חלק 1 השפעות נוגדות חמצון ונוגדי קרישה של גליקוזידים פניל-פרופנואידים המבודדים ממטאטאים (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria ו-P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylvia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

אוניברסיטת לודז', המחלקה לביוכימיה כללית, הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה, 90-236 לודז', פולין

ב המחלקה לביוכימיה ואיכות יבול, המכון למדעי הקרקע וגידול צמחים, המכון הממלכתי למחקר, 24-100 Puławy, פולין

המרכז למחקר ושימור המגוון הביולוגי, המחלקה לביולוגיה סביבתית, המכון לביולוגיה, אוניברסיטת יאן קוצ'נובסקי, 25-406 קילצה, פולין

תַקצִיר

צמחים Holoparasitic של Orobanchaceae, כוללCistanche, Orobanche ו-Phelipanche spp, ידועים בעושר של גליקוזידים של פניל-פרופנואידים (PPG). תרכובות PPG רבות נמצאו בעלות קשת רחבה של פעילויות, כגון אנטי מיקרוביאלית, אנטי דלקתית, נוגדת חמצון ומשפרת זיכרון. כדי לבחון טוב יותר את פוטנציאל הפעילות הביולוגית של מטאטא אירופאי (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) ועשרה מרכיבי פניל-פרופנואיד בודדים בודדים, חקרנו את פעולתם האנטי-רדיקלית, ההשפעה המגנה מפני חמצון בפלסמה במבחנה. , והשפעה על פרמטרי קרישה. התמציות שנבדקו הראו פעילות ניקוי של 50-70 אחוזים מהכוח של Trolox. תמצית OC, עשירה באקטאוזיד, היה בעל פוטנציאל אנטי-רדיקלי טוב יותר מ-20 אחוזים מאשר תמצית PR שהייתה היחידה שהכילה PPGs חסרי קטקול טבעתי B ביחידת האציל. יתרה מכך, נמצא שרק שמונה PPGs שנבדקו הוכיחו פוטנציאל נוגד חמצון בפלזמה אנושית שטופלה ב-H2O2/Fe; עם זאת, שלושת ה-PPGs שנבדקו היו בעלי פוטנציאל נוגד קרישה בנוסף לתכונות נוגדות חמצון. נראה כי המבנה של PPGs, במיוחד נוכחותם של חלקי אציל וקטכול, קשור בעיקר לתכונות נוגדות החמצון שלהם. פוטנציאל נוגד הקרישה של תרכובות אלו קשור גם למבנה הכימי שלהן. PPGs נבחרים מציגים את הפוטנציאל לטיפול במחלות לב וכלי דם הקשורות ללחץ חמצוני.

למידע נוסף אנא צור קשר:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistancheלטובולוזה השפעות רבות

1. הקדמה

סטרס חמצוני ידוע בהשפעתו השלילית על בריאותם של אורגניזמים חיים, כולל הזדקנות מואצת וכמה סוגי סרטן. התרחשות של עקה חמצונית קשורה לאיזון מופרע בין מנגנוני החמצון והאנטיאוקסידטיביים (כולל הגנה אנזימטית (קטלאז, גלוטתיון פרוקסידאז) והגנה לא אנזימטית (גלוטתיון) בתאי הגוף [1]. ייצור יתר של מינים של חמצן תגובתי (ROS), כולל רדיקלים מחמצנים ומינים בעלי קליפה סגורה, הוא אחד המנגנונים העיקריים מאחורי היווצרות עקה חמצונית. עם זאת, ההשפעה הביולוגית הנגרמת על ידי ROS תלויה במידה רבה בריכוז, זמן החשיפה והמיקום. בתנאים רגילים (ריכוז נמוך), רדיקלי חמצן/חנקן יכולים לשחק את התפקיד של שליחים משניים, אך ברמה הגבוהה יותר, הם עשויים להתחיל להגיב עם מבנים ביולוגיים, כמו קרומי תאים [2]. מבין כל מיני ROS, רדיקל הידרוקסיל (HO.) גורם לאחד הנזקים הגדולים ביותר לביו-מקרומולקולות: חלבונים, שומנים ו-DNA. ידוע שלחץ חמצוני ממלא תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל קרדיווסקולריות. הפרעות במערכת הדם נמצאו בקורלציה ו/או קדמו לשינויים בפרמטרים שונים של דימום וסמנים ביולוגיים בפלזמה [1,3].

מצד שני, חומרים טבעיים רבים, כגון פוליפנולים וחומצות שומן רב בלתי רוויות, זוהו כנוגדי חמצון חזקים המסוגלים למנוע היווצרות ו/או להפחית מיני חמצן תגובתיים. תרכובות בעלות תכונות כאלה נמצאות במוצרי מזון רבים ובתכשירים פרמצבטיים ממקור צמחי. תזונה מועשרת בירקות ופירות טריים, וטיפולים נוגדי חמצון המבוססים על נוגדי חמצון טבעיים, מומלצים אפוא באופן נרחב מכיוון שהם יכולים להפחית את רמת הלחץ החמצוני ולמנוע תהליכים פתופיזיולוגיים שונים [4,5]. פוליפנולים צמחיים הם קבוצה מגוונת של מטבוליטים משניים, שביניהם חומצות פנוליות תופסות מקום חשוב, שכן הם מופצים באופן נרחב ומציגים מגוון השפעות ביולוגיות, כגון אנטי-מיקרוביאליות, נוגדות חמצון ואנטי-דלקתיות. גליקוזידים של פנילפרופנואידים (PPGs) הם קרובי משפחה של אסטרים של חומצה הידרוקסינמית והם המעמד העיקרי/היחיד של מטבוליטים משניים הקיימים בצמחי Orobanchaceae holoparasitic, כוללCistanche, Orobanche ו-Phelipanche spp. כמה מינים ממשפחה זו הם מזיקים רציניים של גידולים שחקלאים רוצים להיפטר מהם בשדות (דוגמה של Phelipanche ramosa), מעטים משמשים בפרמקולוגיה, בעוד שלרובם אין חשיבות לבני אדם. הרבהCistancheנמצא בשימוש נרחב ברפואה המסורתית באסיה בטיפול במחסור בכליות וכחומר משפר חסינות וזיכרון, אנטי אייג'ינג ונוגד עייפות [6]. ניתוחים פיטוכימיים של קבוצות מחקר שונות הוכיחו שגליקוזידים פניל-פרופנואידים, כגון אצטון, אכינאקוסיד וצד פודיום, הם אחד המרכיבים הפעילים העיקריים של הרבה סיסטאנצ'ה [7]. מחקר שנערך לאחרונה על כמה מיני מטאטא נמצא בפולין על ידי Jedrejek וחב'. [8] הראה שלחומר צמחי זה יש הרכב איכותי דומה (שליטה של ​​PPGs), יתר על כן, הוא שווה או אפילו עולה עלCistanchespp. מבחינת תכולת החומרים הפעילים [8].

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

המחקר הנוכחי נועד להעריך את הפוטנציאל האנטי-רדיקלי ונוגדי חמצון, כמו גם את ההשפעה על הפרמטרים המוסטזיס של שלושת תמציות המטאטא (Orobanche Caryophyllaceae - OC, Phelipanache Arenaria - PA ו-P. ramosa - PR) העשירים בפניל שונים. -

פרוסטנואידים, כמו גם מרכיבי ה-PPG הבודדים שלהם. הקיבולת האנטי-רדיקלית נמדדה באמצעות 2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) ו-2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH ) בדיקות. הלחץ החמצוני במערכת בדיקת הפלזמה הושרה באמצעות רדיקל הידרוקסיל (H2O2/Fe), לאחר מכן נמדדה פרוקסידציה של שומנים (מבחן TBARS) ורמת החלבון קרבוניל וקבוצות תיול. בין הפרמטרים שנקבעו של המוסטזיס היו: זמן טרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT), זמן פרוטרומבין (PT) וזמן טרומבין (TT).

2. חומרים ושיטות

2.1. כימיקלים

רדיקל 2,2-דיפניל-1-פיקרילהידראזיל (DPPH), 2,2'-אזינוביס-3-את-ילבנציאזולין-6-חומצה סולפונית (ABTS), אשלגן פרסולפט, {{9 }}הידרוקסי-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-חומצה קרבוקסילית (טרולוקס), דימתיל סולפוקסיד (DMSO), חומצה תיוברביטורית (TBA), חומצה פורמית (דרגת LC-MS), ו-H2O2 נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מונגוריה, ארה"ב). מתנול (דרגת שיפוע HPLC) ואצטוניטריל (דרגת LC-MS) נרכשו מ- Merck (Darmstadt, גרמניה). עשרה פניל-

תרכובות פרופנואיות שנבדקו בעבודה זו, כולל 2'-O-acetylacteoside (97 אחוז), 2'-O-acetylpoliumoside (98 אחוז), 3-O-methylpoliumoside (96 אחוז), acetonide (99 אחוז), זירה בפנים (97 אחוז), קרנאטוסיד (98 אחוז), טניפוזיד (99 אחוז), פוליומוזיד (99 אחוז), טובולוזיד A (96 אחוז), ווידמניוסיד D (96 אחוז) בודדו בעבר על ידינו מחומר צמחי מתחת נתון [ 8]. טוהר התרכובות הוערך באמצעות ניתוח UHPLC-PDA-MS. מים טהורים במיוחד הוכנו בבית באמצעות מערכת לטיהור מים Milli-Q (Millipore Co.). ריאגנטים אחרים היו בדרגה אנליטית וסופקו על ידי ספקים מסחריים מקומיים.

2.2. חומר צמחי

צמחים פורחים משלושה מינים של מטאטא, כולל Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel ו-P. Ramos (L.) Pomel זוהו על ידי פרופ'. רנטה פיווורצ'יק (אוניברסיטת יאן קוצ'נובסקי, קילצה, פולין) ונאספה ממקור טבעי בפולין.

דגימות שובר (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), שטח עשב קסרוטרמי, טפיל גליום boreale, מאי 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◗.5N), p. חור, טפיל Artemisia campestris, יוני 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), שדה, טפיל Solanum Lycopersicum, ספטמבר 2014) מופקדים בצמחייה של אוניברסיטת יאן קוצ'נובסקי בקיילצה (KTC). החומר הצמחי עבר ליאופיל ונטחן דק לפני המיצוי.

2.3. הכנת תמציות מטאטא

אבקת חומר צמחי (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 גרם, P. Arenaria (PA) – 3 גרם ו-P. ramosa (PR) – 3 גרם) הופץ עם 80 אחוז MeOH ב-40 ◦C ו-1500 psi (לחץ ממס ) באמצעות ASE 200 מואץ

חולץ ממס (Dionex, Sunnyvale, CA, ארה"ב). התמציות אודו ויובשו בהקפאה (מייבש הקפאה Gamma 2-16 LSC, ישו, גרמניה). יעילות המיצוי עבור OC, PA ו-PR הייתה 55%, 37% ו-43% ממשקל החומר הצמחי, בהתאמה. בשל התכולה הגבוהה של פחמימות (נתונים לא מוצגים), התמציות הגולמיות טוהרו עוד יותר על ידי מיצוי פאזה מוצק (SPE) על Oasis HLB מיקרו-עמודה (500 מ"ג; Waters, Milford, MA, ארה"ב). הסוכרים הוסרו עם 1 אחוז MeOH, ואז התרכובות המעניינות נפלטו עם 80 אחוז MeOH. לאחר הסרת הממס, תמציות OC, PA ו-PR עברו ליאופיל (מייבש הקפאה Gamma 2-16 LSC), והתשואות של טיהור SPE היו 53 אחוז (OC), 67 אחוז (PA) ו-51 אחוז (PR) .

2.4. מאפיינים פיטוכימיים של תמציות מטאטא

ניתוחים איכותיים וכמותיים של תמציות מטאטא בוצעו באמצעות מערכת ACQUITY UPLC (Waters) המחוברת לגלאי מערך פוטו-דיודות (PDA) ולספקטרומטר מסה טנדם קוואדרופול (TQD-MS/MS). תמציות OC, PA ו-PR מיובשות בהקפאה הומסו ב-50 אחוז מתנול בריכוז של 0.50 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן

עבר כרומטוגרפיה על עמודת BEH C18 (100 × 2.1 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, ווטרס). התנאים הכרומטוגרפיים היו כדלקמן: טמפרטורת התנור – 25 ◦C,

גרדיאנט ליניארי 10→25 אחוז משלב B נייד (0.1 אחוז חומצה פורמית באצטוניטריל) בשלב נייד A (0.1 אחוז חומצה פורמית ב-H2O) מעל 12 דקה, קצב זרימה - 0.4 מ"ל/דקה, נפח הזרקה - 2 μL, טווח UV - 190-490 ננומטר (רזולוציית 3.6 ננומטר). ניתוח MS בוצע במצב של יונים שליליים עם יינון אלקטרוספריי (ESI), תוך שימוש בהגדרות הבאות: טווח סריקה 100-1200 מ/צ; מתח נימי 2.8 קילו וולט; מתח חרוט 35 V;

טמפרטורת מקור 150 ◦C; טמפרטורת ההשמדה 450 ◦C; השממה

זרימת גז 900 ליטר לשעה, וספיקת גז קונוס 100 ליטר לשעה. רכישת נתונים ועיבודם בוצעו באמצעות תוכנת Waters MassLynx 4.1.

פסגות של פניל ​​פרופנואיד גליקוזיד (PPG) זוהו על ידי השוואה של נתוני LC-MS שהתקבלו עם אלו של תרכובות מבודדות בעבר [8]. כימות PPGs בתמציות מטאטא התבסס על שיטת UPLC-UV עם זיהוי ב-330 ננומטר, וכיול סטנדרטי חיצוני באמצעותאקטאוזיד(Sigma-Aldrich, 99 אחוז, HPLC) as

תקן קבוצתי. עקומת כיול ליניארית הוכנה בשישה ריכוזים בטווח של 1-200 ug/mL והראתה ליניאריות טובה (R2

0.999). תוצאות כמותיות מייצגות את ערך ה-SD הממוצע של שלוש זריקות והובאו במיליגרםאקטאוזידשווה ערך (eq) לגרם של תמצית (mgאקטאוזידeq/g).

2.5. פעילות אנטי רדיקלית במבחנה

2.5.1. מבחן ניקוי רדיקלי של ABTS

בדיקת ה-ABTS האנטי-רדיקלית בוצעה בשיטה שתוארה על ידי Kontek et al. [9], עם שינויים קלים כדלקמן: נעשה שימוש ב-20 אחוז MeOH להכנת ריאגנטים (7 מ"מ ABTS ו-4.9 מ"מ אשלגן לכל-

סולפט); התמיסות של תמציות OC, PA ו-PR, בארבע רמות ריכוז בטווח של 100-400 ug/mL, ותמיסות Trolox, בשש רמות ריכוז בטווח של 10 250 ug/mL, הוכנו עם 50 אחוז MeOH. היחס בין המדגם לתמיסת העבודה של ABTS היה 1:25 (v/v). הספיגה ב-734 ננומטר נמדדה לאחר דגירה של 30 דקות

בחושך באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב).

עיכוב הספיגה ( אחוז ) חושב באופן הבא: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

חושבו ה-Trolox Equivalents (TE) של תמציות מטאטא

באמצעות נוסחה TE=msample/mstandard, כאשר m הוא השיפוע של הישר

עקומות קו (עיכוב ספיגה לעומת ריכוז). ערך TE של

המדגם מתאר את הפעילות המנורמלת שלו נגד Trolox (תקן TE =

1.0). ערכי IC50 עבור תמציות OC, PA ו-PR ו-Trolox היו

הגיעו בניסוי, ואז חושבו מהקו הישר שלהם

עקומות (עיכוב ספיגה לעומת ריכוז) ומתבטאים ב

ug/mL.

הבדיקה בוצעה בשלושה עותקים, והתוצאות מוצגות

כאמצעי ± סטיות תקן (SD).

2.5.2. בדיקת ניקוי רדיקלי DPPH

בדיקת DPPH האנטי-רדיקלית בוצעה בשיטה שתוארה על ידי Jedrejek וחב'. [8] ו-Brand-Williams et al. [10], עם שינויים קלים כדלקמן: התמיסות של תמציות OC, PA ו-PR, בארבע רמות ריכוז בטווח של 50▽ 250 ug/mL, ותמיסות Trolox, ברמת שישה ריכוזים בטווח של 10▽ 250 ug/mL, הוכנו עם 50 אחוז MeOH. היחס בין המדגם ל-DPPH היה 1:19 (v/v). הספיגה ב-517 ננומטר נמדדה לאחר דגירה של 30 דקות בחושך באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis (Evolution 260 Bio). עיכוב הספיגה (אחוז) חושב באופן הבא: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. ערכי Trolox Equivalent (TE) ו-IC50 של דגימות הבדיקה חושבו באותו אופן כמו במבחן ABTS (סעיף 2.5.1). הבדיקה בוצעה בשלושה עותקים, והתוצאות מוצגות כאמצעים ± SD.

2.6. פתרונות מלאי של תרכובות צמחיות ותמציות שנבדקו לניסויים בפלזמה אנושית

פתרונות מלאי של התרכובות שנבדקו ותמציות צמחים הוכנו ב-50 אחוז DMSO. הריכוז הסופי של DMSO בדגימות שנבדקו היה נמוך מ-0.05 אחוז והשפעותיו נקבעו בכל הניסויים.

2.7. בידוד פלזמה אנושית

דם אנושי, או פלזמה, הושג משישה תורמים קבועים (גברים ונשים לא מעשנים) לבנק דם (לודז', פולין) ולמרכז רפואי (לודז', פולין). הדם נאסף כתמיסת CPD (ציטראט/פוספט/דקסטרוז; 9:1; v/v דם/CPD) או תמיסת CPDA (ציטראט/פוספט/דקסטרוז/אדנין; 8.5:1; v/v; דם/CPDA). התורמים לא נטלו תרופות או חומרים ממכרים (כולל טבק, אלכוהול ותוספי נוגדי חמצון) במשך שבועיים לפחות לפני התרומה. הניתוח שלנו של דגימות הדם בוצע תחת ההנחיות של הצהרת הלסינקי לחקר האדם ואושר על ידי הוועדה לאתיקה של מחקר בניסויים בבני אדם באוניברסיטת לודז'. הפלזמה הוכנה על ידי צנטריפוגה של דם אנושי טרי ב-4500xg למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. ריכוז החלבון חושב על ידי מדידת הספיגה של הדגימות שנבדקו ב-280 ננומטר, לפי הנוהל של Whitaker ו-Granum [11].

2.8. סמנים של עקה חמצונית בפלזמה אנושית

2.8.1. מדידת חמצון ליפידים

חמצון שומני פלזמה הוכמת על ידי מדידת הריכוז של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric (TBARS). ריכוז TBARS חושב באמצעות מקדם ההכחדה המולארי (ε=156,000 M 1 cm 1). השיטה מתוארת בצורה יסודית יותר אחרת היו [12,13]. 2.8.2. מדידת קבוצת קרבוניל רמת קבוצות הקרבוניל חושבה באמצעות מקדם ההכחדה המולארי (ε=22,000 M 1 cm 1 ) והובאה כ-nmol קבוצות קרבוניל/מ"ג של חלבון פלזמה, לפי ברטוס [ יג] ולווין ואח'. [14]. 2.8.3. קביעת קבוצת תיול תכולת קבוצת התיול בחלבוני פלזמה נמדדה בצורה ספקטרופוטומטרית באמצעות SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, גרמניה) על ידי ספיגה ב-412 ננומטר עם 5,5′ -dithiol-bis-(2- חומצה nitrobenzoic). השיטה מתוארת ביתר פירוט במקום אחר [15–17].

2.9. פרמטרים של דימום דם

2.9.1. מדידת זמן פרוטרומבין (PT)

PT נקבע בקרישיות באמצעות קרישה אופטית

אותיות מצביעות על תוצאות המבחן של Tukey (p < 0.05), ערכים עם זהים

אות בתוך שורה אינה שונה משמעותית.

2.9.2. מדידת זמן תרומבין (TT)

ה-TT נקבע בקרישיות באמצעות מנתח קרישה אופטי (דגם K-3002, Kselmed, Grudziadz, פולין), לפי השיטה שתוארה על ידי Malinowska וחב'. [18].

2.9.3. מדידת זמן טרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT)

ה-APTT נקבע בקרישיות באמצעות מנתח קרישה אופטי K-3002 (Kselmed, Grudziadz, פולין) לפי Mali now ska et al. [18].

2.10. ניתוח נתונים בדיקת Q-Dixon בוצעה כדי לסלק נתונים לא ודאיים.

הנתונים נבדקו להתפלגות נורמלית במבחן שפירו-וילק ושוויון השונות למבחן של Levene. הבדלים מובהקים סטטיסטית זוהו באמצעות ANOVA, ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey או מבחן Kruskal-Wallis. השוואות נחשבו מובהקות ב-p < 0.05.="" הערכים="" מוצגים="" כאמצעים="" ±="">