פרופיל מטבולומי מבוסס NMR לניקוי רדיקלי ואנטי אייג'ינג חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.5. סיווג תמציות צמחי מרפא לפי ניתוח רכיבים עיקריים

השונות המטבולית בין העלים של צמחי המרפא שנבדקו נותחה עוד יותר באמצעות ניתוח נתונים רב משתנים (MVDA). ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), שיטת זיהוי תבניות, היא MVDA ללא פיקוח המספק הבנה גדולה של הקשר בין הדגימות. עלילות ציון PCA הראו את ההפרדה של עשבי תיבול לאשכולות, בעוד שחלקות הטעינה הדגישו את המטבוליטים המספקים את ההפרדה [85,86]. מודל PCA הפגין כושר טוב (R2X=0.997) ויכולת חיזוי גבוהה (Q2=0.993) כאשר השונות בין R2X(cum) ל-Q2(cum) הייתה פחות מ-0 .3, ובכך מצביע על כך שכל אחד מצמחי המרפא תרם באופן שווה ושווה להפרדה הקבוצתית הנצפית. תצפית זו הייתה בקנה אחד עם Wheelock et al. [87].

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

העלילה העיקרית של ניתוח הרכיבים הראתה שהצמחים שנבחרו הופרדו לשני אשכולות ללא חריגים יוצאי דופן כפי שמוצג באיור 4A. הרכיב הראשי (PC)1 הציג את וריאציה המדגם הגדולה ביותר, ולאחר מכן PC2. PC1 ו-PC2 תרמו לאחוז השונות ב-29.7 אחוזים ו-24.9 אחוזים, בהתאמה. לכן, השונות הכוללת של כ-54.6 אחוז תוארה על ידי מחשבים אלה. תוצאות מחלקת עמודת הטעינה חשפו את המטבוליטים האחראים להפרדת הצמחים לצד החיובי של PC1 (V.negundo ו-C.longa) ולצד השלילי של PC1 (P. minus, P. indica, O.javanica ו- C. caudatus)(איור 4ב).

נתונים מחלקת העמודות של PC1 גילו שהתרכובות הפנוליות, בעיקר קבוצת הפלבנואידים והחומצות הפנוליות, היו אחראיות להפרדה של צמחי המרפא שנבחרו. Quercetin (1), quercetin-3-O-rhamnoside (2), quercetin-3-O-glucoside (3), quercetin-3-O-glucuronide (4), quercetin-3- O-arabinofuranoside (5), רוטין (6), נגזרות מוריסטין (7), קטצ'ין (8), אפיקאצ'ין (9), איזורהמנטין (10), אסטרגלין (11), חומצה כלורוגנית (12), חומצה גאלית (13), תכולת חומצה קומרית (14), חומצה אסקורבית (15), חומצה פורמית (21), חומצה פומארית (22), 3-מתילקסנטין (26) ואפיג'נין (28) הייתה גבוהה יותר בעיקר ב-P. מינוס, P. indica , C. caudatus ו-O.javanica כפי שהיו ממוקמים בצד השלילי של העלילה. לעומת זאת, V.negundo ו-C.longa היו מובחנים משאר הצמחים על ידי נוכחותם של סרוטונין (27) ו-D-לימונן (29) בתמציות שלהם.

2.6. מתאם בין פעילויות ביולוגיות למטבוליטים באמצעות ניתוח ריבועים קטנים חלקיים (PLS)

על מנת להבין את הקשר בין הפעילות הביולוגית הנמדדת והמטבוליטים שנמצאו בצמחי המרפא שנבדקו, יושמה PLS, כמתודולוגיית MVDA מפוקחת, כדי לתאם את נתוני המשתנים הבלתי תלויים (היסט כימי של המטבוליטים) לנתונים של משתנים תלויים, אשר היו עיכוב מבחני DPPH, ABTS ו-ORAC, כמו גם פעילויות אנטי-אלסטז ואנטי-קולגנאז. מתודולוגיה זו יושמה מכיוון של-PLS יש הישג גדול על מנת לקשר את הפעילות הביולוגית שנבדקה עם מטבוליטים, ובכך יכולה לספק מודל לחיזוי [88]. באמצעות ניתוח PLS, ניתן היה לבסס את הקשר בין פעילויות ביולוגיות כגון פעילויות ניקוי רדיקליות ותכונות אנטי-אייג'ינג עם מטבוליטים בדגימות. לפיכך, ניתן להציע מטבוליטים שהיו אחראים כסמנים ביו-אקטיביים.

ה-biplot הוא תערובת של ציונים וחלקות טעינה הנובעות מניתוח PLS, כפי שדווח על ידי Mediani et al. [80]. ביפלטה חלקית של הריבועים הקטנים ביותר עבור פעילות ההסרה הרדיקלית (איור 5A) ותכונות אנטי-אייג'ינג (איור 5B) הראתה שכל הדגימות היו מופרדות היטב ומקובצות ללא חריגים בולטים. ה-PC1 הפריד בין העלים של P. minus, C.caudatus ו-P. indica לבין V. negundo, O.jaoanica ו-C.longa. בהתבסס על פעילויות ניקוי רדיקליות ותכונות אנטי-אייג'ינג של ביפלטים, המודל הציג ערכי כושר טוב (R'Y) של {{10}}.988 ו-0.966, בהתאמה. בינתיים, יכולת הניבוי (Q4) לפעילויות ניקוי רדיקליות ותכונות אנטי-אייג'ינג הייתה 0.984 ו-0.951, בהתאמה.

כפי שמוצג מה-PLS biplot של פעילויות ניקוי רדיקליות (איור 5A), הפעילות הביולוגית (DPPH, ABTS ו-ORACassay) הופנו לצד החיובי של ה-biplot, שהיה האזורים הפעילים ביותר והקרוב ביותר ל-P.minus, P. indica ו-C.caudatus. לעומת זאת, V. negundo, O.javanica ו-C. longa הופנו לצדדים השליליים של ה-biplot, שנחשבו לאזורים הפחות פעילים והיו רחוקים יותר מבחני DPPH, ABTS ו-ORAC, והראו מתאם שלילי עם ביולוגיות. במצב זה, P. mimus, P. indica ו-C.caudatus התקבצו בנפרד מהצמחים הפחות פעילים, מה שמעיד על כך שעשבי תיבול אלה הפגינו השפעה חזקה יותר של סילוק רדיקלים, ובכך מרמזים שתמציות עשב אלו היו עשויות להכיל רמות גבוהות יותר של פנולי. תרכובות. בין שלושת הצמחים הפעילים ביותר, נמצא כי P. minus נמצא בקורלציה חזקה יותר עם בדיקת DPPH ו-ABTS, ולאחר מכן בדיקת ORAC.

ממצא זה עלה בקנה אחד עם התוצאות החוץ-גופניות של פעולות ניקוי רדיקליות שבוצעו. התוצאות הוכיחו ש-P. minus הפגין אפקט חזק של ניקוי רדיקלים חופשיים בהשוואה לשאר הצמחים. התוצאות גילו אפוא כי P. מינוס הוא העשב הפעיל ביותר עבור מחסל מיני חמצן תגובתי. מטבוליטים משניים משמעותיים שתרמו לפעילות הסרת הרדיקלית של P. minus זוהו כקוורצטין, קוורצטין-3-O-rhamnoside, קטצ'ין, איזורהאמנטין, אסטרגלין ואפיג'נין.אוטפלבנואידכל המטבוליטים הללו אותרו קרוב יותר ל-P. minus וגם למבחני ניקוי רדיקליים של DPPHand ABTS. מחקר קודם של Mediani et al.[80] גילה גם שדגימה מיובשת בהקפאה של צמחים הראתה כמות גבוהה יותר של -גלוקוז, -גלוקוז, קטכין וחומצה כלורוגנית, אשר עשויות היו לתרום ליכולת הניקוי הרדיקלית החזקה של DPPH של העשב. עם זאת, ההשפעה הגבוהה של ניקוי הרדיקליים של P.minus יכולה להיות תורמת גם על ידי המטבוליטים הלא מזוהים בתמצית.

ממצאים דומים נמצאו גם לגבי תכונות האנטי אייג'ינג. איור 5B מציג את ה-biplot המתקבל מה-PLS של תכונות אנטי-אייג'ינג. הפעילויות הביולוגיות (פעילות אנטי-אלסטאז ואנטי-קולגנאז) הוקרנו בצד החיובי של ה-biplot, שהיה האזור הפעיל ביותר והיה קרוב יותר ל-P.minus, P. indica ו-C.caudatus. לעומת זאת, V.negundo, O.javanica ו-C.longa הופנו לצד השלילי של הביפלוט, שנחשב לאזור הפחות פעיל והיה רחוק יותר מפעילויות האנטי-אלסטאז והאנטי-קולגנאז. זה הראה מתאם שלילי או חלש יותר לפעילות הביולוגית. במצב זה, P.mimus, P.indica ו-C. caudatus היו מקובצים בנפרד מהצמחים הפחות פעילים, מה שמצביע על כך שתמציות עשב אלו הפגינו עיכוב אלסטאז וקולגנאז גדול יותר. בין שלושת הצמחים הפעילים ביותר, P. minus שוב נמצא כבעל מתאם חזק עם תכונות האנטי-אייג'ינג הללו בהשוואה לשאר הצמחים.

ממצא זה עלה בקנה אחד עם התוצאות במבחנה של תכונות אנטי-אייג'ינג שבוצעו קודם לכן. התוצאות גילו כי P.minus היה הצמח הפעיל ביותר לעיכוב אנזימים אלסטאז וקולגנאז. מטבוליטים משניים משמעותיים שתרמו לתכונות האנטי-אייג'ינג של P. minus זוהו כ- quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, נגזרות של myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin ו-apigenin. מטבוליטים אחרים כגון -גלוקוז, -גלוקוז, חומצה פומארית וחומצת שומן עשויים גם הם להיות אחראים לפעילות הביולוגית. כל המטבוליטים הללו אותרו קרוב יותר ל-P. minus ולפעילויות האנטי-אלסטז והאנטי-קולגנאז.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

ההפליה של עשבי תיבול נבחרים אלה הייתה בהסכמה עם דגימות הפעילות הגבוהה של ניקוי רדיקלי במיוחד. מינוס, P.India ו-C.caudatus, שהיו צפויים להיות מובחנים מהאחרים בשל הריכוז הגבוה שלהם של מטבוליטים משניים, במיוחד פלבנואידים. נוכחותם של תרכובות פנוליות אלו גם מאמינים כתורמים לפעילות גבוהה יותר של מעכבי אלסטאז וקולגנאז של עשבי תיבול אלה [67-79,89-92].

התרומה של תרכובות ביו-אקטיביות של תמציות צמחים ליכולת ניקוי רדיקלים חופשיים ופעילות אנטי-אייג'ינג תועדה על ידי מחקרים שונים [66,72,75,79,92-101]. בנוסף, מטבוליטים כגון פלבנואידים (קוורצטין, קאמפרול, מיריצין, אפיקטכין וקטצ'ין) ופנולים אחרים כגון רסברטרול ופרוסיאנידין B2, הוכחו כמעכבים באופן משמעותי אלסטאז וקולגנאז [69-71,79].

במחקר הנוכחי, אותות המטבוליטים לחשיבות משתנה בערכי ההשלכה (VIP) זוהו ונבדקו כדי להשיג את המטבוליטים המשמעותיים ביותר שהיו בקורלציה עם הפעילויות הביולוגיות שנבדקו. זה נעשה כדי להגביר את שלמות התוצאות המוצגות כאן, אשר בדקו את הפוטנציאל ההבחנה של המטבוליטים שזוהו.פוריטנים ויטמין cGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5 נלקח בחשבון כמשמעותי לאפליה [102]. במחקר זה, ניתן לסווג את כל המטבוליטים התורמים לפעילויות הסרת הרדיקליות ולתכונות האנטי-אייג'ינג כמטבוליטים מבחנים מובהקים מכיוון שערכי ה-VIP שלהם היו מעל 1.0 (טבלה 2). מודל שני ה-PLSbiplots אומת באמצעות 100 תמורות אקראיות, כדי לאשר את יכולות התוקף (R2) ויכולות הניבוי (Q2) של המודל המקורי עם מספר מודלים, בהשוואה לכושר ההתאמה. ה-R2 המחיש כי כושר המודל היה משמעותי והסביר את דרגת משתני ה-Y במודל, בעוד ש-Q2 הציע איכות ניבוי המודל דומה לזו שדווחה על ידי Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). התוצאות גילו שכל ציר ה-Y מיירט R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheערכי היירוט R2 ו-Q2 היו בטווח של 0.0367-0.0872 ו--0.444 עד-0.492, בהתאמה, מה שמרמז על כך ששני דגמי ה-PLS היו תקפים ולא הראה כושר יתר. לכן, ניתן לסווג את שני דגמי ה-PLS הללו כמודלי ביצועים טובים וממצאים אלו הגבירו את מהימנות המודלים.

2.7. כימות יחסי של מטבוליטים משניים

הכימות היחסי של חלק מהמטבוליטים המשניים שזוהו מהצמחים הנבחרים מוצג באיור 6. מטבוליטים אלו נמצאו לרוב גבוהים יותר בצמחי המרפא הפעילים ביותר כגון P. minus, היו ממוקמים בצד החיובי של ה-biplots, והיו קרובים יותר כמעט לכל הפעילויות הביולוגיות שנבדקו.מה זה cistancheתוצאות אלו גילו כי מטבוליטים משניים במיוחד מקבוצת הפלבנואידים של תרכובות הקיימות בכמויות גבוהות ב-P. מינוס אולי תרמו למיגור הרדיקלים החופשיים ולאנטי-אייג'ינג של עשב זה?

בהשוואה למבנים השונים של הפלבנואיד שיכלו לתרום ליעילותם, צוין שדפוס ההידרוקסילציה בטבעת B עשוי להיות אחד הגורמים החשובים להשפעת העיכוב של המטבוליטים על פעילות האנזימים המזדקנים[80] . Sim et al.[104] גילה גם שברמת החלבון וגם ברמת ה-mRNA, ההשפעה המעכבת של הפלבנואידים הללו הפכה לעוצמתית עם מספר גדל והולך של קבוצות בטבעת B, והם בחנו את הקשר בין מבנה לפעילות של חלק מהפלבנואידים ב-MMP-1 ביטוי גנים בפיברובלסטים עוריים אנושיים מוקרי UV.

3. חומרים ושיטות

3.1. כימיקלים וריאגנטים

מתנול-d4(CH3OH-d4) מפושט, KH2PO4 לא מפושט, תחמוצת נתרן דאוטריום (NaOD), מלח נתרן טרימתיל סיליל פרופיוני-d4 (TSP), אתנול ומתנול סופקו על ידי Merck Millipore International (Darmstadt, גרמניה). Quercetin, phosphate buffer, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),2,2-azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)[ABTS ],טרולוקס, אשלגן פרסולפט, 2,2'-אזוביס(2-אמידינופרופן)[AAPH, אפיגאלוקצ'ין גלאט (EGCG), חיץ HEPES, אנזימי אלסטאז, N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide ותחמוצת דאוטריום (D2O) סופקו על ידי Sigma (Aldrich, גרמניה).

3.2. חומר צמחי ודגימה

עלים טריים של O.jacanica, P. minus ו-C.longa נאספו מ-Felda Sungai Koyan Satu, Raub ו-Pahang. עלי V.negundo התקבלו מהמכון למדעי הביולוגי, אוניברסיטת פוטרה מלזיה. עלים טריים של P. indica נקצרו בפארק החקלאות האוניברסיטאי, Universiti Putra Malaysia, ועלים טריים של עלי C. caudatus נאספו במכון החקלאי, Serdang, Selangor. דגימת שובר של עשבי תיבול אלה הונחה בצמח העשב, המכון למדעי הביולוגי, אוניברסיטת פוטרה מלזיה, וכל דגימה אומתה על ידי הבוטנאי.אנטי אייג'ינג cistancheכל העלים נקטפו בעקביות בבוקר, בימי שמש כדי להבטיח את האמינות של תכולת המטבוליטים. החלקה בשדה הפתוח עבור כל עשב הופעלה לשישה חלקים וכל דגימה נאספה מכל מקטע כשישה שכפולים.

3.3.הכנת מדגם

לאחר שנקטפו, העלים הטריים נשטפו תחת מי ברז זורמים כדי להסיר את כל השאריות, יובשו בנייר טישו מעבדתי, והוקפאו מיידית בחנקן נוזלי כדי לעצור את כל התגובות האנזימטיות ולשמר את המטבוליטים לפני הליאופיליזציה. הדגימות יובשו לאחר מכן במייבש הקפאה של LABCONCO(קנזס סיטי, מונטג', ארה"ב) עד שהמשקל ותכולת הלחות עקבית הגיעו מתחת ל-10 אחוזים. כל הדגימות המיובשות נטחנו באמצעות בלנדר מעבדה לאבקה דקה ונוננו באמצעות מסננת בדיקה מעבדתית (ENDECOTTS LTD.London, אנגליה) בגודל 300 אום לקבלת הגודל האחיד. דגימות האבקה נארזו בוואקום באריזת אלומיניום כדי להגן עליהן מפני חשיפה לאור ולחות ואוחסנו בדרגה-80 לפני הניתוחים.

3.4. הוֹצָאָה

הליך החילוץ המתואר על ידי Mediani et al. [105] בוצע בעקבות כמה שינויים. בקצרה, 10 גרם מכל דגימה אבקתית הוטבלו ב-100 מ"ל 60 אחוז אתנול בבקבוק חרוטי ענבר ועברו צלילים למשך שעה באמצעות קולי אמבטיה קולי (WiseClean, דגם WUC-D10H, סיאול, קוריאה) בטמפרטורה מבוקרת (מתחת ל-40 מעלות) . הדגימות סוננו דרך נייר מסנן Whatman מס' 1 והשאריות חולצו שוב פעמיים וסווננו לאחר השלמת המיצוי הראשון. לאחר מכן אספו התמציות ורוכזו באמצעות מאייד סיבובי תחת ואקום ב-40 מעלות. לאחר מכן, החומרים הצמיגים המופקים יובשו בהקפאה באמצעות מייבש הקפאה LABCONCO כדי להבטיח סילוק מקיף של מים ואוחסנו בדרגה -80 עד לשימוש נוסף. לבסוף, תמציות הגלם המיובשות דוללו לריכוזים הדרושים לכל החקירות שנערכו.

3.5. פעילות סילוק רדיקלית של DPPH

פעילות הסריקה הרדיקלית של הדגימות נקבעה על ידי ביצוע הטכניקה שפותחה על ידי Kong et al.[106], אשר פותחה משיטה שונה של Brand-Williams et al. [107]עם שינוי קל. בקצרה, תמציות דגימה של 50uL במתנול בריכוזים שונים (0 עד 500 ug/mL) נוספו עם תמיסת 195uL שהוכנה טריה0.2mMmmetanolic2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ואוחסנה. כל הדגימות הנבדקות הוכנו בצלחת של 96 בארים. תהליך דה-הצבע תועד ב-515 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (קורא מיקרו-צלחות Biotek EL 800, Bio-Tek, Winooski, VT, ארה"ב) לאחר דגירה של 60 דקות בחושך והשוואה לבקרה חיובית ודגימות ריקות. אחוז פעילות הסרת הרדיקלים נמדד לפי המשוואה הבאה:

כאשר בקרה היא הספיגה של הבקרה ללא תמציות צמחים ו-Simple היא הספיגה של תמציות צמחים.

תמציות הצמחים או ריכוזי הבקרה החיוביים שאספו 50 אחוז מה-DPPH היציב של רדיקלים חופשיים חושבו כ-ICs באמצעות הגרף הליניארי של אחוז פעילות ניקוי רדיקלים כנגד

תמציות צמחים/ריכוזי בקרה חיוביים. ICso נמוך יותר הצביע על פעילות נוגדת חמצון גבוהה יותר. כל הניסויים בוצעו בשישה עותקים עם Trolox ו- quercetin כביקורות חיוביות.

3.6.ABTS רדיקלי אשפה

עבור מבחן אבץ רדיקלי, הניתוח בוצע בעקבות ההליך המתואר על ידי Arnao et al.[108] עם כמה תיקונים. תמיסות המניות שהוכנו היו תמיסה של 7 מ"מ ABTS פלוס ותמיסת 2.45 מ"מ אשלגן פרסולפט. על מנת להכין את תמיסת העבודה, שני תמיסות המניות היו מעורבות באותן כמויות והותרו להגיב בחושך במשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תמיסת העבודה דוללה במים מזוקקים כדי להשיג ספיגה של 0.700±0.005 יחידות ב-734 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-1650ספקטרופוטומטר PC, Shimadzu, קיוטו, יפן) ומכונה פתרון ABTS פלוס. תמיסת ABTS plus הוכנה טריה עבור כל בדיקה. תמיסת ABTS פלוס זו (900 μL) הורשה להגיב עם 100 μL של תמציות עשבים למשך 2 דקות. הספיגה נקראה לאחר מכן ב-734 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר. פותחה העקומה הסטנדרטית הכוללת 3.1 ug/mL to ו-50 ug/mL Trolox, והתוצאות הובעו כ- mg Trolox Equivalent Antioxidant Capacity/g דגימה (mg TEAC/g sample).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

מבחן ORAC למדידת יעילות ניקוי רדיקלי הפרוקסיל יושם כפי שנאמר על ידי Huang וחב'. [109] באמצעות קורא הקרינה המיקרו-צלחות FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, גרמניה). כל תמצית עשב וטרולוקס (סטנדרטי) הוכנו בתמיסת חיץ פוספט של 75 מ"מ (PBS) pH 7.4. ב-96-microplate שחורות, נוספו סך של 150 μL פלואורססאין (10 nM מומס ב-PBS) ואחריו 25 μL של Trolox, תמציות צמחים או PBS כריק. תמיסות אלו הועברו בפיפטציה בבארות משולשת. המיקרו-פלטה הודגרה למשך 15 דקות ב-37 מעלות וכוסה במכסה. הקרינה נמדדה עם אורך גל עירור ב-458 ננומטר ואורך גל פליטה ב-520 ננומטר. אות הרקע נקבע על ידי ביצוע המדידה כל 90 שניות.

לאחר מכן, 25 uL שהוכן טרי 2,2'-azobis(2-amidinopropane)(AAPH,240 mM ב-PBS) הוכנס על ידי מזרקים על הסיפון. דעיכת הקרינה נלקחה לאחר מכן עד 90 דקות באמצעות אותם אורכי גל עירור ופליטות. ההערכה נעשתה עבור השטחים שמתחת לעקומה עבור דגימות (פלורסנטיות מול זמן) פחות השטח מתחת לעקומה עבור החסר ובהשוואה לעקומה סטנדרטית （25-400 μM Trolox）. ערכי ה-ORAC הקשורים לטרולוקס חושבו באמצעות המשוואה כדלקמן:

3.8. בדיקת עיכוב אלסטאז

הפעילות מעכבת האלסטאז נקבעה לפי הטכניקה שתוארה על ידי Krause et al.[110], עם שינויים קלים על ידי Ndlovu וחב'. [75]. בארות הדגימה הכילו 25 μL 0.1 M HEPES חיץ (pH7.5), 25 μL תמצית עשבים (100 ug/mL) ו-25 μL אנזים אלסטאז (1 ug/mL). בארות הריקות הכילו רק 75 μL חיץ HEPES ובארות הבקרה השליליות הכילו 50 μL חיץ HEPES ו-25 μL אנזים אלסטאז. בארות הבקרה החיוביות הכילו 25 μL חיץ HEPES, 25 μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro (10 ug/mL) ו-25μL של אנזים אלסטאז. בארות בקרת הממס הכילו 25 μL חיץ HEPES, 25 μL של 10 אחוז מתנול ו-25 μL אנזים אלסטאז. פקדים ריקים עבור תמצית עשבים (עבור פקדי צבע של כל תמצית שנבדקה) הכילו 150 μL חיץ HEPES ו-25 ul של תמצית עשב. לאחר מכן הודגרה צלחת המיקרו-באר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בעקבות זה, התווסף מצע 100μL (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide,1 mM). לאחר מכן הודגרו הצלחות למשך 40 דקות נוספות ב-25 מעלות. לאחר הדגירה, הספיגה נקראה באמצעות ספקטרופוטומטר (Biotek EL800microplate reader) ב-405 ננומטר. אחוז העיכוב של תמציות עשבים חושב באמצעות המשוואה כדלקמן:

כאשר בקרת היא הספיגה של חיץ עם אלסטאז וממס ו-Atest היא הספיגה של חיץ, אלסטאז ותמצית עשב או N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. בדיקת עיכוב קולגנאז

פעילות עיכוב הקולגנאז בוצעה לפי השיטה של ​​Van-Wart ו-Steinbrink [111] (1981) עם שינויים על ידי Madrone וחב'. [92]. הבדיקה יושמה במאגר TES של 50 mM (pH7.4 עם 0.36 mM CaCl2). אנזים קולגנאז מ- Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) הוכן בריכוז של 0.8 יחידות/מ"ל (מומס בתמיסת מניות חיץ של TES). המצע הסינטטי N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) הוכן בריכוז של 2 mM בתמיסת מניות חיץ של TES. הנפח הכולל של 150 μL עבור תערובת התגובה הסופית הכיל 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA (0.8 mM FALGPA ריכוז סופי), 18.7 μL קולגנאז אנזים (0.1 יחידות/mL （0.1 יחידות/mL, ריכוז סופי שלה 25bs) 100 ug/mL）. תמציות צמחי מרפא ואנזימים במאגר TES הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הוספת המצע כדי להתחיל את התגובה הכימית. בקרות שליליות בוצעו עם חיץ TES. לאחר הוספת המצע, הספיגה נקראה מיד ב-340 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב) בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארים ונמדדה ברציפות למשך עוד 20 דקות. בקרה חיובית בוצעה באמצעות epigallocatechin gallate (EGCG) ב-12.5ug/mL. אחוז העיכוב של דגימות חושב באמצעות המשוואה כדלקמן:

כאשר A control הוא הספיגה של חיץ TES ו-Atest הוא הספיגה של חיץ TES, אנזים קולגנאז ותמצית צמחים או FALGPA.

3.10. פרופיל מטבוליטים באמצעות מדידת 'H-NMR

פרופיל המטבוליטים באמצעות H-NMR של צמחי מרפא נבחרים בוצע בהתבסס על הפרוטוקול שתואר על ידי Kim et al. [47] עם שינויים קלים. תמציות עשבי תיבול גולמיים (25 מ"ג) הועברו לצינור מיקרו-צנטריפוגה מ"ל. תערובת של חיץ מתנול-d4 ו-KHPO4 בדאו (pH 6.0) המכילה 0.1 אחוז טרימתיל סיליפרופיוני חומצה נתרן מלח (TSP) נוספה לדגימות עשב בנפח כולל של { {10}}.7 מ"ל ביחס (1:1). צינורות המיקרוצנטריפוגה המכילים תמציות עשבי תיבול היו לאחר מכן מערבלים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בדיקת קולי למשך 15 דקות. לאחר מכן, התערובת עברה צנטריפוגה למשך 0 דקות ב-5678g כדי להפריד את הסופרנטנט מכל חומר בלתי פתיר. לאחר מכן, סופרנטנט שקוף של 0.6 מ"ל שולבו בצינורות NMR והועברו לניתוח H-NMR. הניתוח של 'H-NMR הושג באמצעות ספקטרומטר Varian INOVA NMR של 500 מגה-הרץ (Varian Inc., פאלו אלטו, קליפורניה, ארה"ב) שפעל בתדר של 499.887 מגה-הרץ והספקטרום תועד ב-26 מעלות. כל ספקטרום בודד כלל 64 סריקות עם 3.53 דקות של זמן רכישה ורוחב של 20 עמודים לדקה. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת Chenomx (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, קנדה) כדי לבצע תיקון הדרגתי ותיקון קו בסיס עם הגדרה עקבית. ניתוח נתונים רב משתנים נערך באמצעות תוכנת SIMCA (גרסה 13.0, Umetrics, Umea, שוודיה). 3.11. דליית של 'H-NMR Spectra

איסוף של ספקטרום H-NMR יושמו באמצעות תוכנת Chenomx (v.6.2, Edmonton, AB, קנדה). כל הספקטרים ​​הוכנסו מ0.5-10.0 אזור pprn עם אותם פרמטרים. הפרמטרים כללו רוחב ספקטרלי של §0.04 שהשיג סך של 245 אזורים משולבים עבור כל ספקטרום NMR. השינוי הכימי עבור מים ושאריות מתנול-d ב-δ4.70-4.90 ו-δ3.27-3.35 בהתאמה בוטלו. הנתונים האחידים האחידים עברו לאחר מכן לניתוח נתונים רב משתנים (MVDA).

3.12. כימות יחסי של מטבוליטים

המטבוליטים שזוהו נבדקו עבור הכימות היחסי שלהם אשר חושב על סמך שטח השיא הממוצע של האותות לאחר binning של ספקטרום LH-NMR.

3.13. ניתוח סטטיסטי

כל התוצאות של שישה חזרות הובעו כממוצע ± סטיית תקן. עבור מדידות של פעילויות ניקוי רדיקליות, עיכוב של פעילויות אלסטאז וקולגנאז וכימות יחסי של מטבוליטים, נערכו ניתוחים סטטיסטיים באמצעות Minitab 16 (גרסה 16, Minitab Inc., State College, PA, ארה"ב). ניתוחי שונות (ANOVA) יושמו כדי לבחון את ההבדלים המשמעותיים בין הממוצעים עם p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. מסקנות

היישום של ניתוחי H-NMR יחד עם MVDA הצליח לחקור את השונות במטבוליטים של צמחי המרפא שנבחרו. עלילת הניקוד של PCA הראתה הפרדה ברורה של צמחי המרפא בהתאם לאשכולות שלהם. מחקר זה חשף כי ל-P. מינוס האפקט הגבוה ביותר לניקוי הרדיקלי באמצעות מבחני DPPH ו-ABTS והציג את פעילויות האנטי-אייג'ינג הגבוהות ביותר. שתי ה-biplots של ניתוח PLS אימתו עוד יותר תוצאה זו, מאחר שנמצא קשר חזק בין המטבוליטים שזוהו ב-P. minus לבין הפעילויות הביולוגיות שנבדקו. המטבוליטים הפעילים האמינים כתורמים לפעילויות הניקוי הרדיקליות ולתכונות האנטי-אייג'ינג של P.minus כללו quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, נגזרות של myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin ו-apigenin. לכן, ניתן להניח שמטבוליטים אלו היו אחראים להשפעה החזקה של ניקוי הרדיקלים ולתכונות האנטי-אייג'ינג הגבוהות של P. minus. מטבוליטים אלו היו בעיקר מקבוצת הפלבנואידים, בפרט פלבנולים. לכן, ניתן להציע שהמטבוליטים מ-P. minus יכולים להיות מחסל רדיקלים חופשיים ומעכבי אנזימי הזדקנות מבטיחים שיכולים לשמש לדחיית תסמיני הזדקנות ולטיפול במחלות כרוניות הקשורות להזדקנות. ממצאים אלה יסייעו לבסס את העוצמה של P. מינוס כמקור טבעי פוטנציאלי של תרופות אנטי-אייג'ינג וכמחסל טבעי של רדיקלים חופשיים.

מאמר זה מופק ממולקולות 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules