חלק 1 אקטאוזיד מדכא אוסטאוקלסטוגנזה בתיווך RANKL על ידי עיכוב אינדוקציה של C-Fos ומסלול NF- KB והפחתת ייצור ROS

סונג-יופ לי^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., סונג-הו קוק², ג'ונג-צ'ה לי^2,3*

1 מכון מחקר לרפואה קלינית של האוניברסיטה הלאומית צ'ונבוק, המכון למחקר ביו-רפואי של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ'ונבוק, ג'ונג'ו, צ'ונבוק, דרום קוריאה, 2 המחלקה ליישור שיניים, המכון למדעי הפה ובית הספר לרפואת שיניים, האוניברסיטה הלאומית צ'ונבוק, ג'ונג'ו, צ'ונבוק, דרום קוריאה, 3 המחלקה למדעי חומרים ביו-אקטיביים, מרכז המחקר לחומרים ביו-אקטיביים, האוניברסיטה הלאומית Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, דרום קוריאה

תַקצִיר

מחקרים רבים דיווחו כי ציטוקינים דלקתיים הם מתווכים חשובים לאוסטאוקלסטוגנזה, ובכך גורמים לספיגת עצם מוגזמת ולאוסטאופורוזיס.אקטאוזיד, התרכובת הפעילה העיקרית שלרחמניה גלוטינוזה, אשר נמצא בשימוש נרחב ברפואה המזרחית המסורתית, בעל פוטנציאל אנטי דלקתי ונוגדי חמצון. במחקר הזה מצאנו את זהאקטאוזידעיכבו באופן ניכר את ההתמיינות והיווצרות של אוסטאוקלסטים מקרופאגים של מח עצם (BMMs) ומקרופאגים RAW264.7 שגוירו על ידי מפעיל הקולטן של ליגנד גרעיני פקטור-kappaB (NF-kB) (RANKL). טיפול מקדים באקטאוזיד מנע גם ספיגת עצם על ידי אוסטאוקלסטים בוגרים באופן תלוי מינון.אקטאוזיד(10 mM) מוחלש הפעלה מגורה של RANKL של p38 kinase, קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים וקינאזות c-Jun N-terminal, וכן דיכא את הפעלת NF-kB על ידי עיכוב זרחון של תת-יחידת p65 ושל המעכב kBa. בנוסף, עליות בתיווך RANKL בביטוי של c-Fos וגורם גרעיני של תאי T משופעלים, ציטופלזמי 1 (NFATc1), ובייצור של גורם נמק גידול-a, אינטרלוקין (IL)-1b , ו-IL-6 כנראה עוכבו על ידי טיפול מקדים באקטאוזיד. יתר על כן, בעל פהאקטאוזידהפחתת אובדן עצם כתוצאה מניתוח כריתת שחלות וייצור ציטוקינים דלקתי לרמות בקרה. הנתונים שלנו מצביעים על כךאקטאוזידמעכב התמיינות והבשלה של אוסטאוקלסטים ממבשרים אוסטאוקלסטיים על ידי דיכוי הפעלה המושרה על ידי RANKL של קינאזות חלבון המופעלות על ידי מיטוגן וגורמי שעתוק כגון NF-kB, c-Fos ו-NFATc1. ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כךאקטאוזידעשוי לפעול כחומר אנטי ספוג להפחתת אובדן עצם על ידי חסימת הפעלת אוסטאוקלסטים.

למידע נוסף אנא צור קשר:emily.li@wecistanche.com

מבוא

העצם מתחדשת כל הזמן על ידי פעילות מאוזנת של אוסטאוקלסט ואוסטאובלסט [1]. אוסטאוקלסטים נובעים מתאי קדם המטופואטיים של שושלת המונוציטים/מקרופאגים, בעוד שאוסטאובלסטים הם מהשושלת המזנכימלית [2]. הפעלת אבנורמלוסטאוקלסטים או אוסטאובלסטוגנזה מופחתת יכולים לשבש הומאוסטזיס של העצם, ולגרום בסופו של דבר למחלות כמו אוסטאופורוזיס, דלקת פרקים וסרטן העצם [3,4]. אוסטאופורוזיס היא מחלת עצם שכיחה שמובילה לסיכון מוגבר לשברים. הצורה הנפוצה ביותר של אוסטאופורוזיס נגרמת על ידי מחסור באסטרוגן אצל נשים בגיל המעבר. תרופות כמו קורטיקוסטרואידים ותרופות אנטי-אפילפטיות עלולות לגרום גם לחוסר איזון בין ספיגת עצם להיווצרות, מה שעלול לגרום לאוסטאופורוזיס [5]. מעכבי ספיגה רבים, כולל ביספוספונטים, קלציטונין, אסטרוגן, ומאפננים קולטנים סלקטיביים לאסטרוגן שימשו לטיפול באוסטיאופורוזיס. מעכבים אלו שומרים על מסת העצם על ידי עיכוב תפקוד האוסטאוקלסטים [6]. טיפול חלופי באסטרוגן הוא הטיפול הפופולרי ביותר למניעה וטיפול באוסטיאופורוזיס לאחר גיל המעבר. עם זאת, טיפול ארוך טווח בתחליפי אסטרוגן יכול להגביר את הסיכון לסרטן רירית הרחם וסרטן השד. לכן, חוקרים רבים מיקדו את מאמציהם בפיתוח חומר אנטי-ספוג חדש שאין לו תופעות לוואי [7-10]. מכיוון שאוסטאוקלסטים מתפקדים בספיגת עצם, אוסטאוקלסטים מעכבים ספציפיים נחשבו למטרה העיקרית במחקרים רבים. אוסטאוקלסטים הם תאי ענק מרובי גרעינים שנוצרו על ידי אבות מונו-גרעיניים ממשפחת המונוציטים/מקרופאגים באמצעות שגשוג רציף, התמיינות והיתוך של תאי קדם המטופואטיים [11]. גורם מגרה מושבה מקרופאג (M-CSF) ומפעיל קולטן של גורם גרעיני (NF)-kB (RANK) ליגנד (RANKL) הם גורמים חיוניים להתמיינות אוסטאוקלסטים[12]. בנוסף, מספר ציטוקינים דלקתיים, כגון גורם נמק של גידול (TNF) ואינטרלוקין (IL)-1b, תורמים לאוסטאוקלסטוגנזה על ידי אפנון האינדוקציה של RANKL, osteoprotegerin ו-M-CSF [7,13]. קישור RANKL לקולטן RANK משטח התא מביא ל-RANKL/RANK/TNFR

קומפלקסים של גורמים קשורים (TRAF) המפעילים ברצף NFkB וקינאזות חלבון המופעלות על ידי מיטוגן (MAPKs), כולל cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase וקינאזות חוץ-תאיות (ERK) [14]. הפעלה זו ממלאת תפקיד מפתח בתיווך התמיינות, הפעלה והישרדות של אוסטאוקלסטים. RANKL גם מפעילה את הביטוי של גורמי שעתוק כגון גורם גרעיני של תאי T משופעלים, ציטופלזמי 1 (NFATc1) ו-Fos, החיוניים להתפתחות אוסטאוקלסטים [ 7,9]. לכן, איתות RANKL נחשב למטרה העיקרית של חומרים נוגדי ספיגה המדכאים הפעלת אוסטאוקלסטים וחסרי עצמות.אקטאוזידהוא התרכובת הפעילה העיקרית של Rehmannia glutinosa, שנמצאת בשימוש נרחב ברפואה המזרחית המסורתית [15,16].אקטאוזידהוא נוגד חמצון חזק ובעל פעילות אנטי-טוקסית, אנטי דלקתית ואנטי-נוציספטיבית [17-20]. גילינו את זה בעבראקטאוזידמפחית את פעילות טירוזינאז וביוסינתזה של מלנין על ידי ויסות איתות ERK [21], מגן מפני נזקי חניכיים מתיווך של מיני חמצן (ROS) [22], ומדכא נזק לתאים בתיווך מיקוטוקסין [23]. השפעות אלו קשורות קשר הדוקאקטאוזידהיכולת של להסיר ROS ולווסת איתות בתיווך MAPK. בפרט, ROS מוצע לתווך מסלולי איתות המושרים על ידי RANKL ואירועים תאיים באוסטאוקלסטים. טיפול מקדים עם נוגדי חמצון עיכב הפעלה המושרה על ידי RANKL של NF-kB, ERK ו- IkBa, ובכך דיכא אוסטאוקלסטוגנזה [24]. ממצאים אלה הצביעו על כך שבנוסף לפעילות אנטי דלקתית, ופעילות נוגדת חמצון היא חיונית עבור חומר אנטי ספוג, ולכןאקטאוזידיכול לדכא אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL. במחקר הנוכחי, בדקנו האםאקטאוזידיש השפעה טיפולית על אובדן עצם. בדקנו את ההשפעות שלאקטאוזידעל התמיינות אוסטאוקלסט וספיגת עצם והמנגנונים הסלולריים הקשורים תוך שימוש במערכות ניסוי חוץ-גופי ו-in vivo.

אקטאוזיד

חומרים ושיטות

אמירה אתית

נוהלי טיפול ושימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה הלאומית של Chonbuk לאתיקה בטיפול ושימוש בחיות מעבדה (הרשאה מס' CBU 2010-0007). כל הניסויים במחקר זה בוצעו על פי הנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה.

עכברים, כימיקלים וכלי מעבדה

עכברי ICR בנות ארבעה שבועות נרכשו מ-OrientBio Inc. (סיאול, קוריאה) ושוכנו ב-2261uC ו-5565 אחוזי לחות במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים. אקטאוזיד (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (איור S1) בודד מהעלים של Rehmannia גלוטינוזה. אקטאוזיד הומס במי מלח מבוצר פוספט (PBS) לפני השימוש. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ו-M-CSF נרכשו ממערכות מחקר ופיתוח (מיניאפוליס, MN, ארה"ב). נוגדנים ספציפיים ל-c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ו-b-actin הושגו מ-Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ארה"ב ). נוגדנים עבור p-p38 ו-p38 נרכשו מ- Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ארה"ב). ערכות EIA של CalciumAssay ו-Osteocalcin (OC) נרכשו מ-BioAssay Systems (Hayward, קליפורניה, ארה"ב) ומ-Biomedical Technologies (Stoughton, MA, ארה"ב), בהתאמה, כדי לקבוע פרמטרים ביוכימיים בסרום. ערכת בדיקת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט עכברים (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, ארה"ב) שימשה גם למדידת רמת TRAP5b בסרום. אלא אם צוין אחרת, כימיקלים נוספים התקבלו מ-Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ארה"ב), וכלי מעבדה היו מ-SPL Life Sciences (Pochun, דרום קוריאה).

תרבויות תאים

תאי מח עצם התקבלו מהשוק והעצם של עכברי ICR בנות 6 שבועות לפי שיטות שתוארו קודם [25]. תרחיף מח העצם הודגרה בצלחת תרבית של 100-מ"מ בנוכחות 50 ננוגרם/מ"ל M-CSF. לאחר 3 ימים, תאים נצמדים שימשו כמקרופאגים של מח עצם (BMMs) כדי לגרום להתמיינות אוסטאוקלסטית. חלק מתאי מח העצם הודגרו במשך 48 שעות ללא M-CSF, ותאים נצמדים הוטחו במדיום מבדל אוסטאובלסט, כמתואר במקומות אחרים [25]. תאי מקרופאג RAW264.7 תורבו במדיום מסוג Eagle's שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי (FBS), 2 mM L גלוטמין ואנטיביוטיקה. תאים אלה שימשו כקו תאים מקביל עבור BMMs כדי לחקור את ההשפעה של אקטאוזיד על אוסטאוקלסטוגנזה.

דיפרנציאציה אוסטאוקלסטית וצביעת TRAP

BMMs טופלו מראש בריכוזים שונים (0-50 mM) של אקטאוזיד במשך 2 שעות לפני גירוי ב-100 ng/ml RANKL. מדיית תרבית הוחלפה במדיה טרייה בימים 2 ו-5. לאחר 7 ימי דגירה, התרבויות נקבעו ב-4 אחוזים PBS-buffered paraformaldehyde והוצבעו ב-TRAP באמצעות ערכת sigma Aldrich לפי הוראות היצרן. תאים חיוביים ל-TRAP נספרו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית, ותאים המכילים 3 גרעינים או יותר נחשבו לאוסטאוקלסטים. תאי RAW 264.7 נחשפו גם ל-100 ng/ml RANKL לאחר טיפול מקדים באקטאוזיד למשך 2 שעות, ולאחר 7 ימי דגירה, התאים עובדו לצביעת TRAP.

מדידת כדאיות התא

כדאיות התא נקבעה באמצעות ריאגנט טטרזוליום מסיס במים (WST)-8. בקצרה, תאי BMM או RAW264.7 שהתרביתו במצע גידול המכיל 10 אחוז FBS ואנטיביוטיקה טופלו ב-10 מ"מ אקטאוזיד או תרכובות פנוליות כגון קוורצטין, לוטאולין, אפיגנין או אפיגאלוקיצ'ין (EGCG). מגיב WST-8 נוסף לתרביות לאחר 48 שעות של דגירה. לאחר דגירה של 4 שעות נוספות, הספיגה הספציפית ל-WST{10} נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, ארה"ב).

בדיקת ספיגת עצם

BMMs (16105 תאים/מ"ל) הושעו ב-a-MEM המכיל 50 ng/ml M-CSF ו-100 ng/ml RANKL, ואז חולקו על פני צלחת 24-באר מצופה בננו-גבישים של סידן פוספט (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, דרום קוריאה) בצפיפות של 26104 תאים/cm2 עם ובלי אקטאוזיד. לאחר דגירה של 7 ימים, התאים הוסרו מהצלחות עם 5 אחוז נתרן היפוכלוריט, והיווצרות בור נצפתה במיקרוסקופ אופטי. השטח הנספג נמדד גם על ידי מנתח תמונה והובע כאחוז מערך הבקרה.

Western Blot Analysis

ליזטים של חלבונים שלמים הוכנו במאגר תמוגה כמתואר במקום אחר [26]. חלבונים ציטוסוליים וגרעיניים הוכנו כמתואר קודם [25]. כמויות שוות של תמצית חלבון הופרדו על ידי 12-15 אחוז SDS-PAGE והוספו על גבי ממברנות פוליוויניל דיפלואוריד. הכתם נבדק עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4uC לפני דגירה עם נוגדן משני במאגר חוסם למשך שעה. הכתמים פותחו עם כימילומינסנציה משופרת (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, בריטניה) ונחשפו לסרטי רנטגן (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, ארה"ב).

מבחן פעילות MAPK

תאים טופלו מראש באקטאוזיד למשך 2 שעות ולאחר מכן עוררו עם RANKL למשך -30 דקות נוספות. פעילויות MAPK נקבעו באמצעות ערכות בדיקה אימונומטריות, כגון ערכת בדיקת p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, ארה"ב), ערכת בדיקת אנזים p-ERK (Assay Designs), וערכת ELISA לכריך p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, ארה"ב). כל ההליכים פעלו לפי הוראות היצרן, והספיגה נמדדה על ידי קורא מיקרו-לוחיות.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

תגובות קשירת DNA-חלבון בוצעו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם 10-15 מ"ג חלבון במאגר של 20 מ"ל המכיל 1 מ"ג/מ"ל BSA, 0.5 מ"ג/מ"ל פולי (dI-dC), 5 אחוז גליצרול ,1 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF, 10 מ"מ Tris-Cl (pH 7.5), 50 מ"מ NaCl, 30,000 CPM של [a-32P] אוליגונוקלאוטידים המסומנים dCTP, ומקטע Klenow של DNA פולימראז. הדגימות הופרדו על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד של 6 אחוז, אשר יובשו ונחשפו לסרט רנטגן (Eastman Kodak Co.) למשך 12-24 שעות ב-270uC. רצפי פריימר האוליגונוקלאוטידים הספציפיים ל-NF- היו 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 ו-39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB Luciferase Assay

מקרופאגים RAW264.7 ב24-צלחות באר הועברו עם 0.8 mg kB-luciferase reporter vector באמצעות 2 מ"ל של Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) לפי הוראות היצרן. ב-24 שעות לאחר ההעברה, התאים עוררו עם RANKL בנוכחות והעדר שלאקטאוזידלמשך 24 שעות. תאים הושעו מחדש במאגר תמוגה כתב של 100 מ"ל (פרומגה, מדיסון, WI, ארה"ב). כמויות שוות של דגימות חלבון הונחו ב-96- microplates היטב ועורבבו עם מצע לוציפראז. הארה נמדדה על ידי שימוש ב-microplate luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, גרמניה). בניסוי זה, פפטיד מעכב NF-B חדיר (BIOMOL, Butler Pike, PA, ארה"ב) שימש כמעכב kB חיובי.

מדידת ציטוקינים

תאי BMM או RAW264.7 עוררו עם RANKL בנוכחות אקטאוזיד ב24-צלחות תרבית באר. לאחר 48 שעות של דגירה, סופרנטנטים מתרבית נאספו והוערכו על ידי ELISA באמצעות ערכות OptEIATM ספציפיות ל-TNF-a-, IL-1b-ו-IL-6- בהתאם להוראות היצרן.

תגובת שרשרת של תעתוק פולימראז בזמן אמת (RT-PCR)

ביטוי ה-mRNA של סמנים אוסטאוקלסטיים, כגון c-Fos, NFATc1 ו-TNF-a, נקבע על ידי RT-PCR בזמן אמת. בקצרה, RNA כולל מופק ממקרופאגים עם Trizolreagent לפי הוראות היצרן (Invitrogen). cDNA סונתז עם 1 מ"ג של RNA כולל באמצעות SuperScriptReverse Transcriptase II ו-primers (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, ארה"ב) שימש לזיהוי הצטברות של מוצר PCR במהלך רכיבה על אופניים עם מערכת זיהוי הרצף ABI 7500 (AppliedBiosystems). לאחר דנטורציה ב-95uC למשך 10 דקות, PCR היה

מדידה של ROS תוך תאי

תמיסת מניות של 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, גרמניה) הוכנה ב-DMSO ואוחסנה ב-220uC בחושך. בקצרה, BMMs (106 תאים/מ"ל בצלחות של 6-בארות) תורבו עם 50 ng/MLM-CSF במשך 24 שעות ולאחר מכן טופלו בריכוזים שונים (0-10 מ"מ) של אקטאוזיד 2 שעות לפני גירוי עם 100 ng/mlRANKL. לאחר 1 שעה של דגירה משותפת, תאים אלה הודגרו לאחר מכן עם 25 מ"מ DCFH-DA למשך 30 דקות. הקרינה הירוקה של 29,79-dichlorofluorescein (DCF) תועדה ב-515 ננומטר (FL 1) באמצעות מערכת FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, ארה"ב), ו-10,000 אירועים נספרו לכל מדגם.

אינדוקציה של אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי כריתת שחלות

נקבות עכברי ICR (בנות 6 שבועות) שימשו למחקר זה. עכברים עברו ניתוח דמה (Sham, n=10) או ניתוח שחלה ניתוחי (OVX, n=20) בהרדמה. שבוע לאחר הניתוח, חולקו עכברי OVX באופן אקראי ל-2 קבוצות של 10 עכברים כל אחת: OVX דו-צדדי ו-OVX דו-צדדי בתוספת 200 מ"ל PBS המכילים 1 mM אקטאוזיד דרך הפה (קבוצת AC). אוראליאקטאוזידניתנה אחת ל-3 ימים במשך 8 שבועות לאחר הניתוח, ואותה כמות של PBS ניתנה לקבוצות Sham ו-OVX. לאחר יום אחד מהמתן האחרון, עכברים הוקרבו ולאחר מכן נותחו פרמטרים ביוכימיים בסרום ובמבנה העצם 3-מימדי.

קביעת פרמטרים ביוכימיים בסרום

דגימות דם נאספו באמצעות ניקור לב והסרום נאסף באמצעות צנטריפוגה. דגימות סרום אוחסנו ב-280uC לצורך ניתוח של פרמטרים ביוכימיים. רמות הסרום של IL-1b ו-IL-6 נאמדו על ידי שימוש בערכת ELISA כמתואר לעיל, בעוד שפעילות פוספטאז אלקליין (ALP) נקבעה על ידי שימוש במבחן קולורימטרי ביוכימי שמודד את כמות p -ניטרופנול המופק ממצע p-nitrophenol פוספט, כמתואר במקום אחר [27]. כדי להעריך את הסמנים הביולוגיים של היווצרות וספיגת העצם, נקבעו גם רמות OC, סידן ו-TRAP5b בסרום בהתאם להוראות היצרן.

ניתוחים של מבנה עצם ופרמטרים מורפומטריים

עצם הירך של עכברים (קבוצות Sham, OVX ו-AC) נותחו ומלאו בתמיסת מלח פיזיולוגית לצורך בדיקה מכנית. החוזק המכני של עצם הירך נמדד כמתואר במקום אחר [28]. עומס השבר נרשם ככוח שיא בניוטון בנקודה שבה הפיר האמצעי של שבר עצם הירך הימני. בנוסף, עצם הירך הקלה של כל חיה נותחה היסטומורפומטרית באמצעות מערכת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray System, Kontich, בלגיה). בקצרה, העצמות באחסון של 4 אחוזים של פורמלדהיד יובשו באופן שטחי על רקמת נייר לפני שהם עטופים בניילון נצמד או בפרפילם, כדי למנוע ייבוש במהלך הסריקה. כל עצם עטופה בניילון הונחה בשפופרות קצף פלסטיק/פוליסטירן שהותקנו בצורה אנכית אופקית בתא דגימת הסורק 1076 להדמיית מיקרו-CT. הסריקה בוצעה באמצעות מתח מקור של 100 קילו וולט וזרם מקור של 140 mA ברזולוציה של 35 מ"מ. מודלים תלת מימדיים של עצמות הטראבקולריות של עצם הירך שוחזרו באמצעות SkyScan CT Analyzer גרסה 1.11. הפרמטרים המבניים כגון צפיפות מינרלים של עצם טרבקולרית (BMD, g/cm3), אחוז נפח עצם (נפח עצם (BV)/נפח רקמה (TV), אחוז), עובי (Tb.Th, mm), הפרדה (Tb.Sp) לאחר מכן נמדדו , מ"מ), ומספר (Tb.N, 1/mm).

בדיקת בידול אוסטאוגני ומינרליזציה

תאי מח עצם שהותרבו ב{{{{10}}}}צלחות תרבית היטב טופלו ב-DAG (10 nM dexamethasone, 50 mM ascorbic acid, and20 mM b-glycerophosphate) בנוכחות 10 mM acteoside. לאחר שבועיים של התמיינות, התאים נקבעו עם אתנול קר כקרח 70% (נפח/וול) למשך שעה אחת והוצבעו ב-0.2% מים מזוקקים של Alizarin Red Sin למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שהתאים נמחקו ויובשו באוויר, צלחות תרבית התאים הוערכו במיקרוסקופ אור באמצעות מיקרוסקופ הפוך (Nikon TS100, יפן). כדי לכמת את כמות הצבע האדום, הכתם חולק עם 10 אחוז אצטיל פירידיניום כלוריד על ידי ניעור במשך 20 דקות והספיגה נמדדה ב-560 ננומטר. כמות הסידן שהופקדה בשכבות התאים נמדדה גם באמצעות ערכת סידן (Wako Chemical Inc. Osaka, יפן) לפי הוראות היצרן. בנוסף, הביטוי של סמני mRNA ספציפיים לעצם, כגון גורם שעתוק הקשור ל-run-2(Runx2), osterix, bone sialoprotein (BSP) ו-OC נקבע על ידי RT-PCR בזמן אמת. פריימרים של אוליגונוקלאוטידים של סמנים אלו תוכננו בגדלים של פחות מ-200 bp באמצעות PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) כמתואר במקומות אחרים[27].

ניתוח סטטיסטי

אלא אם צוין אחרת, כל הנתונים מבוטאים כסטיית התקן הממוצעת (SD) של 3 ניסויים עצמאיים או יותר. נעשה שימוש ב-ANOVA חד כיווני להשוואות מרובות באמצעות תוכנת SPSS גרסה 12.0. ערך p ,0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

אקטאוזיד מעכב היווצרות אוסטאוקלסט על ידי מקרופאגסין באופן תלוי מינון

כדי לאמת את ההשפעה של אקטאוזיד על התמיינות BMM לאוסטאוקלסטים, התאים תורבו בריכוזים שונים (0-20 מ"מ) של אקטאוזיד במשך 7 ימים בנוכחות 50 ננוגרם/מ"ל M CSF ו-100 ננוגרם/מ"ל RANKL . אקטאוזיד הפחית את מספר האוסטאוקלסטים באופן תלוי מינון. כאשר התאים טופלו מראש ב-10 mM acteoside למשך 2 שעות, מספר האוסטאוקלסטים ירד ב-43 אחוזים בהשוואה לתאים שנוספו עם M-CSF ו-RANKL (איור 1A). איור 1B מציג את ההתמיינות האוסטאוקלסטית בתיווך RANKL ואת העיכוב שלה על ידי טיפול משולב עם אקטאוזיד. בהתאם לתוצאה זו, טיפול מקדים באקטאוזיד הפחית את ההתמיינות מגורה של RANKL של תאי RAW264.7 ויצירת אוסטאוקלסטים (איורים 1C ו-D). כאשר הפוטנציאל האנטי אוסטאוקלסטי של אקטאוזיד על BMMs הושווה לפוטנציאל האנטי-אוסטאוקלסטי של מספר תרכובות פנוליות באותו ריכוז (10 מ"מ), הלוטאולין הראה את הפעילות הגבוהה ביותר (איור 2A). עם זאת, לוטאולין, קוורצטין או אפגנין עצמו הפחיתו את הכדאיות של התאים (איור 2B). כל התרכובות עיכבו התמיינות אוסטאוקלסטית על ידי מקרופאגים RAW264.7 עם הפעילויות היחסיות הבאות: לוטאולין. quercetin=apigenin .EGCG=אקטאוזיד (איור 2C). Luteolin, quercetin, או apigenin עצמו גם הראו את הכדאיות המופחתת של התאים (איור 2D). לעומת זאת, טיפול בקוורצטין רק גרם להפחתה משמעותית של הכדאיות הן בתאי BMM והן בתאי RAW264.7, כאשר תאים אלו נחשפו ל-10 מ"מ מכל תרכובת במשך יומיים עם 50 ננוגרם/מ"ל M-CSF, 100 ננוגרם/מ"ל RANKL, או שניהם (נתונים לא מוצגים). כאשר הריכוז של תרכובות אלה נדרש לעכב 50 אחוזים של

היווצרות אוסטאוקלסטים ב-BMMs (IC50) חושבה באמצעות עקומות ריכוז-פעילות, ה-IC50 של אקטאוזיד, קוורצטין, לוטאולין, אפיגנין ו-EGCG היה 5.1, 2.3, 2.6, 4.8 ו-6.6 mM, בהתאמה (איור 2E). תוצאה זו הייתה דומה למקרה שבו נבדקו מקרופאגים RAW264.7. נתונים אלו הצביעו על כך שללוטאולין ולקוורצטין יש פעילויות אנטי-קלסטוגניות גבוהות יותר מאשר לאקטאוזיד. לעומת זאת, לקוורצטין ב-IC50 הייתה גם השפעה רעילה קלה על התאים (נתונים לא מוצגים).

אקטאוזידמעכב ספיגת עצם על ידי MacrophagesActeoside גם מנע ספיגת עצם בתיווך RANKL באופן תלוי מינון, כפי שנמדד על ידי מערכת מודל במבחנה (איור 3A). ספיגת עצם הייתה מעוכבת באופן משמעותי כאשר BMMswere דגירה עם 1 mM acteoside (איור 3B). טיפול באקטאוזיד של 10 מ"מ החליש כמעט לחלוטין את היווצרות הבור המושרה על ידי RANKL על ידי BMMs. באופן דומה, אקטאוזיד הפחית את ספיגת העצם בתאי RAW264.7 מעוררי RANKL (איורים S2A ו-B). היכולת שלאקטאוזידלעכב את ספיגת העצם היה תלוי בעיתוי הטיפול ביחס לגירוי RANKL. Acteoside (10 mM) שנוסף 4 ימים לאחר גירוי RANKL לא הפחית את היווצרות הבור ב-BMMs, בעוד שהוא דיכא את מספר האוסטאוקלסטים שנוצרו (איור 3C). תוצאה שונה זו נבעה בחלקה מאזור הבור שכבר נוצר לאחר 4 ימים של היווצרות גירוי RANKL (איור 3D).

אקטאוזידמווסת ירידה במסלולי איתות RANKL מוקדם

RANKL משרה הפעלה של 3 MAPKs ידועים ו-NF-kB במבשרי אוסטאוקלסטים, והפעלה זו נדרשת להתמיינות מוקדמת של אוסטאוקלסטים. כדי להבין את המנגנונים האפשריים שבאמצעותם אקטאוזיד מעכב אוסטאוקלסטוגנזה, חקרנו את ההשפעה של אקטאוזיד על MAPKs והפעלת NF-B במקרופאגים. תאי BMM ותאי RAW264.7 טופלו מראש עם 10 מ"מ אקטאוזיד למשך 2 שעות ולאחר מכן גירוי עם 100 ננוגרם/מ"ל RANKL למשך 30 דקות. זרחון MAPK נבדק על ידי Western blotting ואנליזה אימונומטרית. RANKL גרמה לזרחון של תאי p38, ERK ו-JNK inBMMs (איור 4A) ו-RAW264.7 (איור 4B). Acteoside מנע את העליות הנגרמות על ידי RANKL ב-p-p38, p-ERK ו-p-JNK. תוצאה זו נתמכה על ידי ניתוח אימונומטרי, אשר אותו טיפול מקדים עם 10 מ"מ אקטאוזיד עיכב באופן משמעותי את רמות ה-MAPK המפוספסים במקרופאגים אלה (איור 4C). טיפול RANKL הגביר את הקישור ל-DNA של NF-kB, בעוד אקטאוזיד עיכב הפעלה הנגרמת על ידי RANKL של קישור NF-kB-DNA (איור 5A). עיכוב זה היה בולט יותר ב-BMMs מאשר בתאי RAW264.7. Acteoside גם הפחית את זרחון p65 ו-IkBa מגורה ב-RANKL בתאי BMMs ו-RAW264.7 (איורים 5B ו-C). הוספת 10 mMacteoside עיכבה כמעט לחלוטין הן את הפירוק והן את ההפעלה של IkBa ב-BMMs (איור 5B). כדי לאשר עוד יותר שהפעלת NF kB מעורבת בפעולה של אקטאוזיד, מבני kB פרומטור-luciferase הועברו באופן זמני לתאי RAW264.7. לתאים שהודגרו עם 100 ng/ml RANKL הייתה פעילות מקדם קילו-בייטים גבוהה יותר 3-, שהוחלשה באופן משמעותי על ידי 10 mM אקטאוזיד (איור 5D).

אקטאוזיד מדכא את הייצור של ציטוקינים דלקתיים ואת הביטוי של TNF-a, c-Fos ו-NFATc1in מקרופאגים מעוררי RANKL

TNF-a, IL-1b, ו-IL-6 חשובים ביצירת ותפקוד אוסטאוקלסטים, המתווכים על ידי איתות NF-kB במקרופאגים מעוררי RANKL. RANKL עורר את הייצור של ציטוקינים אלה, וייצור זה הופחת בצורה ניכרת על ידי טיפול מקדים של 10 מ"מ אקטאוזיד ב-BMMs (איור 6A). באופן דומה, אקטאוזיד החליש את הייצור המושרה על ידי RANKL של ציטוקינים, למעט IL-6, במקרופאגים RAW264.7 (איור S3). כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של פעולת האקטאוזיד באוסטאוקלסטוגנזה, בדקנו עוד את השפעת האקטאוזיד על ביטוי TNF-a, c-Fos ו-NFATc1. RANKL הסדיר את ביטוי ה-mRNA של גורמים אלה בתאי BMM ו-RAW264.7 (איורים 6B ו-C). טיפול מקדים ב-10 mM אקטאוזיד עיכב באופן משמעותי את הביטוי המושרה על ידי RANKL של גורמים אלו בשניהם

BMMs ותאי RAW264.7. טיפול מקדים באקטאוזיד גם הפחית מאוד את רמות החלבון של c-Fos ו-NFATc1 ב-BMMs מעוררי RANKL (איור 6D). תוצאות אלו מצביעות על כךאקטאוזידמווסת מטה את RANKL הגורם לתווכים של יצירת אוסטאוקלסטים ברמות הגנים והחלבון.

Acteoside מקטין את יצירת ROS תוך תאית ב-BMMs באופן תלוי מינון

מכיוון שידוע שייצור ROS תוך תאי נמצא בקורלציה עם אוסטאוקלסטוגנזיס מגורה של RANKL, חקרנו האם אקטאוזיד מעכב את ייצור ROS במהלך התמיינות אוסטאוקלסטית בתיווך RANKL באמצעות צבע חדיר לתאים, רגיש לחמצון, DCFH-DA. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי אות הקרינה הממוצע הספציפי ל-DCF ב-BMMs הועבר ככל הנראה ימינה לאחר גירוי עם RANKL, בהשוואה לתאי הבקרה הבלתי מטופלים (איור 7A). שינוי זה היה דומה למקרה שבו נצפו מקרופאגים RAW264.7 לאחר גירוי RANKL (נתונים לא מוצגים). טיפול ב-BMMs עם acteoside הפחית את עוצמת האות של DCF באופן תלוי מינון. טיפול מקדים עם 10 מ"מ אקטאוזיד הפחית כמעט לחלוטין את רמות ה-ROS התוך-תאי שנוצר במהלך התמיינות אוסטאוקלסט לרמות הבקרה הלא מטופלות (איור 7 ב).

מתן אקטאוזיד דרך הפה מעכב שינוי בסמנים ביוכימיים אוסטאופורוטיים ואובדן עצם בעכברים שעברו שחלות

כדי לחקור את ההשפעה של אקטאוזיד על אובדן עצם, הכנו מודל של בעלי חיים אוסטאופורוטיים על ידי כריתת שחלות. לא היה הבדל משמעותי במשקל הגוף בין OVX ל-Shamice במהלך תקופת הניסוי (נתונים לא מוצגים). לקבוצה היו רמות סרום גבוהות יותר באופן משמעותי של IL-1b ו-IL-6 בהשוואה לקבוצת Sham (איור 8). עליות הנגרמות על ידי כריתת שחלות בציטוקינים דלקתיים אלו הוחלשו על ידי מתן אקטאוזיד פומי (קבוצת AC). רמות הסרום של סמני מחזור עצם כגון ALP, סידן, TRAP5b ו-OC עלו באופן משמעותי בקבוצת OVX. מבין הסמנים האוסטאופורוטיים הללו, הרמות המוגברות של סידן, TRAP5b ו-OC בעכברי OVX עוכבו ככל הנראה על ידי טיפול באקטאוזיד, בעוד שרמת ALP בסרום לא השתנתה על ידי הטיפול. עומס השבר המרבי הממוצע לאמצע ציר הירך הימני היה נמוך משמעותית בקבוצת OVX מאשר בקבוצת Sham (איור 9A). הטיפול באקטאוזיד העלה את גיבוי השבר המרבי לזה של קבוצת דמה. כאשר העצם הקורטיקלית של עצם הירך נותחה ונצפה במיקרוסקופיה אופטית, המאפיינים האוסטאופורוטיים המוצגים בקבוצת OVX נעלמו כמעט לחלוטין בעכברי AC (איור 9B). כדי לאמת את ההשפעה של אקטאוזיד על מודל האוסטיאופורוזיס המושרה על ידי OVX, נותחו פרמטרים מורפולוגיים של BMD ופרמטרים עצם בטרבקולר של עצם הירך הפרוקסימלית הקלה על ידי מיקרו-CT. כפי שמוצג באיור 9C, נמצא שינוי בארכיטקטורת הטרבקולרית הירך בעכברי OVX, בעוד ששינוי זה הצטמצם על ידי טיפול באקטאוזיד. התוצאות מניתוח המיקרו-CT גילו ש-BMD, מדד לחוזק העצם, ירד באופן דרמטי בעכברי OVX (איור 9D). בהשוואה לקבוצת Sham, עכברי OVX הראו גם שינויים משמעותיים ב-BV/TV, Tb. Sp, ו-Tb. נ, אך לא Tb.Th. טיפול באקטאוזיד פומי בעכברי OVX מנע באופן משמעותי את השינוי ב-BMD וכן ב-BV/TV וב-Tb.N.