפה בסלביה מילטיוריזה.

ה-Cistanches Herba בתרופות פטנט סיניות נתון לתהליכים שונים המקשים על האימות. נבדקה היכולת של ששת זוגות הפריימרים להגביר את אזורי חתימת הנוקלאוטידים הספציפיים למין מתרופות הפטנטים הסיניים (תוצאות האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז מוצגות באיור משלים S2). רוב תרופות הפטנטים הסיניות מכילות רכיבים מסוגים שונים של מינים. לדוגמה, גלולות Shihu Yeguang (ZCY34) מכילות 25 מרכיבים, כולל Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu), וג'ינסנג Radix et Rhizoma (Ren Shen). ממרכיבים אלה, ניתן היה להגביר את Cistanches Herba באופן ספציפי באמצעות צמד הפריימרים GHRCF/GHRCR. רצף ישיר של מוצרי PCR חשף עקבות נקיים מאוד. עם זאת, לא ניתן היה להשיג פס גלוי עם צמד הפריימר HMRCF/HMRCR.

דוגמה נוספת היא כדורי Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). ישנם שמונה מרכיבים בנוסףCistanchesהרבה ברפואת פטנט סינית זו, אך לא היו פסים גלויים שהושגו על ידי GHRCF/GHRCR או HMRCF/HMRCR, מה שאומר שלאCistanches Herbaהיה נוכח. עם זאת, האזור הנואף של Cy. songaricum הוגבר בהצלחה על ידי זוג הפריימר הספציפי SYF1/SYR1. תוצאות הרצף הדגימו את חתימת הנוקלאוטידים הקצרה של Cy. songaricum הושג בהצלחה.

Cistancheיש פונקציות רבות וישאנטי דלקתיאפקטים