תמצית עלי זית (OLE) פגיעה באקוופורין-2 המושרה על ידי וזופרסין באמצעות הפעלת קולטן חישת הסידן

למידע נוסף. איש קשר:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressin (AVP) מגביר את חדירות המים בשֶׁל הַכְּלָיוֹתצינור איסוף באמצעות הרגולציה של סחר באקוופורין-2 (AQP2). מספר הפרעות, כולל יתר לחץ דם והפרשת הורמון אנטי-דיורטי (SIADH) לא הולמת, קשורות להפרעות בהומאוסטזיס במים. הוכח כי תרכובות פיטו מסוימות מועילות לבריאות האדם. כאן, ההשפעות של תמצית עלי הזית (OLE) הוערכו באמצעות מודלים in vitro ו-in vivo. מחקרים קונפוקאליים הראו כי OLE מונע את טרנסלוקציית AQP2 המושרה על ידי וזופרסין לממברנת הפלזמה בתאי MCD4 ובחולדהכליות. דגירה עם OLE מפחיתה את העלייה התלויה ב-AVP של מקדם חדירות המים האוסמוטי (Pf). כדי להבהיר את המשפיעים האפשריים של OLE, הוערך סידן תוך תאי. OLE מגביר את הסידן התוך תאי באמצעות הפעלה של קולטן חישת הסידן (CaSR).NPS2143 , מעכב CaSR סלקטיבי, ביטל את ההשפעה המעכבת של OLE על חדירות מים תלוית AVP. ניסויים in vivo גילו שטיפול עם OLE מגביר את הביטוי של ה-mRNA של CaSR ומפחית את ה-mRNA של AQP2 במקביל לעלייה של ה-AQP2-מיRNA המיקוד-137. יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-OLE נוגד את פעולת ה-Vasopressin באמצעות גירוי של CaSR, דבר המצביע על כך שתמצית זו עשויה להועיל להחלשת הפרעות המאופיינות באיתות CaSR לא תקינים ומשפיעה על ספיגת מים מחדש בכליות.

עלי עץ הזית היו בשימוש נרחב כתרופות מסורתיות לריפוי מספר מחלות, במיוחד במדינות הים התיכון. עלים נצרכים בדרך כלל בתזונה האנושית כתמצית או אבקה להכנת חליטות או תה צמחים. ניתוח אפיון כימי גילה שעלי עץ זית מכילים מספר תרכובות ביו-אקטיביות שעשויות להשפיע על מחלות מסוימות כגון תסמונת מטבולית, דיסליפידמיה ויתר לחץ דם. בחולים עם יתר לחץ דם חיוני, OLE הפחית את לחץ הדם והפחתה מעט את הגליקמיה והקלצמיה. פוליפנולים רבים כגון oleuropein, hydroxytyrosol ו-tyrosol נמצאו מועשרים בתמצית עלה זית ירוק (OLE)5, והם ידועים כמעורבים במניעת מחלות מסוימות המאופיינות בעקה חמצונית. לכן, בשנים האחרונות, העניין בחקירת ההשפעות המועילות הפוטנציאליות של תמצית עלי זית גובר בקרב מדענים בתחומי מחקר שונים. OIE הראה השפעה אנטי-פרוליפרטיבית משמעותית בתאי מזותליומה ממאירים על ידי שינוי דינמיקת הסידן התוך-תאית, אולי מכוונת ל-T- סוג Ca2 פלוס ערוצי. מעניין לציין כי נמצא כי OLE מפעיל השפעות נוגדות יתר לחץ דם על יתר לחץ דם גנטי בחולדות עם יתר לחץ דם ספונטני (SHR), הקשורות לשיפור תפקוד כלי הדם*. ספיגת מים מופרזת ממלאת תפקיד חשוב בפתוגנזה של לחץ דם מוגבר. בחולים עם יתר לחץ דם, שטופלו בתמצית עלי זית, נמצאה הפחתה משמעותית של מספר גורמים דלקתיים הקשורים לירידה בלחץ הדם. חוץ מזה, אצירת מים מוגזמת מאפיינת מספר הפרעות כגון שחמת כבד, אי ספיקת לב והפרשת הורמון אנטי-דיורטי לא הולם (SIADH). הומאוסטזיס של מי הגוף נשלט בחוזקה על ידי ההורמון האנטי-דיורטי וזופרסין (AVP) המשתחרר במצב מיובש. AVP קושר את קולטן ה-V2R הממוקם שלו בממברנה הבסיסית שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאים עיקריים ובכך מפעילים את מסלול האות cAMP שגורם לטרנסלוקציה של שלפוחיות נושאות ה-aquaporin-2(AQP2) מבריכה תוך-תאית לממברנת הפלזמה האפיקלית שבה מתרחשת ספיגה חוזרת של מים. ברמה המולקולרית, מספר גורמים עשויים לווסת את מאזן המים הכלייתי. רמה מוגברת של סידן לומינלי הורידה את הסחר ב- AOP2 תלוי וזופרסין לטווח קצר באמצעות הפעלת הקולטן חושי הסידן (CaSR)1,12. מצד שני, הפעלת CaSR בתאי אפיתל פרוקסימלי צינורי כליות מונצחים באופן מותנה, מבודדים מהשתן האנושי, גרמה לעלייה משמעותית בסידן הציטוזולי והפחיתה באופן משמעותי את העלייה ב-cAMP שנוצר על ידי פורסקולין (FK), מפעיל ישיר של אדנילט cvclase3. , בתאי MCD4 של איסוף כליות, המבטאים באופן יציב את תעלת המים AOP2, גירוי של CaSR החליש את העלייה התלויה ב-cAMP בזרחן AQP2 בסרין 256 שהוא אירוע מרכזי במפל העברת האותות המופעל על ידי וזופרסין ובסופו של דבר הגדיל את חדירות המים4 ,15 יתר על כן, בכִּליָהפרוסות מהכליה הפנימית של עכבר המדולה, הפעלת ה-CaSR עם ה-Calcimimetic NPS-R568 גרמה לעלייה משמעותית ב-AQP2-מיקוד ה-miRNA-137, מה שאישר יחסי גומלין הדוקים בין מסלול האות CaSR ל-AQP{ {4}}חדירת מים תלויה.17. במחקר הנוכחי, ההשפעות של תמצית עלי הזית, שהתקבלו מזן Coratina המקומי, הוערכו על תפקוד AQP2 המושרה על ידי וזופרסין בתאי MCD4 של צינור איסוף כליות המבטאים ביציבות AOP2 וב-dDAVP חולדות מטופלות שהוזרקו עם התמצית. אנו מספקים ראיות לכך שטיפול ב-OLE נוגד את תגובת וזופרסין בתאי כליה, מה שעשוי להסביר בחלקו את השפעתו המשתנת. באופן מעניין, נראה שהאפקט הזה קשור להפעלה הנגרמת על ידי OLE של CaSR, קולטן הידוע כבעל משחק שלילי עם קולטן הוזופרסין12.

למד עוד השפעות של cistanche על הכליות

תוצאות

השפעות של OLE על תפקוד AQP2 המושרה על ידי וזופרסין בתאי MCD4. כדי לחקור את המעורבות האפשרית של OLE בתפקוד AQP2 תלוי וזופרסין,שֶׁל הַכְּלָיוֹתאיסוף תאי MCD4, המבטאים באופן יציב את קולטן וזופרסין 2(V2R) ו-AQP2 אנושי, שימשו כמודל ניסיוני18. מחקרים קונ-פוקאליים (איור 1A) גילו כי בהשוואה לתאים שטופלו ב-dDAVP, שבהם צביעת AQP2 התמקמה לממברנת הפלזמה האפיקלית, טיפול עם OLE מנע את לוקליזציה הממברנה של AOP2 המושרה על ידי גירוי עם dDAVP. בהתאם לתצפיות אלו, טיפול ב-OLE פגע בעלייה הנגרמת על ידי dDAVP של התגובה האוסמטית הזמנית (מצוין כ-1/t באיור.1B)(OLE/dDAVP=88.70±1.86 אחוזים, n=292 תאים לעומת dDAVP=206.8±5.49 אחוז ,n=186 תאים;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

השפעות של OLE בכליות של חולדות שהוזרקו עם OLE.

כדי להמשיך ולחקור את הפעולות של OLE, בוצעו מחקרים in vivo. באופן ספציפי, לחולדות הוזרקו OLE (250 מ"ג/ק"ג/יום) פעם ביום למשך שלושה ימים. לחלופין, חולדות טופלו יחד עם OLE, למשך 3 ימים, ו-dDAVP, למשך 30 דקות. הערכה של CaSR mRNA שבודד מצינור האיסוף הכלייתי של חולדות ועובד עבור PCR בזמן אמת (איור 6) חשפה עלייה משמעותית ב-CaSR mRNA ב-OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} חולדות לעומת שיעור קליקים=1.02±0.17, n=5 חולדות; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">כִּליָה, בוצעו אנליזה של Western blotting ומחקרים קונפוקאליים (איור 9). בחולדות שהוזרקו ב-OLE/dDAVP, הזרחון של AQP2 בסרין 256 הופחת משמעותית בהשוואה לרקמות הכליות של בעלי חיים שטופלו ב-dDAVP (OLE/dDAVP=0. 77±0.16, n=5 חולדות לעומת dDAVP=2.16±0.25,n=5 חולדות; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

דִיוּן

סידן הוא שליח תוך תאי חשוב המווסת שפע של פונקציות תאיות2. איתות לא תקין של סידן עלול להוביל למספר מחלות כולל אי ​​ספיקת לב, סרטן ויתר לחץ דם23. בקרה ספציפית של הביטוי והפעילות של חלבונים השולטים במספר אותות סידן תוך תאיים הוכחה כמוצלחת להתמודדות עם הפרעות רבות ולכן היא אטרקטיבית לפיתוח תרופות. מחקר זה מספק תובנות חדשות לגבי מנגנון הפעולה של OLE על ידי הצגת יכולתו לווסת איתות סידן תוך תאי באמצעות גירוי ה-CaSR המעורב בכוונון עדין של הסחר והביטוי של AQP2 המושרה על ידי וזופרסין. בתנאים פיזיולוגיים, AQP2 ממלא תפקיד חשוב בשליטה בהומאוסטזיס של מי הגוף25. גירוי המנגנון התוך תאי, המוביל לוקליזציה של AQP2 בממברנת הפלזמה האפיקלית, מביא לאגירת מים לא תקינה וכתוצאה מכך היפונתרמיה כמו בתסמונת של הפרשת הורמון אנטי-דיורטי (SIADH) לא מתאים, שחמת כבד ואי ספיקת לב - בעכבר. מודל של SIADH, הקשור לאי-ספיקה של מחלת כליות פוליציסטית 1, רמת הסידן התוך-תאי הבסיסית ירדה משמעותית בהשוואה לרמה שנמדדה בצינורות האיסוף של עכברים מסוג בר. סידן תוך תאי נמוך הוריד את פעילותם של אנזימים מסוימים כולל החלבון phosphatase PP2A וכתוצאה מכך עלה ויסות של זרחון AOP2 בסרין 2561. לעומת זאת. הפעלת ה-CaSR עם ה-Calcimimetic NPS-R568 העלתה את ריכוז הסידן התוך-תאי והפחיתה את רמת ה-cAMP בתאים חסרי PKD1. חשוב לציין, סידן ציטוזולי יכול להפחית את ה-Adenylated cyclase3 המעכב סידן, ובכך לכוונן עדין את הרמה התוך-תאית של cAMP. בתאי MCD4, אכן, גירוי של CaSR עם NPS-R568 הפחית את AQP2-pS256 באמצעות עיכוב האדנילט cyclase4. במחקר זה, טיפול ב-OLE מנע את העלייה התלויה בוואזופרסין של cAMP ו-AOP2-pS256, אולי משנית לעלייה בריכוז הסידן התוך תאי. יש לציין, חשיפה למקור חיצוני של cAMP באמצעות 8-Br-cAMP חדיר, מונעת באופן משמעותי את ההשפעה המעכבת של OLE על מסלול V2R.

רמה מוגברת של סידן ציטוזולי עלולה להוביל למוות תאי ולאפופטוזיס. עם זאת, עלייה מתמשכת בסידן התוך תאי מ-250 ננומטר ליותר מ-600 ננומטר קידמה הישרדות נוירונים4. בתאי MCD4, טיפול ב-OLE ב-0.1 מ"ג/מ"ל אינו מוצג השפעה ציטוטוקסית. בריכוז זה, OLE (0.1 מ"ג/מ"ל) העלה מעט את רמת הסידן התוך תאי. הדמיית סידן גילתה שגירוי חריף עם OLE גרם לעלייה חולפת של סידן תוך תאי באמצעות הפעלת ה-CaSR שמתבטל כאשר תאים הודגרו מראש עם האנטגוניסט הסלקטיבי CaSR NPS2143, In cell proximal tubule renal, הפעלה אלוסטרית של CaSR עם I-ornithine הפחית את ייצור ה-ROS ובכך הוריד את הלחץ החמצוני המיטוכונדריאלי שגרם לאפופטוזיס של התא356. יתרה מכך, המחקר הקודם שלנו הראה שהביטוי של גרסאות הרווח בתפקוד של CaSR הפחית את שחרור ROS ו-S-גלוטתיונילציה של AQP237. דגירה עם OLE הפחיתה את יצירת ה-ROS בתאי MCD435 והראתה את יכולתו נוגדת החמצון. עם זאת, כרגע לא ברור אם OLE משפיע על AOP2-S-גלוטתיונילציה. מחקרים רבים גילו כי OLE או oleuropein, שהוא המרכיב העיקרי של OLE, עשויים להיות בעלי תפקידים מגנים על ידי עיכוב מוות של תאים,39 עם זאת, תוארו השפעות תלויות מינון בחולדות שקיבלו OLE. תגובות מועילות התקבלו במינונים של 250 ו-500 מ"ג/ק"ג. לעומת זאת, בריכוזים גבוהים יותר, לטיפול ב-OLE עשויות להיות השפעות מזיקות, אולי בשל הפעולות הפרו-אוקסידנטיות של מספר תרכובות פיטו. במחקר זה, חולדות הוזרקו עם OLE במינון של 250 מ"ג/ק"ג למשך שלושה ימים והראו וויסות עלייה של CaSR. רמת הביטוי של CaSR מוגברת על ידי תרכובות מסוימות הפועלות כמפעילים אלוסטריים של הקולטן. Calcimimetics, אכן, הפחיתו את ההסתיידויות של כלי הדם על ידי הגדלת הביוסינתזה של CaSR בתאי שריר חלק של כלי דם אנושיים0. בתחרות זו, לא ניתן לשלול את האפשרות שתרכובות מסוימות ב-OLE עשויות לתפקד כמאפננים אלוסטריים של CaSR. מצד שני, גירוי עם וזופרסין עשוי להוביל לשחרור IL-6 שעשוי לתרום להגברת רמת הביטוי של CaSR42.

בכליה, גירוי של איתות CaSR קשור לוויסות מטה של ​​ביטוי AQP2, אולי דרך ה-miR-137 generation.miRNAs הם מאפננים פוסט-תעתיקים מרכזיים. תוארו גם כמה מיRNA תלויי וזופרסין המכוונים לביטוי AQP243. טרנספקציה עם miR-32 ו-miR-137 הפחיתה משמעותית את רמת הביטוי של AOP2 בתאי mpkCCDc14. מעניין לציין ש-OLE יכול להחליש אותות דלקתיים ולהפעיל השפעות הגנה על-ידי אפנון רמת הביטוי של מספר miRNAs". בפרט, בתאי glioblastoma multiforme, OLE קידם את הביטוי של miRNA שונה כולל miR-13745 המעורב בוויסות מטה של מסלול האיתות Akt/mTOR 46. יש לציין, טיפול עם oleuropein מונע איתות של Akt/mTOR באמצעות הפעלת CAMK ו-AMPK המושרה על ידי סידן. הפעלה של CaSR עם NPS-R568 מפעילה AMPK ומפחיתה את פעילות mTOR בתאי צינורות פרוקסימליים אנושיים3. בהתאם לממצאים אלה, דגירה עם OLE מגבירה סידן ציטוזולי, מווסתת את פעילות ה-PKA ומקטינה את גודל הציסטה במודל של תרבית תאים תלת-ממדית48. יחד ממצאים אלו מצביעים על כך ש-OLE עשוי להיות שימושי בטיפול בהפרעות המאופיינות בחוסר ויסות של דינמיקת סידן תוך תאית הקשורה להורדת ויסות איתות CaSR.

תמצית עלי זית מורכבת ממספר רכיבים ביו-אקטיביים, כולל פוליפנולים, סיבים ומינרלים49. כרגע, לא ברור אם תרכובת אחת או שילוב סינרגי של תרכובות פיטו ב-OLE עשויות להועיל בוויסות תגובות תוך-תאיות. התמצית המשמשת במחקר זה יושמה כתוסף מזון אפשרי ולכן חשוב להגדיר את ההשפעה הפיזיולוגית של התמצית עצמה בהתחשב בכך שמספר פנולים, כולל הידרוקסיטירוסול, עשויים להיות מסוננים על ידי הכליה ולהתאושש בשתן50. מחקרים נוספים יספקו את היעילות של רכיבים ספציפיים שעשויים לווסת באופן פעיל את איתות הסידן התוך תאי דרך ה-CaSR. לסיכום, מחקר זה מספק ראיות לכך ש-OLE עשוי להיחשב כתוסף פוטנציאלי חדשני המועיל להפחתת הפרעות המאופיינות בהפחתת ביטוי CaSR, כמו גם איתות והשפעה על חדירות המים הכלייתית.

חומרים ושיטות

כימיקלים ונוגדנים.כל הכימיקלים והאנטיביוטיקה נרכשו מ- Merck (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה). Calcein-AM, Fura-2-AM, מדיית תרבית תאים, סרום בקר עוברי (FBS) ומצעי Super Signal West Pico Chemiluminescent נקנו מ-Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). Aquaporin{ {2}}(AQP2) זוהה באמצעות נוגדנים ספציפיים (C-tail Ab) שהועלו כנגד פפטיד סינטטי התואם ל-15 חומצות האמינו האחרונות של C-terminal של AQP2!. נוגדני AQP2-pS256 קיבלו במתנה פרופ' פיטר דין. נוגדנים משניים נגד חזרת עזים נגד ארנבת פרוקסידאז התקבלו מ-Merck (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה). נוגדן משני לעז-אנטי-ארנב משולב לאקסה-488 נרכש מ-Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב).

ייצור תמצית עשירה בפנולים ואפיון כימי.ייצור תמצית עשירה בפנולים מעלי זית בוצע כפי שדווח ב-Ranieri et al.35. לאחר טחינה עם בלנדר (Waring-Commercial, Torrington, CT, ארה"ב), נוספו מים ddH2O (יחס 1/20, w/y) ולאחר מכן עברו אולטרסאונד (CEIA, Viciomaggio, איטליה) שלוש פעמים , למשך 30 דקות ב-35±5 מעלות בכל פעם. לבסוף, התמציות סוננו דרך נייר סינון, lyofilized ואוחסנו ב--20 מעלות צלזיוס. התמציות שהתקבלו סוננו במסנני ניילון של 0.45 מיקרומטר (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה) ושימשו לאפיון כימי. תכולת הפנולים הכוללת, הפעילות נוגדת החמצון וזיהוי התרכובות הפנוליות הבודדות בוצעו על פי Difonzo וחב'. ה-OLE הראה תכולה של פוליפנולים, שנקבעה על ידי Folin-Ciocalteu, שווה ל-195 מ"ג. שווה ערך לחומצה גאלית (GAE) ופעילות נוגדת חמצון, שנקבעה על ידי ABTS (2,2'-אזינו-ביס(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-מלח חומצה סולפונית), המהווה 750 מיקרומול TE (מקבילים לטרולוקס) .

תרבית תאים וטיפולים.תאי MCD4 של איסוף קליפת המוח של עכברים, המבטאים באופן יציב AQP2 אנושי וה-V2R-Rluc הכימרי שימשו כמודל ניסיוני18. תאים גודלו בתערובת של 1:1 של מדיום Eagle's שונה של Dalbec-cos ו-F-12 בתוספת של 5 אחוזים (שנה/שנה) סרום בקר עוברי. 1 אחוז (שנה/שנה)L-גלוטמין ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין,5 מיקרומטר דקסמתזון,400 ug/ml G418 (עבור עמידות ל-AQP2) ו-1 ug/ml puromycin (עבור עמידות V2R-Rluc) , באווירה לחה של 5 אחוז CO, ב-37 מעלות. תאי MCD4 הושארו במצב בסיסי (CTR) או טופלו לטווח ארוך עם OLE ב-0.1 מ"ג/מ"ל O/N, dDAVP ב-100 ננומטר למשך 30 דקות, או טופלו יחד עם OLE ו-dDAVP או NPS2143 ב-1 מיקרומטר O/N לחלופין, תאים נחשפו ל-8-Br-cAMP ב-500 מיקרומטר למשך 45 דקות, ניסויים קצרי טווח בוצעו עם OLE ב-1 מ"ג/מ"ל למשך 5 דקות ו-NPS2143 ב-10 מיקרומטר למשך 15 דקות. ניסויים בוצעו 3-5 פעמים עצמאיות תוך שימוש בתאים מקטעים שונים.

מודל וטיפולים של בעלי חיים.כל ההליכים הושגו בהסכמה עם ההנחיות הלאומיות הדניות לטיפול וטיפול בחיות ניסוי וההנחיות שפורסמו של המכון הלאומי לבריאות, הפרוטוקולים אושרו על ידי המכון לרפואה קלינית. אוניברסיטת ארהוס, לפי הרישיונות לשימוש בחיות ניסוי שהונפקו על ידי משרד המשפטים הדני (מספר אישור 2015-15-0201-00658). מחקרים בוצעו על חולדות Wistar זכר בוגרות במשקל התחלתי של 200-225 גרם. בעלי חיים נשמרו על דיאטת מכרסמים סטנדרטית (Altromin, Lage, גרמניה) והייתה להם גישה חופשית למי ברז. במהלך הניסויים, חולדות שוכנו בקבוצות של שניים לכל כלוב, עם מחזור אור-חושך של 12:12 שעות, טמפרטורה של 21±2 מעלות צלזיוס ולחות של 55±2 אחוזים. חמש חולדות טופלו בהזרקה תת עורית של 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, דנמרק) ב-200 ul מי מלח/חיה, וחמש חולדות שטופלו ברכב שימשו כביקורות. לאחר 30 דקות, החולדות נהרגו, והכליות עובדו כמתואר להלן.

תאים וליזטים של IMCD.תאים גודלו על גבי צלחות של {{0}} מ"מ והושענו מחדש במאגר המכיל 220 מ"מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, {{10}}. 5 M EGTA pH 8.0,0.5 M EDTA pH 8.0,1 M Tris-HCl pH 7.4 בנוכחות פרוטאזות (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptin ו-2 mg/ml pepstatin A) ופוספטאזות (10 mM NaF ו- מעכבי נתרן orthovanadate 1 mM. אלטרנטיביים הוכנו קטעי כליות של כ-0.5 מ"מ ועברו שיווי משקל למשך 10 דקות במאגר המכיל 1i8 מ"מ NaCl, 16 מ"מ Hepes, 17 מ"מ Na-Hepes, 14 מ"מ גלוקוז, 3.2 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl2, 1.8 מ"מ MgSO4, וכן 1.8 מ"מ KH2PO4 (pH7.4). הפפילה הכלייתית נטחנה עם מספריים באותו חיץ בנוכחות פרוטאזות (1 מ"מ PMSF, 2 מ"ג/מלאופפטין, ו-2 מ"ג/מלפסטטין A) ופוספטאזות (10 מ"מ NaF ו-1 מ"ל נתרן orthovanadate) מעכבי. לאחר סוניקה (60 קילו-הרץ למשך 5 שניות), בוצעה צנטריפוגה של הליסאטים ב-12,000×g למשך 10 דקות. הסופרנטנטים נאספו ושימשו למחקרי אימונובליטציה'8.

מיקרוסקופיה.מחקרים קונפוקאליים בוצעו כמתואר קודם לכן1. בקצרה, תאים גודלו על תוספות PET בתרבית תאים וטופלו כמתואר לעיל. לחלופין, קטעי כליות שהתקבלו מבקרה, OLE, dDAVP ו-OLE עם חולדות שטופלו ב-dDAVP עברו ניסויים אימונופלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן. התמונות התקבלו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת לייזר קונפוקלית Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, שוויץ). אלקטרופורזה של ג'ל ואימונובלוטינג. חלבונים הופרדו על גבי 12 אחוז ג'ל פוליאקרילאמיד נטולי כתמים (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) בתנאים מפחיתים כפי שתואר קודם=5,52. בקצרה, רצועות חלבון הועברו על גבי ממברנות Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה) ונוגדו באמצעות נוגדנים אנטי-AQP2 (Pre-C-tail Ab) ואנטי-AQP 2-pS256. אותות אימונראקטיביים התקבלו באמצעות מצעים של Super Signal West Pico Chemiluminescent עם מערכת Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ארה"ב). הרצועות נורמלו לסה"כ חלבון באמצעות טכנולוגיה נטולת כתמים (Bio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב). ניתוח דנסיטומטריה בוצע באמצעות ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ארה"ב) ונותח באמצעות GraphPad Prism (תוכנת GraphPad, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב).

בדיקת חדירות מים.חדירות מים אוסמוטי נמדדה כפי שתואר קודם43. בקצרה, תאי MCD4 גודלו על כיסויי זכוכית של 40- מ"מ. לאחר הטיפולים, התאים הועמסו ב-10 מיקרומטר Calcein-AM חדיר לממברנה למשך 45 דקות ב-37 מעלות ,5 אחוז CO, ב-DMEM/F-12. כיסויי כיסוי הותקנו בתא זלוף (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, באטלר, ארה"ב). המדידות בוצעו באמצעות מיקרוסקופ TE2000-S הפוך (מיקרוסקופ Nikon Eclipse, טוקיו, יפן) המצויד למדידות פלואורסצנטיות חד-תאיות וניתוח הדמיה. הדגימות הטעונות ב-Calcein-AM התרגשו ב-490 ננומטר. מדידות פלואורסצנטיות, בעקבות תמיסות איזוסמוטיות (140 מ"מ NaCl.5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl..1 מ"ל CaCl., 10 מ"מ חומצה סולפונית Hepes, 5 מ"מ גלוקוז, pH7.4) או היפרוסמוטיות (תמיסה איזוסמטית בתוספת 135 מ"מ מניטול) . בוצעו באמצעות תוכנת Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, טורונטו, קנדה). נתוני הקרינה של מהלך הזמן לאחר זילוף תאים עם פתרונות איזו והיפרוסמוטיים נרשמו. מהלך הזמן של הצטמקות התא נמדד כקבוע הזמן (Ki, מבוטא כ-1/r, sec), פרמטר המתואם לחדירות המים, המתקבל על ידי התאמת נתונים לפונקציה מעריכית המנותחת באמצעות GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , קליפורניה, ארה"ב).

מדידות העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית.כדי להעריך שינויים ב-cAMP תוך תאי, יושמה טכנולוגיית העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET). עבור ניסויי FRET, תאים הועברו טרנספקט עם פלסמיד המקודד לחיישן H96 המכיל את מוטיב הקונצנזוס מחייב cAMP של EPAC1 המוטבע בין חלבון הציאן ניאון (CFP) ו-cp173Venus-Venus כפי שהוצג בעבר 32.33.54. הפלסמיד המקודד לבדיקה H96 היה מתנה מ-Dr.K. ג'לינק. הדמיה של תאים המבטאים ECFP ו/או EYFP וזיהוי של FRET בוצעו באמצעות מיקרוסקופ TE2000-S הפוך (מיקרוסקופ Nikon Eclipse, טוקיו, יפן). כל תמונה תוקנה ונותחה כפי שהוצג בעבר55.

מדידות סידן תוך תאי. מדידות סידן תוך תאי בוצעו כפי שהוצג בעבר56. בקצרה, תאי MCD4 הועמסו ב-4 מיקרומטר Fura-2 AM למשך 15 דקות ב-37 מעלות ב-DMEM/F-12. התמיסה של Ringer שימשה לזילוף תאים במהלך הניסוי המכילה 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl 1 מ"מ MgCl, 10 מ"מ HEPES, 5 מ"מ גלוקוז, 1.8 מ"מ CaCl, pH 7.4. במדידות הקרינה, כיסויי הכיסוי עם תאים עמוסים יתר על המידה הותקנו בתא זלוף (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. באטלר, ארה"ב). המדידות בוצעו באמצעות מיקרוסקופ TE2000-S הפוך (מיקרוסקופ Nikon Eclipse, טוקיו. יפן), היחס בין עוצמות הקרינה ב-340 ו-380 ננומטר שורטט וחושב כשינוי הקרינה. בפרט, גירוי עם OLE（1 מ"ג/מ"ל） או NPS2143 （10 מיקרומטר） הושווה באותו סוג תא לאלו שהתקבלו לאחר גירוי עם מינון מקסימלי של האגוניסט המתווך סידן ATP（100 מיקרומטר） ששימש כ בקרה פנימית (100 אחוז).

רמת הסידן התוך תאית נמדדה במצב יציב וכוילה כמתואר על ידי Grynkiewicz57. OLE ו-NPS2143 שימשו לטווח ארוך ב-0.1 mg/ml ו-l uM, בהתאמה, וכל דגימה כוילה על ידי הוספת 5 מיקרומטר יונומיצין בנוכחות 1 mM EGTA (Rm.) ואחריו 5 מיקרומטר יונומיצין ב-5 מ"מ CaCl,(RMA).

ניתוח PCR בזמן אמת של AQP2 ו-CaSR mRNA בחולדות בקרה ומטופלות.ניסויי PCR בזמן אמת בוצעו כדי למדוד את הביטוי היחסי של mRNA בצינור איסוף המדולה הפנימי (IMCD) שבודדו מפפילות כליות של חולדה בקרה ומטופלות. פרוסות כליה של כ-0.5 מ"מ נוצרו ועברו איזון למשך 10 דקות במאגר המכיל 118 מ"מ NaCl, 16 מ"מ HEPES, 17 מ"מ Na-Hepes, 14 מ"מ גלוקוז, 3.2 מ"ל KCl, 2.5 מ"ל CaCl2, 1.8 mM MgSO4, ו-1.8 mM KH2PO4 (pH 7.4). הפפילה הכלייתית בודדה תחת סטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן נטחנו דגימות מחולדות בקרה ומטופלות עם מספריים ישירות בטריזול (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). שעתוק הפוך בוצע על 2.5 ugs של RNA כולל באמצעות SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב), בהתאם להצעות היצרן (25C למשך 10 דקות; 42C למשך 60 דקות; 85C למשך 5 דקות). הגברה של PCR בזמן אמת בוצעה על ידי שימוש ב-TagMan Fast Advanced Master Mix עם מבחני CaSR, AOP2 ו-GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) במערכת StepOne בזמן אמת PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) ), הגדרת תנאי הרכיבה התרמיים כפי שצוין על ידי היצרן (95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות; 40 מחזורים לסירוגין ב-95·C למשך 1 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות). התוצאות הובעו כ-2- ערכים (כימות יחסי) עם △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) מטופל-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

הערכת miRNA-137 בחולדות בקרה וטיפול.תוכן miRNA{{0}} בצינור איסוף מדוללה פנימי של חולדה מטופלת ומטופל הוערך באמצעות TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), שאפשרה הודעה רגישה וספציפית ביותר על miRNA בוגרת באמצעות PCR כמותי. פרוסות כליה של כ-0.5 מ"מ נוצרו והושוו לאיזון למשך 10 דקות במאגר המכיל 118 מ"מ NaCl, 16 מ"מ HEPES, 17 מ"מ Na-Hepes, 14 מ"מ גלוקוז, 3.2 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl2, 1.8 מ"מ MgSO4 ו-1.8 מ"מ MgSO4, ו-1. KH2PO4(pH7.4). הפפילה הכלייתית בודדה תחת סטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן נטחנו דגימות מחולדות בקרה ומטופלות עם מספריים ישירות ב-Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) כדי לחלץ RNA מלא. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （קטלוג n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) שימשה להשגת סינתזת cDNA, לפי הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן (תגובת זנב Poly(A); תגובת קשירה; תגובת שעתוק הפוכה; תגובת miR-Amp). ה-RNA הסינתטי(UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) עם 59-זרחן סונתז על ידי Thermo Fisher Scientific ושימשו לביצוע עקומת כיול לאינטרפולציה של ערכי דגימת miRNA ולהשגת הערכה מדויקת (בננוגרמים) של תוכן miR-137 ב samples16, באמצעות GraphPad Prism (תוכנת GraphPad, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב).

ניתוח סטטיסטי.כל הערכים מדווחים כממוצע ±SEM ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Newman-Keuls עם *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

הצהרות, אישור אתי והסכמה להשתתפות.מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהסכמה עם ההנחיות הלאומיות הדניות לטיפול וטיפול בחיות ניסוי וההנחיות שפורסמו של המכון הלאומי לבריאות. ועדת האתיקה לטיפול בבעלי חיים של המכון לרפואה קלינית, אוניברסיטת ארהוס אישרה את פרוטוקולי המחקר, על פי הרישיונות לשימוש בחיות ניסוי שהונפקו על ידי משרד המשפטים הדני (מספר אישור 2015-15-0201-00658). המחברים מאשרים כי כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. יתרה מכך, המחברים מאשרים כי המחקר בוצע בהתאם להנחיות ARRIVE.

הפניות

1. El, SN & Karakaya, S. עץ זית (Olea europaea) משאיר השפעות מועילות פוטנציאליות על בריאות האדם. נוטר. רפ' 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. השפעות של תמצית עלי זית על תגובה מטבולית, תפקודי כבד וכליות וסמנים ביולוגיים דלקתיים בחולים עם יתר לחץ דם. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polyphenols, והתסמונת המטבולית. מולקולות

4. Cherif, S. et al. ניסוי קליני של תמצית Olea בטיטרציה בטיפול ביתר לחץ דם עורקי חיוני. ג'יי פארם. בלגי. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. תמציות ירוקות מזן זית קורטינה מותירות אפיון נוגד חמצון ופעילות ביולוגית. J. Funct. מזונות 31, 8.

6. Herrero, M. et al. אפשרויות חדשות לייעול תוצרי לוואי של שמן זית. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. תמצית עלי זית מועשרת באולורופאין משפיעה על דינמיקת הסידן ופוגעת בכדאיות של תאי מזותליומה ממאירים. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. השפעות נגד יתר לחץ דם של תמצית עלי זית מועשרת ב-oleuropein בחולדות בעלות יתר לחץ דם ספונטנית. פונקציית מזון 7, 584–593.

9. Hall, JE הפרעה בתפקוד כלייתי, ולא הפרעה בתפקוד כלי הדם הלא-כליתי. מתווך יתר לחץ דם המושרה במלח. מחזור 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin והרגולציה של aquaporin-2. קלינ. Exp. נפרול. 17, 751–764.