אוסטאופורוזיס היא בעיה מרכזית בבריאות הציבור עבור האוכלוסייה ההולכת ומזדקנת בעולם

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:אוסטאופורוזיס היא בעיה משמעותית בבריאות הציבור ברחבי העולם, כאשר אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר כתוצאה ממחסור באסטרוגן מביא לכ-3/4 מהמקרים. במחקר זה, 18 כבשות מרינו עתיקות הועברו לחיקום שחלות, ו-10 היו ביקורת. שלוש מהכבשים שעברו ניתוח שחלות טופלו מדי שבוע ב-400 מ"ג מתילפרדניזולון למשך 5 חודשים ושלוש טופלו מדי שבוע למשך חודשיים, ולאחר מכן תקופת החלמה של 3-חודש. לאחר חודשיים, חמש חיות ביקורת ושש בעלי חיים שעברו הרדמה. לאחר 5 חודשים, כל הכבשים הנותרות הורדמו. דגימות כליה נאספו לאחר המוות לצורך ניתוח qPCR של NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA ו-NCX1. לכבשים שעברו שחלות היה ביטוי VDR גדול יותר באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות אחרות. כבשים שעברו שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ואחריה המתת חסד לאחר 5 חודשים הראו הבדלים משמעותיים בביטוי הגנים TRPV5, CYP24A1 ו-klotho בהשוואה לקבוצות אחרות. הבדלים בביטוי קלוטו היו הבולטים ביותר לאחר התאמה עבור מדדים חוזרים (p=0.1). Klotho ידוע כהורמון ה"אנטי אייג'ינג" ומעורב בחילוף החומרים של סידן וזרחן. Klotho עשוי להיות מעורב בהתאוששות של צפיפות מינרל העצם בכבשים שעברו חיסול שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן המתת חסד לאחר 5 חודשים. מומלץ מחקר נוסף על תפקידו של קלוטו.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מילות מפתח:אוסטאופורוזיס; כבשים; ויטמין די; פוספטינג; qPCR; מטבוליזם של סידן; חילוף חומרים של זרחן; קלוטו

1. הקדמה

אוסטאופורוזיס היא בעיה מרכזית בבריאות הציבור עבור אוכלוסיית העולם ההולכת ומזדקנת, שעלתה לארצות הברית של אמריקה כמעט 17 מיליארד דולר בשנת 205 וצפוי לגדול ל-25 מיליארד דולר בשנת 2025 [1,2]. כ-70-75 אחוזים מנטל האוסטיאופורוזיס נובע מאוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אצל נשים [1], אוסטאופורוזיס ראשוני לפיו מחסור באסטרוגן מביא לירידה ביצירת עצם ולעלייה בספיגת עצם, מה שמוביל לירידה במסת העצם ושבריריות העצם [3] . אוסטאופורוזיס עשויה להתרחש גם משנית לסיבות ספציפיות, כגון טיפול בגלוקוקורטיקואידים. הכבשה היא מודל בעל חיים גדול מבוסס למחלות שלד אנושיות שונות, כולל אוסטאופורוזיס[4]. אחד היתרונות של מודל בעל חיים גדול, כמו הכבשה, הוא היכולת לבדוק שתלים אורטופדיים, טכניקות כירורגיות וחומרים ביולוגיים [4] בנוסף, הכבשה בעלות נמוכה יחסית, קלה לטיפול ומספקת חומר רב לבדיקה. [4,5].

דגמי הכבשים הנפוצים ביותר של אוסטיאופורוזיס הם הכבשה שעברה 12 חודשים לאחר הניתוח והכבשה 6-החודשית עם חוסר סידן וויטמין D הניתנת לגלוקוקורטיקואידים[4]. על ידי שימוש בשילוב של גורמים ידועים מעוררי אוסטאופורוזיס כולל כריתת שחלות, טיפול בגלוקוקורטיקואידים ודיאטה דלת סידן, הצלחנו לבסס מודל כבשים של אוסטאופורוזיס תוך 5 חודשים בלבד [6,7], ובכך להפחית את הדיור, הלידה, ועלויות הזנה הכרוכות בפיתוח המודל. במודל זה, נמצא כי כריתת שחלות מעלה את ריכוזי הסרום של טלופפטידים מסוף C של קולגן מסוג I (CTX-I, סמן ספיגת עצם) ואוסטאוקלצין (סמן מחזור עצם) בהשוואה לכבשי ביקורת. לכבשים שקיבלו טיפול בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים היו ריכוזי CTX-I גבוהים יותר בסרום וריכוז אוסטאוקלצין בסרום נמוך יותר. בנוסף, צפיפות עצם עמוד השדרה הירך והמותני וצפיפות העצם הנפחית הכוללת והטרבקולרית של השוקה הפרוקסימלית היו נמוכות יותר בקבוצות שטופלו בניסוי בהשוואה לקבוצות הביקורת, במיוחד עבור כבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים שעברו שחלות [6]. חילוף החומרים של חומצות אמינו ושומנים נמצא גם השתנה בכבשים שעברו ניתוח בשחלות וכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים [7].cistanche wirkungשינויים דומים נמצאו גם במודלים אחרים של אוסטיאופורוזיס ביצי [8].

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

גנים מגיבים לוויטמין D ומערכת הפוספטציה לא נחקרו בעבר במודלים של כבשים שבוצעו בשחלות. ויטמין D, שמתוכו 1,25-דיהידרוקסיויטמין D הוא הצורה הפעילה, מוביל בסופו של דבר לעלייה בריכוזי סידן וזרחן מיוננים בפלזמה על ידי קשירה לקולטן ויטמין D (VDR)-retinoid X הטרודימר ושינוי ביטויים של ויטמין רבים גנים מגיבים ל-D, כגון חלבונים קושרי סידן (calbindin D9 ו-28k (CalD9k, CalD28k)) ותעלות סידן (קולטן חולף ערוץ קטיון פוטנציאלי של תת-משפחה V חבר 5 ו-6 (TRPV5, TRPV6), קלציום פלזמה ATPase (PMCA) , מחליף נתרן-סידן 1(NCX1)[9]. ייצור 1,25-דיהידרוקסיויטמין D הוא שלב מווסת היטב, לפיו הכליות לו הידרוקסילאז (CYP27B1) מזרז את ההמרה של 25-הידרוקסיויטמין D ל-1,25-dihydroxyvitamin D, והאנזים 24-hydroxylase(CYP24A1) מפרק גם 25-hydroxyvitamin D וגם 1,25-dihydroxyvitamin D לתוצרי לוואי לא פעילים.cistanche בריטניהמערכת הפוספטינג שולטת גם בריכוזי הזרחן והסידן בפלזמה[10]. הלינצ'פין במערכת זו הוא פקטור גדילה פיברובלסט 23, המיוצר על ידי אוסטאוציטים בעצם ושולט בעיקר על ריכוזי הזרחן בפלסמה על ידי קשירה לקו-פקטור קלוטו כדי להפחית את הביטוי של מעבירים משותפים של נתרן-פוספט (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. בשל ההשפעות הקשורות זו בזו של הורמון פארתירואיד ו-1,25-דיהידרוקסי ויטמין D, קביעת ההשפעות של FGF23 על חילוף החומרים של סידן הייתה מאתגרת, אך ישנן עדויות המצביעות על כך שהוא יכול לווסת את ספיגת הסידן והכליות במעיים ספיגה חוזרת של סידן[12,13].

לגלוקוקורטיקואידים יש השפעות רבות על חילוף החומרים של סידן וזרחן, כולל עיכוב ספיגת סידן במעיים, ירידה בספיגה מחדש של סידן צינורית בכליות וירידה בספיגה מחדש של זרחן בכליות [14-16]. בנוסף, מחקר קטן בדק את ההשפעה של מחסור באסטרוגן על גנים המגיבים לוויטמין D ומערכת הפוספטינג [17,18].

מודל כבשים אוסטיאופורוזיס שטופלו בגלוקוקורטיקואידים בניתוח שחלתי, סיפק הזדמנות להפיק מידע ראשוני על ההשפעות של טיפולים אלה על הביטוי של גנים המגיבים לפוספטינג וויטמין D בכליית הכבש. מטרות מחקר זה היו כפולות: (1) לקבוע אם כריתת שחלות או כריתת שחלות וטיפול בגלוקוקורטיקואידים שינו את הביטוי של ויטמין D וגנים הקשורים לפוספטציה בכליה; (2) לקבוע את הקשרים בין ויטמין D בכליות לגנים הקשורים לפוספטציה, ויטמין D בסרום וסמני מחזור עצמות בסרום (CTX-I ואוסטאוקלצין).

2. חומרים ושיטות

שיטות מפורטות לפיתוח מודל הכבשים של אוסטיאופורוזיס שעברו שחלות ומטופלות בגלוקוקורטיקואידים פורסמו בעבר [6]. בקצרה, כבשות מרינו בגיל (7-9 שנים,n=28) חולקו באופן אקראי לקבוצות: control(n=10)ovariectomized (OVX) (n=12), ovariectomized וטיפול בגלוקוקורטיקואידים (40 מ"ג מתילפרדניזולון בהזרקה תת עורית) מדי חודש למשך חודשיים ולאחר מכן ללא טיפול במשך 3 חודשים (n=3) וטיפול בגלוקוקורטיקואידים (400 מ"ג מתילפרדניזולון) חודשי למשך 5 חודשים (n=3) .ביופלבנואידים הדריםהכבשים אוכסנו ברפת והוזנו בדיאטת ביקורת (115 גרם/ק"ג סידן; 2.2 גרם/כבשה ליום) או דלת סידן (5 גרם/ק"ג סידן; 1 גרם/כבשה ליום) תרכיז גלולות כבשים [19]. דרישות התחזוקה לכבשה שאינה בהריון הן 1.2 גרם לכבשה ליום[19].

דגימות דם נאספו באמצעות ניקור ורידי צוואר חודשיים ו-5 חודשים לאחר הניתוח. Osteocalcin נמדד באמצעות ערכת Micro Vue Osteocalcin immunoassay, ו-CTX-I באמצעות ערכת IDS Serum CrossLaps ELISA, כפי שדווח בעבר. קליפורניה, ארה"ב). ריכוז 25-הידרוקסיויטמין D בסרום נמדד באמצעות כרומטוגרמה נוזלית של דילול איזוטופ; ספקטרומטריית מסה ראפיה ב-Endolab, Canterbury Health Laboratories, קרייסטצ'רץ', ניו זילנד.

לאחר חודשים, 5 גולדות מקבוצת הביקורת ו-6 מקבוצת ה-OVX הורדמו והורדו. לאחר 5 חודשים, גם הכבשים הנותרות הורדמו (קבוצת ביקורת n =5, OVX group n=6, OVX בתוספת 2m glucocorticoids n=3 ו-OVX plus 5m glucocorticoids n=5 ) ונכרת. דגימות כליה נאספו תוך 30 דקות ממוות וחולקו לשניים, כאשר דגימה אחת הונחה בפורמלין מבוצר נייטרלי של 10 אחוז ועובדה להיסטולוגיה, והשנייה קפאה בחנקן נוזלי ונשמרה בדרגה-80 עד לעיבוד המטוקסילין ו חלקים מוכתמים באאוזין נבדקו על ידי המחבר הראשי ואישרו את היעדר נגעים משמעותיים.

כל ההליכים הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת מאסי (מספר אישור 14/103) ובוצעו בהתאם לקוד ההתנהגות האתי לשימוש בבעלי חיים חיים למחקר באוניברסיטת מאסי, פאלמרסטון צפון, ניו זילנד.

מיצוי RNA ו-qPCR בוצעו כפי שתואר קודם [20,21]. בקצרה, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה) שימש לחילוץ RNA לפי הוראות היצרן. DNA גנומי הוסר עם Ambion Turbo DNA ללא (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. ריכוז ה-RNA נקבע באמצעות פלואורומטר Qubit 2.0 וערכת בדיקות טווח רחב של Qubit RNA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב), ואיכות ה-RNA הוערכה על ידי קביעת היחס 260/280 והרצה על ג'ל אגרוז. ערכת סינתזת cDNA של Transcriptor (Roche) שימשה לסינתזה של cDNA. כל תערובת תגובה של 20 μL הכילה 600 ננוגרם של RNA, 2.5 מיקרומטר אוליגו (dT), חיץ תגובה 8mM RT, 1 מ"מ dNTP, 10U U reverse transcriptase, 20 U RNase inhibitor, ומים ללא RNAse-Dnase. התגובה בוצעה ב-55 מעלות למשך 30 דקות, 85 מעלות למשך 5 דקות, ולאחר מכן צוננה ב-4 מעלות באמצעות Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב). qPCR בזמן אמת בוצע באמצעות מכונת ה-PCR בזמן אמת StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, ארה"ב). כל תערובת PCR הכילה 5 ul Power SYBR Green PCR תערובת מאסטר (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב), פריימרים קדימה ואחורה בריכוזים המפורטים בטבלה S1, 10 ng של cDNA, ולאחר מכן הרכיבו עד 10 μL עם RNase, מים ללא DNase. פרוטוקול ה-PCR כלל 95 מעלות למשך 20 שניות, 40 מחזורים ב-95 מעלות עבור ו-60 מעלות עבור, ולבסוף, עקומת התכה שנעה בין 60 מעלות ל-95 מעלות עם קצב חימום של 0.3 מעלות/15 שניות. מים ותערובת תגובה ללא תעתיק הפוך נכללו כביקורות שליליות בכל ריצת PCR, וכל הדגימות הופעלו כפולות. הגנים הבאים הוערכו: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA ו-NCX1. PKG1 ו-SDHA נמצאו בעבר כבטאים ביציבות בכליה כבשה [20], ודגימות נורמלו ביחס לביטוי של גנים אלה וליעילות הגנים באמצעות שיטת 2-AACt [22].

ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות R Studio 1.3.1093[23] עם גרסת R

4.0.3 וה-Tyverse, nlme 3.1-150 וגארי

2.1.2 חבילות. מודלים ליניאריים יושמו על נתוני הביטוי של קפל הגן שעבר טרנספורמציה. במודל הראשון, ביטוי גנים היה משתנה התוצאה, בעוד שקבוצה (ביקורת או OVX אך לא כולל כבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים) וזמן (הורדם ב-2 מ' או 5 מ') היו משתנים תלויים, עם מונח אינטראקציה (קבוצה: זמן). במודל השני, ביטוי גנים היה משתנה התוצאה, בעוד שהקבוצה (ביקורת, OVX, OVX עם טיפול בגלוקוקורטיקואידים במשך 2 מ' ו-OVX עם טיפול בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 מ') הייתה המשתנה התלוי.יתרונות cynomoriumכאשר משתני תוצאה מרובים (גנים) נבדקו עבור הבדלים בין קבוצות, ערכי p הותאמו לבדיקות מרובות באמצעות הליך ה-Holm הרציף [24]. ריכוזי סידן, זרחן ו-25-הידרוקסיויטמין D בסרום נבדקו במודלים של ביטוי גנים, אך לא היו מובהקים, ובהתחשב בהיעדר הבדלים משמעותיים בין הקבוצות, הוסרו. בנוסף, נעשה שימוש בניתוח רכיבים עיקריים כדי להעריך אם נתוני הביטוי של קפלי הגנים שעברו טרנספורמציה של log10 היו שונים לפי קבוצה, זמן המתת חסד או ריכוז 25-hydroxyvitamin D בסרום. המתאם הזוגי והפיזור של Spearman שימשו כדי לחקור את המתאם בין נתוני ביטוי קיפול הגנים שעברו טרנספורמציה של log10 ואנליטים בסרום.

3. תוצאות

3.1. השפעת כריתת השחלות, הזמן מאז כריתת השחלות וטיפול בגלוקוקורטיקואידים על ריכוזי סידן, זרחן ו-25-הידרוקסיויטמין D בסרום

התוצאות המלאות עבור ריכוזי סידן, זרחן ו-25-הידרוקסיויטמין D בסרום בכל קבוצה מוצגות באיור 1." לא היו הבדלים משמעותיים בריכוזי הסידן, הזרחן וה-25-הידרוקסיויטמין D בסרום בין קבוצת דיאטת שחלות ודלה בסידן וקבוצת דיאטת סידן נאותה ללא שחלות, והזמן מאז כריתת השחלה של חודשיים ו-5 חודשים. תוצאות אלו מצביעות על כך שלניתוח כריתת שחלות בשילוב עם דיאטה דלת סידן לא הייתה השפעה על ריכוזי הסידן בסרום. כבשים שעברו כריתת שחלות במשך וטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשים, ולאחר מכן המתת חסד לאחר 5 חודשים, היו בעלי ריכוזי סידן נמוכים משמעותית בנסיוב (p =0.0462, adj R20.13) בהשוואה ל-5 מ' שבוצעו בשחלות בדיאטה דלת סידן ו-5 מ' שבוצעו בשחלות. דיאטה דלת סידן וכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים. עם זאת, בדיקה של הנתונים מעלה כי ייתכן שהדבר נובע מחיה אחת שהייתה היפוקלצמית (1.52 mmol/L, טווח התייחסות 2.0-2.7 mmol/L); הסרה. של החיה הזו הסירה כל משמעות.יקינתון מדברילכל שאר הכבשים היו ריכוזי סידן בסרום בטווח הייחוס. לא נראו הבדלים בריכוזי זרחן בסרום או 25-הידרוקסיויטמין D בכבשים שעברו 5 מ' עם שחלות וכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים.

3.2. השפעת כריתת השחלות והזמן מאז כריתת השחלות על ביטוי גנים הקשורים לוויטמין D ופוספטונין בכליה

ביטוי גנים של ויטמין D וגנים הקשורים לפוספטציה לא היה קשור לכריתת שחלות או לזמן מאז כריתת השחלה (איור 2). היוצא מן הכלל היה קולטן ויטמין D (VDR), לפיו לקבוצת OVX היה ביטוי VDR גדול יותר באופן משמעותי (p=0.05, adj R2 0.16); עם זאת, משמעות זו נעלמה לאחר התאמה לאמצעים חוזרים ונשנים.

3.3. השפעת כריתת שחלות וטיפול בגלוקוקורטיקואידים על ויטמין D וביטוי גנים הקשורים לפוספטונין בכליה 5 חודשים לאחר הניתוח

התוצאות המלאות מוצגות באיור 3. ביטוי של PTH1R היה גדול יותר באופן משמעותי בכבשים OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים בהשוואה לקבוצות האחרות (p=0.04, adj R40.18), בעוד TRPV5 (p{ ביטוי {8}}.01, adj R20.31) ו-CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) היו גבוהים יותר באופן משמעותי בכבשים OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים בהשוואה לקבוצות האחרות.

הביטוי של קלוטו היה שונה באופן מובהק בין כל הקבוצות (p =0.01, adj R20.48), עם הביטוי הנמוך ביותר בכבשי הבקרה. כבשים OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים היו בעלי הביטוי הגבוה ביותר (p =0.002), אחריו כבשים OVX (p=0.008) ולאחר מכן כבשים OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים (p{ {10}}.03). עם זאת, כאשר בוצע התאמה למדידות חוזרות ונשנות, ביטוי הגנים לא היה שונה באופן משמעותי בין הקבוצות הללו, כאשר klotho הראה את ההבדל הגדול ביותר בכבשים OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים (p=0.1).

באופן דומה, הביטוי של ה-VDR היה שונה באופן משמעותי בין כל הקבוצות (p=0.03, adj R20.38). הביטוי הגדול ביותר של ה-VDR היה בכבשי OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשים (p=0.009), ואחריו כבשי OVX (p=0.01), ולאחר מכן כבשי OVX שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים (p=0.05), והביטוי הנמוך ביותר היה קיים בכבשי הבקרה.

3.4. PCA של ביטוי גנים כולל בין קבוצות

ניתוח PCA של OVX, בקרה והמתת חסד לאחר חודשיים ו-5 חודשים לא הצליח להפריד בין הקבוצות השונות (איור S1). PCL ו-PC2 הסבירו 69.6 אחוז מהשונות. באופן דומה, ניתוח PCA של קבוצות שהורדו לאחר 5 חודשים גם לא הצליח להפריד בין הקבוצות השונות. PCL ו-PC2 הסבירו 53.2 אחוז מהשונות (איור S2). ניתוח PCA הראה שלא ניתן להסביר את ביטוי הגנים הכולל על ידי סידן וזרחן בסרום של 25-ריכוזי הידרוקסי ויטמין D (איור S3).

3.5. מתאם זוגי בין כל האנליטים וביטוי גנים

ללא קשר למצב כריתת השחלה, תכולת הסידן בתזונה, הזמן מאז כריתת השחלה (2 מ' או 5 מ'), או מצב הטיפול בגלוקוקורטיקואידים, ביטוי הגן NPT1 היה בקורלציה משמעותית וחיובית (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. דיון

תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שלטיפול בכבשים שעברו שחלות עם גלוקוקורטיקואידים הייתה ההשפעה הגדולה ביותר על ביטוי הגנים, בעוד לכריתת השחלה עצמה ולזמן מאז כריתת השחלות (חודשיים ו-5 חודשים) הייתה השפעה מועטה על ביטוי הגנים. בניתוח חד-משתני, הבדלים משמעותיים בביטוי הגנים TRPV5, CYP24A1 ו-klotho נראו בכבשים שעברו שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ואחריה המתת חסד לאחר 5 חודשים, וב-PTH1R בכבשים שעברו שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים. ההבדלים היו הבולטים ביותר בביטוי קלוטו לאחר התאמה למדידות חוזרות.

טומוגרפיה ממוחשבת היקפית כמותית של השוקה הפרוקסימלית של כבשים אלו הראתה שכריתת שחלות הפחיתה את צפיפות המינרלים הנפחית הכוללת של העצם (vBMD) ב-8 אחוזים, כריתת שחלות עם טיפול בגלוקוקורטיקואידים למשך 5 חודשים ב-27 אחוז וכריתת שחלות עם גלוקוקורטיקואידים לאחר 5 חודשים ו-5 חודשים. ב-13 אחוזים [6]. מעניין לציין ש-BMD טרבקולרי, אזור טרבקולרי ותכולת מינרלים של עצם טרבקולרית היו דומים או גבוהים יותר מהביקורות בכבשים שעברו אבחון שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים והורדו לאחר 5 חודשים, דבר המצביע על התאוששות של מסת העצם [6]. לגלוקוקורטיקואידים יש מספר השפעות מתועדות היטב על העצם שמובילות להתפתחות אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי גלוקוקורטיקואידים. השפעות אלו כוללות עיכוב היווצרות של תאי אבות אוסטאובלסטים ואוסטאובלסטים, הגברת אפופטוזיס אוסטאובלסט והפחתת ייצור אוסטאואידים, כולם מפחיתים את יצירת העצם [25,26]. במקביל, גלוקוקורטיקואידים מגבירים את ספיגת העצם על ידי הפחתת ביטוי OPG, הגדלת ביטוי RANKL, הגברת היווצרות אוסטאוקלסטים, הפחתת אפופטוזיס אוסטאוקלסטים והגברת הפרשת קתפסינים ומטאלפרוטאינים מטריקס על ידי אוסטאוקלסטים [25,26].

Klotho הוא מרכיב אינטגרלי של מערכת הפוספטינג, לפיה הוא נקשר לגורם גדילה פיברובלסט 23(FGF23) בכליה. קומפלקס klotho-FGF23 נקשר לאחר מכן לקולטן FGFR1IIC, שמתחיל מספר מסלולים תאיים ובסופו של דבר, מביא להגברת הוויסות של ביטוי 24-hydroxylase(CYP24A1) הכלייתי וויסות מטה של ​​לה-hydroxylase הכלייתי (CYP27B1) וצינורית הכלייתי. Cotransporters Na/P II (NPT2a ו-2c) [10]. הביטוי המוגבר (ההבדלים שבהם היו ניכרים ביותר לאחר התאמה למדידות חוזרות ונשנות) של קלוטו בכבשים על גלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן הורדם לאחר 5 חודשים עשוי להסביר את הביטוי המוגבר של CYP241 שנראה גם בקבוצת כבשים זו, למרות שאין הבדלים משמעותיים ב ריכוזי 25OHD בסרום.

Klotho ידוע כחלבון אנטי-אייג'ינג ולעכברים חסרי קלותו יש יצירת עצם נמוכה וספיגת עצם, מה שמוביל לאוסטאופניה במחזור עצמות נמוך [27,28]. בנוסף, פולימורפיזמים ספציפיים של גן קלוטו קשורים לירידה בצפיפות המינרלים של העצם בבני אדם [29,30]. קלוטו מסיס מגביר את הוויסות של חלבון תגובת צמיחה מוקדמת 1 (EGR-1) ומעורר ביטוי של סמני התמיינות עצם בתרבית תאי אוסטאובלסט [31] בנוסף, גלוקוקורטיקואידים יכולים לדכא את פקטור הגדילה של פיברובלסט 232]. אולי, ביטויי הקלותו הגדולים יותר בכבשים על גלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן מומתים לאחר 5 חודשים משקפים את תהליך ההחלמה של כבשה זו לאחר טיפול גלוקוקורטיקואידים, ובהתחשב בתפקידה ביצירת וספיגת העצם, אפשר להעלות על הדעת מניע מרכזי להתאוששות העצם ולפיכך, פוטנציאלית יעד טיפול לאוסטאופורוזיס בבני אדם.

עם זאת, לכבשי OVX היו גם ביטויי קלוטו מוגברים בהשוואה לכבשי ביקורת. באופן דומה, מחקר אחד בעכברים חסרי ארומטאז הראה שמחסור באסטרוגן העלה את רמות החלבון של קלותו, וטיפול באסטרדיול הפחית את ביטויי הקלותו בעכברים אלה [17]. בעכברים, האסטרוגן מוריד את ה-NPT2a בתהליך שאינו תלוי ב-klotho/FGF23 ו-PTH[18]. עם זאת, השפעה זו לא נראתה בכבשה שעברה שחלות במחקר הנוכחי. אחרת, יש מעט ספרות על ההשפעה של מחסור באסטרוגן על קלוטו. מחקר נוסף צריך לבחון את ההשפעות של כריתת שחלות וגם של גלוקוקורטיקואידים על ביטוי קלוטו, בהתחשב בתפקידו בהזדקנות ובמחלת כליות כרונית.

TRPV5 היא תעלת סידן אפיתל המתבטאת בעיקר בצינוריות המפותלות המרוחקות ובצינוריות המקשרות של הכליה [20,33]. תעלת TRPV5 פתוחה באופן מכונן אך עוברת אי-אקטיבציה תלוית סידן בשיתוף עם קלמודולין, חלבון בעל חישת סידן [34]. ניתן להגביר את ביטוי TRPV5 על ידי PTH ו-1,25(OH)D3 [35]. כבשה אחת שקיבלה גלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן הורדמה לאחר 5 חודשים הייתה היפוקלצמית, וריכוזי הסידן בסרום היו נמוכים משמעותית בכבשים בקבוצה זו בהשוואה לקבוצות האחרות. סביר, אם כן, שהביטוי המוגבר של TRPV5 הוא תוצאה של ירידה בריכוז הסידן בסרום בחיות אלו. גלוקוקורטיקואידים הוכחו כמפחיתים את ספיגת הסידן במעיים על ידי הפחתת הביטוי של TRPV6 ו-CalD9k [36,37] והגברת הפרשת סידן בשתן [14], אך היפוקלצמיה משמעותית מבחינה קלינית בקרב אנשים בריאים אינה שכיחה. באופן דומה, הכבשים עם ריכוז סידן נמוך בסרום לא הראו סימנים קליניים של טטניה היפוקלצמית. לחלופין, הביטוי המוגבר של TRPV5 בכבשים על גלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן הורדם לאחר 5 חודשים יכול לשקף את תהליך ההחלמה, לפיו כדי להחליף את תכולת ה-BMD, השטח והתכולה של מינרלים בעצמות, נדרשת ספיגה מוגברת של סידן מהכליה.

בכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים, ביטוי PTH1R גדל בהשוואה לקבוצות האחרות. בנוסף, בהשוואה לקבוצות אחרות, הייתה שונות קטנה בביטוי בין כבשים בקבוצה. למרות שלא נראו הבדלים בריכוזי הסידן בסרום בכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים, אולי זה יכול להיות קשור לפעולה מוגברת של PTH והקולטן שלו. ההשפעות של גלוקוקורטיקואידים על הפרשת PTH ופעולה אינן ברורות. כמה מחקרים בבני אדם מצאו שלמטופלים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים יש ריכוזי PTH מוגברים בסרום, יחד עם ירידה בספיגת סידן, הפרשת סידן מוגברת בשתן וירידה במסת העצם [38,39]. עם זאת, רוב המחקרים לא מצאו שינויים בריכוזי PTH בסרום בבני אדם בטיפול בגלוקוקורטיקואידים [38,40,41]. מחקר אחד הראה שאולי ההשפעה של גלוקוקורטיקואידים היא על שינוי הפרשת PTH, עם ההפרשה הפועמת המוגברת של PTH אצל אנשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים[4]. אחרים גם הראו ביטוי מוגבר של PTH1R בתאי גזע מזנכימליים ובתאים דמויי אוסטאובלסט בתגובה לטיפול בדקסמתזון [43,44]. ככזה, העלייה בביטוי PTH1R הכלייתי בכבשים שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך 5 חודשים נובעת ככל הנראה מ-5 חודשי הטיפול בגלוקוקורטיקואידים.

בעוד כריתת שחלות בשילוב עם דיאטה דלת סידן קלה הביאה לשינויים מינימליים בביטוי הגנים, נראה היה כי היא משנה את הביטוי של ה-VDR, כאשר כבשים שעברו כריתת שחלות בדיאטה דלת סידן קלה בעלות ביטוי VDR גדול יותר בהשוואה לכבשי ביקורת. זאת בניגוד למחקר על חולדות שעברו ניתוח שחלות לפיו אלו שניזונו מתזונה עם רמות סידן תקינות הראו ביטוי VDR כליות מוגבר, בעוד שאלו שניזונו מתזונה דלת סידן הפחיתו את ביטוי VDR [45]. קשה במחקר הכבשים הנוכחי להפריד את ההשפעה של כריתת שחלות על הביטוי הכלייתי של ה-VDR מהשפעת הדיאטה דלת הסידן. עם זאת, לא היו הבדלים משמעותיים בריכוזי הסידן בסרום בין הקבוצות (למעט קבוצת הגלוקוקורטיקואידים), מה שמעיד על כך שלדיאטה דלת סידן קלה הייתה השפעה מינימלית ואולי ההשפעות על ה-VDR נובעות מכריתת השחלות. עם זאת, יידרש מחקר נוסף כדי לחקור את הקשרים הללו.

שני מחקרים קודמים בחנו את הקשרים הנפרדים בין גנים המגיבים לוויטמין D, וגנים הקשורים לפוספטציה בכליות כבשים [20,21]. עם זאת, לא נבדקו קשרים בין ויטמין D ומסלולי הפוספטציה. מעניין לציין שהמתאמים המשמעותיים ביותר בין הגנים שדווחו בשני מאמרים אלה מתקיימים גם לגבי קשרי הגנים במחקר הכבשים הנוכחי הזה, מה שמצביע על עקביות בתוצאות בין מחקרים ובקשרים בין גנים אלה.תמצית סלסה cistancheמבין הקשרים המעניינים שלא דווחו קודם לכן, כפי שניתן לצפות בהתחשב בתפקידו המרכזי במטבוליזם של סידן, ביטוי של PTH1R היה בקורלציה גבוהה עם CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho ו-NPT2c. ביטוי של קלוטו היה מתאם חזק עם ביטוי גנים של TRPV5, מה שעולה בקנה אחד עם ספרות אחרת המראה כי קלוטו מגביר את ה-TRPV5 ומקדם ספיגה מחדש של סידן בכליות [46,47].

לרוע המזל, לא ניתן היה להפריד את הקבוצות השונות על סמך ביטוי גנים מגיב ויטמין D ופוספט באמצעות ניתוח PCA. זה כנראה נובע מהמגבלה העיקרית של מחקר זה - גודל המדגם הקטן. עם רק 3-6 בעלי חיים בכל אחת מהקבוצות, זה כנראה הגביל את היכולת לזהות הבדלים בביטוי גנים בין קבוצות.

5. מסקנות

התוצאות ממחקר זה מראות שההבדלים הבולטים ביותר בביטוי הגנים היו בביטוי קלוטו הכלייתי בכבשים שעברו ניתוח שחלות שטופלו בגלוקוקורטיקואידים במשך חודשיים ולאחר מכן תקופת החלמה של 5 חודשים. בהתחשב בקלוטו הוא הורמון ה"אנטי-אייג'ינג" ובעל תפקיד קריטי במטבוליזם של סידן ופוספט, ייתכן שהורמון זה מעורב באופן קריטי בהתאוששות של צפיפות מינרלים ושטח עצם טרבקולרית בכבשים מטופלות, ולכן עשוי להיות יעד טיפול לאוסטאופורוזיס בבני אדם. עם זאת, נדרש מחקר נוסף על ההשפעות של גלוקוקורטיקואידים וכריתת שחלות על קלוטו.

מאמר זה מופק מתוך Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals