NGF מווסת את חילוף החומרים של כולסטרול וממריץ הפרשת ApoE בתאי גליה המעניק הגנה נוירופית נגד מתח חמצוני חלק 2

2.6. הפרשה בתיווך NGF של ApoE על ידי U373 מגן על תאים עצביים מפני עלבון חמצוני

עדויות מצטברות מדגישות כי ApoE מגביר את החוסן הנוירוני בפני עלבונות חמצוניים, ובכך מונעת אפופטוזיס וניוון עצבי [17,18,37]. בהקשר זה, הערכנו האם הפרשת ApoE המושרה על ידי NGF על ידי תאי U373 יכולה להגן על נוירוני N1E-115 מפני עקה חמצונית. N1E מובחן לחלוטין -115 טופלו מראש ברוטנון, אשר גורם ללחץ חמצוני על ידי עיכוב הקומפלקס המיטוכונדריאלי I.

אפופטוזיס הוא תהליך של הרס עצמי, והוא דרך חשובה לתאים לשמור על ההומאוסטזיס של הגוף באמצעות הרס עצמי מתוכנת בנסיבות מסוימות. אפופטוזיס ממלא תפקידים שונים בשלבים שונים של החיים.

מחקרים אחרונים הראו שיש קשר מסוים בין אפופטוזיס לזיכרון. אנחנו כבר יודעים שזיכרון הוא תהליך עצבי מורכב במוח, הכולל קשרים ותיאום בין אזורים מרובים במוח. אפופטוזיס עשוי למלא תפקיד בתהליך עצבי זה.

מצד אחד, אפופטוזיס יכול לייצב את מבנה הרשת של נוירונים על ידי ניקוי נוירונים וסינפסות מיותרים, מה שהופך את הקשרים של נוירונים למעודנים יותר, ובכך לשפר את איכות ויעילות הזיכרון. מצד שני, אפופטוזיס מוגזם עלול להוביל גם להפחתה במספר תאי המוח, מה שעלול להשפיע לרעה על אחסון ולכידה של זיכרונות.

לכן, תוך שמירה על רמות מתאימות של אפופטוזיס, אנו יכולים לשפר את הזיכרון באמצעות סדרה של התנהגויות ומיומנויות, כגון קריאה, למידה, פעילות גופנית והתאמת הלך הרוח שלנו. התנהגויות ומיומנויות אלו יכולות לקדם את הצמיחה והחיבור של תאי המוח ולשפר את האיכות והיעילות של הזיכרון על ידי גירוי הקשרים והתיאום בין נוירוני המוח.

לסיכום, הקשר בין אפופטוזיס לזיכרון הוא מורכב. רק תוך שמירה על אפופטוזיס תקין נוכל לעורר את המוח שלנו ולשפר את הזיכרון שלנו באמצעות מגוון התנהגויות ומיומנויות. מנקודת מבט זו, עלינו לשפר את הזיכרון שלנו. Cistanche deserticola יכולה לעזור לנו באופן משמעותי לשפר את הזיכרון שלנו, מכיוון ש-Cistanche deserticola יכולה גם לווסת את איזון הנוירוטרנסמיטורים, כמו הגדלת רמות האצטילכולין וגורמי גדילה. חומרים אלו חשובים לזיכרון. זה מאוד חשוב ללמידה וללמידה. בנוסף, בשר מבשר יכול גם לשפר את נזילות הדם ולקדם את הובלת החמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק חומרים מזינים ואנרגיה, ובכך לשפר את חיוניות המוח וסיבולת.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי לשפר את הזיכרון

לאחר 16 שעות של חשיפה לרוטנון, נוירוני N1E-115 תופחו במדיום טרי (Ctrl), מדיום מותנה מתאי U373 (U373-Ctrl), מדיום מותנה מ-U373 שטופל מראש ב-NGF למשך 48 שעות (U373-NGF), או מדיום מותנה מ-U373 מושתק ב-ApoE שטופל מראש ב-NGF למשך 48 שעות (U373-NGF ApoE siRNA). טיפול מקדים ברוטנון הפחית באופן משמעותי את מספר ה-N1E-115 שתורבתו במדיום הבקרה, מה שמעיד על כך שמתן חומר הדברה זה משפיע קשות על הישרדות N1E-115.

ציטוטוקסיות של רוטנון קבעה גם נסיגת עצבים אינטנסיבית, כפי שנצפתה על ידי אורך העצבים. נזק עצבי שנוצר על ידי טיפול ברוטנון היה ברור במיוחד עם הערכה של תאים נושאי עצבים, שכן מספר ה-N1E-115 עם עצבים ירד ל-50%. תוצאות דומות התקבלו כאשר תאי N1E-115 תורבו במדיום מותנה U373-Ctrl, מה שמצביע על כך שנוכחות של סופרנטנט שמקורו מאסטרוציטים לא מגורים אינה מספיקה כדי להגן על תאים עצביים מפני רעילות מתווכת רוטנון. להפך, יישום n של מדיום מותנה שמקורו ב-NGF שטופל ב-U373 מנע ביעילות מוות נוירוני, כמו גם הפחתה בתאים נושאי עצבים ובאורך העצב שנגרם על ידי מתן רוטנון (איור 5).

חשוב מכך y, המדיום המותנה המופק מתאי U373 המושתקים ב-ApoE איבד לחלוטין את ההשפעות המועילות שגרמו ל-d על ידי המדיום המותנה של U373-NGF, מה שמעיד על כך שההגנה העצבית מונעת על ידי שחרור ApoE בתיווך NGF במצע התרבות. יש לציין כי מדיום מותנה מ-U373 שטופל ב-NGF שעבר טרנספקט ב-siRNA מקושקש שמר במלואו על ההשפעות המגוונות המופעלות על-ידי המדיום המותנה U373-NGF, מה שמוכיח כי אובדן ההגנה העצבית שנצפה במדיום מותנה מתאי ApoE תלוי ביעילות ב-ApoE הורדת ויסות (איור S3C).

איור 5. השפעות של מדיום מותנה U373 על מתח חמצוני בנוירונים. תמונות מייצגות בתחום בהיר והערכה כמותית של מורפולוגיה נוירונית של N1E -115. תאים טופלו בעבר (+) או לא (-) עם רוטנון (0.1 µM) במשך 16 שעות, ולאחר מכן טופלו ב-DMEM טרי (Ctrl), במדיום מותנה שמקורו בשליטה U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 שטופלה מראש ב-NGF (U373-NGF), ו-U373 שטופלה מראש ב-NGF, מושתק עבור apoE (U373-NGF ApoE siRNA) למשך 48 שעות. n=5 ניסויים שונים. הנתונים מייצגים אמצעים ± SD. ניתוח סטטיסטי הוערך על ידי שימוש ב-ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן הפוסט-הוק של Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0.001.

כדי לחזק את התוצאות שהתקבלו מהמדיום המותנה, ביצענו תרבויות משותפות של U373/N1E115. כדי להתחיל, תאי U373 טופלו מראש או לא עם NGF במשך 48 שעות. יתר על כן, תאי N1E-115 מובחנים טופלו מראש או לא עם רוטנון במשך 16 שעות. לאחר מכן, המדיום U373 הוחלף במדיום טרי המכיל 0.5% FBS, וגליונות כיסוי עם N1E-115 הועברו לשכבת U373 כדי להכין תרבויות משותפות (איור 6A).

נזק חמצוני שנגרם על ידי טיפול ברוטנון השפיע במידה ניכרת על תאים נושאי תאים ויבילינוריטים ועל אורך העצבים של השליטה N1E-115 ו-N1E-115 בתרבית משותפת עם אסטרוציטים U373-Ctrl (איור 6B). בהתאם לניסויים בינוניים מותנים, תאי N1E-115 שתורבו יחד עם תאי U373-NGF היו מוגנים מפני נזק חמצוני, בעוד שהשתקת ApoE ב-U373 ביטלה את ההגנה העצבית שנשמרת על ידי NGF.

איור 6. הפרשת ApoE על ידי תאי U373 שטופלו ב-NGF מספקת הגנה עצבית מלחץ חמצוני. (א) תכנית ייצוגית של תרבויות שיתוף אסטרוציטים-נוירון שהוגדרו כמתואר בסעיף חומרים ושיטות. תאים נושאי עצבים, אורך עצבים ומספר תאים הוערכו שעות לאחר הקמת התרבות המשותפת. (ב) תמונות מייצגות בשדה בהיר והערכה כמותית של מורפולוגיה נוירונית של תאי N1E-115, שטופלו בעבר (+) או לא (-) עם רוטנון (0.1 מיקרומטר) במשך 16 שעות.

N1E-115 נשמרו לאחר מכן ב-DMEM טרי (Ctrl), או תורבו יחד עם שליטה U373 (U373-Ctrl), U373 שטופלה מראש ב-NGF (U373-NGF), ו U373 שטופל מראש ב-NGF מושתק עבור ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) למשך 48 שעות. n=5 ניסויים שונים. הנתונים מייצגים אמצעים ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי שימוש ב-ANOVA חד כיווני, ואחריו הבדיקה הפוסט-הוקית של Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3. דיון

חוסר איזון במסלולי איתות נוירוטרופינים, כמו גם שינויים במטבוליזם של כולסטרול במוח, קשורים קשר חזק למחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות, כגון תסמונת רט, HD, מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת פרקינסון (PD) [2,38,39] . בהקשר זה, מחקר בסיסי על הפעילות הביולוגית של נוירוטרופינים הוא חיוני לנתח המנגנונים המולקולריים המקשרים את חילוף החומרים של כולסטרול ופיזיופאתולוגיה של המוח. במהלך השנים האחרונות, מחקר מעניין דיווח על תפקיד של BDNF בוויסות חילוף החומרים של כולסטרול באסטרוציטים [38].

למרות רעיון זה, אין מידע זמין לגבי מעורבותו המשוערת של NGF בוויסות הכולסטרול האסטרוציטי. לכן, בעבודה זו, התמקדנו בתפקיד הפוטנציאלי שמפעיל NGF בוויסות חילוף החומרים של כולסטרול, תוך התייחסות מיוחדת להשפעה של הפרשת ApoE על התמיינות והישרדות נוירונים. U373, קו תאי אסטרוציטומה המשמש כמודל ניסיוני של אסטרוציטים אנושיים, שומר על הפוטנציאל להגיב באופן מלא ל-NGF, מכיוון שהוא מבטא רמות ניכרות של TrkA ו-p75NTR כאחד.

התוצאות העיקריות הצביעו על כך ש-NGF מגביר את רמות החלבונים העיקריים המעורבים בביוסינתזה של כולסטרול (HMGCR), סחר תוך תאי (NPC1) והפרשה (ABCA1). אירועים אלו מלווים בעלייה מקבילה של ApoE ושל כולסטרול ליין לתוך מצע התרבות, דבר המצביע על כך ש-NGF מגביר את הביוסינתזה של כולסטרול ושחול מתאי גליה. דווח כי NGF גורם לביטוי חלבון ApoE על ידי הגדלת התעתוק שלו [40]. עם זאת, לא ראינו שום שינוי משמעותי בביטוי ApoE תוך תאי. ניתן להסביר את חוסר העקביות לכאורה מכיוון שלא ניתן להעריך את הצטברות ApoE בגלל הזרימה המוגברת שלו מ- UIn שטופל ב-NGF
בניסיון לנתח טוב יותר את המנגנונים המולקולריים, טיפלנו ב-U373 עם ה-LM11A-31 ומצאנו שמאפנן p75NTR הצליח רק לחקות את העלייה בביטוי HMGCR בתיווך NGF. המעורבות של p75NTR באפנון של רמות HMGCR עולה בקנה אחד עם נתונים קודמים שהתקבלו בסוגי תאים אחרים, מה שמראה שקולטן זה שולט בתעתיק של אנזימים כולסטרוגניים [41]. עם זאת, LM11A-31 לא גרמה לשינויים כלשהם בחלבונים האחרים שנותחו במחקר זה, כולל ABCA1, או ברמות הכולסטרול וה-ApoE לתוך מצע התרבות, מה שמצביע על כך שהאפנון הסלקטיבי של p75NTR אינו מספיק כדי לקדם כולסטרול שחול דרך חלקיקים עשירים ב-ApoE שנצפו בתאים שטופלו ב-NGF. תוצאות אלו מובילות אותנו להשערה ש-NGF שולט במטבוליזם של כולסטרול בתאי גליה באמצעות מעורבות של קולטני p75NTR ו- TrkA כאחד.

ידוע היטב שקישור נוירוטרופין לקולטני Trk מפעיל את ERK1/2, ובכך מווסת מספר מסלולים המעורבים בהתמיינות, התפשטות והישרדות תאים [2,38]. מעניין לציין כי הפעלת ERK1/2 מווסתת גם את ביטוי ABCA1 ו-ApoE בסוגי תאים שונים [38,42,43]. ממצאים אלה, יחד עם העדויות שציר BDNF/TrkB/ERK מקדם שחול ApoE וביטוי ABCA1 בתאי גליה [38], מצביעים על כך שמסלול הולכת אותות הכולל את ציר TrkA/ERK עשוי להסביר חלק מההשפעות שמפעיל NGF במחקר שלנו.

אמנם לא נצפו שינויים בצמיחת העצבים, אך השימוש במדיום מותנה U373- והקמת ניסויים בתרבית משותפת הצביעו על כך שהפרשת ApoE המוגברת מתאי גלייה המתווכים על ידי NGF היא הקובעת למניעת התוצאות המזיקות הנגרמות על ידי חמצון מתח בתאי עצב. כדי לעורר ציטוטוקסיות, השתמשנו ברוטנון, חומר הדברה נפוץ במחקר פרה-קליני כדי לגרום למין חמצן תגובתי (ROS) שמקורו במיטוכונדריה ולאחר מכן אפופטוזיס [44].

התוצאות שלנו מדגישות ש-NGF ממריץ הפרשת ApoE על ידי תאי גליה, דבר הכרחי כדי להבטיח את ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות נגד מתן רוטנון בתאי N1E-115 מובחנים. תפקידו של ApoE במניעת עקה חמצונית מתועד היטב. לדוגמה, דלדול ApoE במודלים של עכברים מחמיר את הפגיעה החמצונית ברקמת המוח [45,46]. בהתאם לכך, מתן ApoE אקסוגני מגן מפני נזק חמצוני בלתי הפיך מטיפול במי חמצן על ידי מניעת רעילות גלוטמט משנית [18]. בנוסף, ליפופרוטאינים המכילים ApoE יעילים בהחלשת אפופטוזיס הנגרמת על ידי נסיגה של תמיכה טרופית בנוירונים של הגנגליון ברשתית [47].

במחקר שלנו, השימוש ברוטנון מצביע על כך שהגנה עצבית בתיווך ApoE, המקודמת על ידי תאי גלייה מעוררי NGF, עשויה להיות רלוונטית בהקשר של מצבים ניווניים עצביים כגון PD. יש לציין, הרוטנון משחזר ניוון נוירוני דופמינרגי דומה לזה שנצפה ב-PD, הן במודלים של בעלי חיים והן בתרביות תאים, כולל נוירונים שמקורם ב-N1E-115- [48-50]. באופן קוהרנטי, התוצאות שלנו תומכות בראיות קודמות המראות ש-ApoE מעורר הגנה עצבית עם מתן 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA), רעלן עצבי נוסף המסוגל לעורר פנוטיפ דמוי PD [51]. ביחד, המחקר שלנו מדגים ש-NGF הוא מודולטור חיוני של חילוף החומרים של כולסטרול ושחול ApoE מתאי גליה. והכי חשוב, השיפור בהפרשת ApoE שמקדם נוירוטרופין זה נדרש כדי להבטיח הגנה עצבית מפני ציטוטוקסיות של רוטנון.

BDNF הוא הנוירוטרופין השכיח ביותר במוח הבוגר. למרות עדויות אלו, הוכח כי NGF עשוי למלא תפקיד מכריע לא רק במהלך ההתפתחות אלא גם במערכת העצבים המרכזית של מבוגרים. לדוגמה, NGF משפיע על פעילות ההיפוקמפוס וכתוצאה מכך, זיכרון מרחבי ולמידה [52]. ממצאים אחרים מצביעים על כך ש-NGF מפגין השפעה נוירו-פרוקטיבית על נוירונים דופמינרגיים ניגרוסטריאטליים וכי פעילות זו עשויה להוות את הבסיס לגישות טיפוליות חדשות המבוססות על NGF עבור PD [53].

על פי תפיסה זו, הוכח שייצור NGF מווסת בצורה עמוקה באסטרוציטים במהלך הבגרות ומפעיל פעולות מודולטוריות על דלקת עצבית, פגיעה מוחית וניוון עצבי [54-56]. בהקשר זה, יהיה מעניין להעריך, במחקרים עתידיים, האם ניתן לתווך את ההשפעות הללו, לפחות חלקית, על ידי אפנון של כולסטרול גליאלי המקודם על ידי NGF. העבודה הנוכחית מציגה כמה מגבלות שיש להתגבר עליהן בחקירות הניסוי הבאות; למשל, יהיה חשוב לנתח טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המקשרים בין טיפול ב-NGF לבין חילוף החומרים של כולסטרול בתאי גליה.

הבנה רחבה שימושית לזיהוי מטרות מולקולריות ספציפיות הניתנות למניפולציה תרופתית שניתן להשתמש בה בהקשרים נוירודגנרטיביים. יתר על כן, למרות שתאי U373 ו-N1E-115 נמצאים בשימוש נרחב כשורות תאים ניתנות לניהול כדי לשחזר תכונות אסטרוציטיות ותאי עצב בהתאמה [27-29,57], ממצאים אלה צריכים לקבל אישור נוסף בתרביות תאים ראשוניות. למרות שיש לעשות מאמצים נוספים כדי לחזק את המעורבות של איתות נוירוטרופין בהומאוסטזיס של כולסטרול במוח, עבודה זו מדגימה לראשונה ש-NGF עשוי להפעיל בעקיפין הגנה עצבית על ידי השפעה על חילוף החומרים של כולסטרול גליאלי.

4. חומר ושיטות

4.1. תרבית תאים

תאי נוירובלסטומה N1E-115 ותאי U373 תורבו ב-5% CO2 ב-DMEM בגלוקוז גבוה (Merck Life Science, מילאנו, איטליה), עם 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) (Merck Life Science) , מילאנו, איטליה), והוסיפו עם תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין.

כדי לעורר התמיינות נוירונית, תאי N1E-115 נזרעו ב-30% מפגש והועברו ל-DMEM עם 0.5% FBS למשך 96 שעות.

כדי לעורר התמיינות נוירונית, תאי N1E-115 נזרעו ב-30% מפגש והועברו ל-DMEM עם 0.5% FBS למשך 96 שעות.

תרבויות משותפות של אסטרוציטים-נוירון הוקמו לפי הפרוטוקול שתואר על ידי יואנו ועמיתיו, עם שינויים [59]. מרווחי פרפין נלחצו על גבי כיסויים כדי להבטיח היצמדות; השתמשנו במרווחים על כיסויים נוירונים כדי למנוע ביעילות נזק מכני כאשר התאים הונחו זה מול זה. לאחר מכן עוקרו כיסויים באתנול וצופו בפולי-D-ליזין (Merck Life Science, מילאנו, איטליה). N1E-115 זרעו על כיסויי הכיסוי המצופים בצפיפות הרצויה, ולאחר שהוכן לתרבית המשותפת, נעשה שימוש במלקחיים סטריליים כדי להרים את כיסויי הכיסוי עם נוירונים N1E-115 ולהניח אותם עם הפנים כלפי מטה לתוך { {10}}בארות זרעו עם אסטרוציטים U373.

טיפולים מוקדמים בתאי N1E-115 בוצעו על ידי מתן 0.1 מיקרומטר של רוטנון (Sigma-Aldrich, מילאנו, איטליה, R8875) למשך 16 שעות. תאי בקרה קיבלו DMSO (דילול 1:1000 במדיום תרבית תאים) ככלי. תאי U373 טופלו ב-NGF (Alomone Labs, ירושלים, ישראל, N-245) במינון של 100 ng/mL במשך 48 שעות בכל הניסויים.

4.2. הכנת ליזאט וניתוח כתמים מערביים

תאי U373 עברו צלילים (מחזור עבודה 20%, פלט 3) במאגר מדגם (0.1Tris-HClisHCl המכיל 10% SDS, קוקטייל מעכבי פרוטאז, pH 6.8) כדי להגיע ל-lysate הכולל, כפי שתואר קודם לכן [ 60,61]. חיץ Laemmli נוסף, ודגימות עברו דנטורציה ב-95 ◦C למשך 5 דקות. תמציות חלבון (20 מיקרוגרם של חלבונים) נפתרו ב-SDS-PAGE, וההעברה על גבי ממברנת ניטרוצלולוזה בוצעה באמצעות מערכת טרנס-בלוט טורבו העברת (Biorad Laboratories, מילאנו, איטליה), כפי שדווח בעבר [62].

לאחר מכן, הממברנה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם חלב יבש ללא שומן 5% בתמיסה מלוחה טריס (25 מ"מ Tris-HCl, 138 מ"מ NaCl, 27 מ"מ KCl, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6.8) ונבדק במשך הלילה ב-4 ◦C עם הנוגדנים העיקריים הבאים: אנטי-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, דילול 1:500), אנטי- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ארה"ב, sc-118, דילול 1:500), אנטי-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ארה"ב, sc-8984 , דילול 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, דילול 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, דילול 1:1000), אנטי-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, דילול 1:500), אנטי-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, ארה"ב, NB400-148, דילול 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, דילול 1:400), אנטי-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ארה"ב, sc-53570, דילול 1 :400), אנטי-וינקולין (SigmaAldrich, מילאנו, איטליה, V9264, דילול 1:10,000), ואנטי- -אקטין (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, דילול 1 :10,000).

ממברנות הודגרו ברציפות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משניים אנטי עכבר או אנטי ארנב מצומדים ב-HRP (מעבדות ביו-רד, מילאנו, איטליה). נוגדנים הקשורים לחלבון הוצגו על ידי בהירות ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, מילאנו, איטליה, #1705061), ו-chemiluminescence נרשמה באמצעות מערכת ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, מילאנו, איטליה). לאחר מכן בוצע ניתוח דנסימטרי שנגזר מכתמים מערביים באמצעות תוכנת ImageJ גרסה 1.52t (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD, ארה"ב) עבור Windows. Vinculin או -actin שימשו כחלבוני משק בית, ששימשו כבקרות פנימיות להעמסת חלבון. חישובים דנסימטריים התקבלו כיחידות שרירותיות, שנגזרו מהיחס בין עוצמת רצועת החלבון לחלבון הבית המתאים.

4.3. שמן אדום מכתים O

תאי U373 נזרעו על גבי כיסויי כיסוי מצופים פולי-L-ליזין (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) בצלחות של 6-בארות, וצביעה Oil red O בוצעה כפי שדווח בעבר [60]. בקצרה, תאים נקבעו בפראפורמלדהיד (תמיסת 4%) למשך 10 דקות ונשטפו בעדינות שלוש פעמים עם PBS. תאים קבועים הודגרו עם 60% איזופרופנול למשך 5 דקות ולאחר מכן נשטפו במים מזוקקים. לאחר מכן, התאים נבדקו עם 1 מ"ל של תמיסת עבודה Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על ידי הנחת 6-צלחת הבאר על גבי שייקר סיבובי מסלולי. לאחר הדגירה עם תמיסת הצביעה, נשטפו בארות שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר את הכתם העודף.

כיסויי כיסוי הותקנו לבסוף עם מדיום הרכבה Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), ו-Oil red O autofluorescence הוצגה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (TCS SP8; Leica, Wetzlar, גרמניה). התמונות צולמו באמצעות Leica TCS SP8 מצויד בהגדלה של 63× ובתוכנת Leica LAS X (מילאנו, איטליה). כימות של צביעת Oil red O בוצע באמצעות תוכנת ImageJ עבור Windows וחושב כעוצמת הקרינה הממוצעת לכל אזור תא.
4.4. מכתים פיליפינית

צביעה פיליפינית בוצעה באמצעות קומפלקס פיליפיני (Sigma-Aldrich, F9765). תמיסה פיליפינית (10 מ"ג/מ"ל ב-PBS) הוכנה תמיד מיד לפני השימוש. תאים נקבעו ב-paraformaldehyde (פתרון של 4%) למשך 10 דקות ונשטפו עם PBS. לאחר מכן, U373 נצבעו בתמיסת עבודה פיליפינית 1 מ"ל (0.05 מ"ג/מ"ל ב-PBS) למשך שעה אחת בחושך, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS, וכיסויי כיסוי הותקנו עם מדיום הרכבה Fluoroshield ונותחו מיד במיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות סט מסנן UV (עירור 340-380 ננומטר). התמונות נרכשו בהגדלה של פי 40. כימות פיליפינית חושב כעוצמת הקרינה הממוצעת לכל שטח תא באמצעות תוכנת ImageJ עבור Windows.

4.5. כימות כולסטרול

כימות הכולסטרול בוצע באמצעות בדיקה קולורימטרית (ערכת כמות כולסטרול, MAK043, Sigma-Aldrich, מילאנו, איטליה) בהתאם להוראות היצרן.

4.6. אליסה
רמות ApoE במצע התרבות הוערכו באמצעות ערכת Human Apolipoprotein E ELISA (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), בהתאם להוראות היצרן.

4.7. אימונופלואורסצנטי

אימונופלואורסצנטי של תאי U373 בוצע כפי שתואר קודם [60]. U373 נקבעו בפאראפורמלדהיד (4% ב-PBS) ונבדקו בן לילה עם נוגדנים ראשוניים: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, דילול 1:100), ואנטי-TrkA ( סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס, טקסס, ארה"ב, סק-118, דילול 1:100). לאחר מכן, תאים הודגרו למשך שעה אחת עם נוגדן משני עז נגד עכברים Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב, A28180) ועם נוגדן משני נגד עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, ארה"ב Waltham, MA, ארה"ב , A27034). צביעת DAPI בוצעה כדי להמחיש גרעינים, ולבסוף הותקנו כיסויי כיסוי עם מדיום הרכבה של Fluoroshield. דגימות נותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, כמתואר לעיל.

4.8. השתקת ApoE

השתקת mRNA של ApoE בוצעה על תאי U373 באמצעות ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) לפי הוראות היצרן. הטרנספקציה הוקמה בצלחת 6-תרביות רקמת באר, שבה 100,000 תאים לכל באר נזרעו במצע גידול נטול אנטיביוטיקה DMEM בתוספת 10% של FBS למשך 24 שעות. עבור כל באר, מדיום transfection siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​נוספה לפתרון siRNA Transfection Reaction, שהוכן באמצעות siRNA duplex ו-siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ארה"ב, sc29528). התאים נשטפו פעם אחת עם siRNA Transfection Medium וכוסו בתערובת ההעברה שנעשתה קודם לכן. לאחר מכן, צלחת התרבית הודגרה במשך 7 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2.

מצע גידול DMEM עם 20% של FBS ואנטיביוטיקה (2-כפול מהריכוז הרגיל) נוספה לתערובת הטרנספקציה בכל באר ביחס של 1:1. תאים הודגרו במשך 18 שעות, ולאחר מכן המדיום שוחרר והוחלף במצע גידול רגיל טרי; 24 שעות לאחר השלב האחרון הזה, התאים היו מוכנים לשימוש לניסויים נוספים. היעילות של השתקת ApoE הוערכה על ידי RT-qPCR בתאי U373 ועל ידי ELISA בסופרנטנט של התא; ApoE siRNA מנע ביעילות אינדוקציה של ApoE על ידי NGF בהשוואה ל-scramble siRNA (ApoE mRNA: ירידה של 83%; ApoE ELISA: ירידה של 78%). יש לציין כי ביטוי ApoE לאחר השתקת siRNA היה נמוך מרמות הביטוי הבסיסי שנצפו בבקרה U373 (ApoE mRNA: ירידה של 72%; ApoE ELISA: ירידה של 58%) (איור S 3A, B).

4.9. מיצוי RNA ו-PCR בזמן אמת

ניתוח mRNA בוצע כפי שדווח בעבר [22,63]. בקצרה, RNA הכולל מתאי U373 הופץ עם TRI Reagent (Merck Life Science, מילאנו, איטליה) לפי הוראות היצרן. בוצע טיפול DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, מילאנו, איטליה), ולאחר מכן טוהר ה-RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA (Zymo, איטליה). RNA הועבר ברציפות לאחור ל-cDNA באמצעות ערכת תאי שעתוק לאחור של cDNA בעלת קיבולת גבוהה (Applied Bio-System, Foster City, קליפורניה, ארה"ב) ושימשה לניתוח qPCR.

פריימרים ששימשו ב-qRT-PCR עבור apoE היו: קדימה 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 והיפוך 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. פריימרים ששימשו ב-qRT-PCR עבור gapdh (נבחר כגן התייחסות) היו: קדימה 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 והפוך 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. ייצור האמפליקון הנכון הוערך על ידי הערכת עקומת ההיתוך. כל דגימה ביולוגית בוצעה בשלושה עותקים עם ריאגנט IQ ירוק SYBR (מעבדות ביו-רד, מילאנו, איטליה) ובאמצעות מערכת הזיהוי CFX Connect (מעבדות ביו-רד, מילאנו, איטליה).

4.10. הערכה כמותית של מורפולוגיה נוירונלית

מורפולוגיה נוירונית בתאי N1E-115 נאמדה על ידי לכידת תמונות במיקרוסקופ הפוך. ניתוח מורפומטרי בוצע באמצעות תוכנת ImageJ עבור Windows, ומספר התאים הכולל (מבוטא כאחוז וריאציה של הבקרה), אורך עצבי ממוצע (מבוטא כאחוז מהביקורת), ותאים נושאי עצבים נאמדו. עבור תאים נושאי עצבים, האחוז חושב על ידי חלוקת מספר התאים המובחנים במספר הכולל של תאים לשדה. N1E-115 היו מובחנים בדוואות כאשר היה להם לפחות נויריט a אחד באורך שווה או גדול מקוטר הסומה. הערכה מורפולוגית בוצעה על לפחות חמישה ניסויים עצמאיים, שבהם נותחו לפחות שלוש תמונות.

4.11. ניתוח סטטיסטי

כל התוצאות שהוצגו במחקר זה הובעו כממוצע ± SD (התפלגות נורמלית של הנתונים נבדקה באמצעות מבחן Shapiro–Wilk. כאשר הושוו שתי קבוצות ניסוי, בוצעו בדיקות לא מזווגות. עם זאת, כאשר שלוש קבוצות או יותר הושוו, נעשה שימוש בניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן הפוסט-הוק של Tukey. לגבי הניסויים עם רוטנון, שבהם היו שני משתנים, נעשה שימוש ב-ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן פוסט-בונפרוני. p < 0.05 נחשבו לשונות סטטיסטית. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, ארה"ב) עבור Windows.

תרומות מחבר:

המשגה, טרשת נפוצה; מתודולוגיה, MS ו-MC; אימות, MS ו-MC; ניתוח פורמלי, MS, MC, DP ו-MP; חקירה, MC, NM, LL, MP, ו-DP; משאבים, MS וסמנכ"ל; אצור נתונים, MS ו-MC; כתיבה - הכנת טיוטה מקורית, MS ו-MC; כתיבה - סקירה ועריכה, MP, LL, DP, NM ו-VP; הדמיה, MS, MC ו-MP; פיקוח, MS; ניהול פרויקטים, MS; רכישת מימון, MS כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון:

מחקר זה מומן על ידי קרנות למחקר מחלקתי 2021 (אוניברסיטת מוליז) ל- MS, ועל ידי קריאת קרן Jerome Lejeune לפגישת מענקים 2021a, #2043 ל- MS

הצהרת ועדת הביקורת המוסדית:

לא ישים.

הצהרת הסכמה מדעת:

לא ישים.

הצהרת זמינות נתונים:

לא ישים.

תודות:

אנו מודים לקלאודיה טוניני על העזרה בבדיקת הכולסטרול

ניגוד עניינים:

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

הפניות

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; פוגלמן, AM Brain Cholesterol: חיים סודיים ארוכים מאחורי מחסום. עורקים. טרומב. Vasc. ביול. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. קולרדו, מ.; מרטלה, נ.; פנסאבנה, ד.; סיטני, ש.; די ברטולומיאו, ש.; פאלוטיני, ו.; Segatto, M. Neurotrophins כמווסת מפתח של מטבוליזם התא: השלכות על הומאוסטזיס של כולסטרול. Int. י.מול. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. גוריץ, ג.; מאך, ד"ה; Pfrieger, FW מנגנונים מרובים מתווכים סינפטוגנזה הנגרמת על ידי כולסטרול בנוירון CNS. מול. תָא. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH הרחבת קרום פלזמה: משימת הרקוליאנית של נוירון. נאט. הכומר נוירוסקי. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. טקאמורי, ש.; הולט, מ.; סטניוס, ק.; למקה, EA; גרינבורג, מ.; רידל, ד.; אורלאוב, ח.; שנק, ש.; בריגר, ב.; רינגלר, פ.; et al. אנטומיה מולקולרית של אברון סחר. תא 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. סוזוקי, ש.; קיוסואה, ק.; חזמה, ש; אוגורה, א.; קשיהארה, מ.; הרא, ט; Koshimizu, H.; Kojima, M. גורם נוירוטרופי שמקורו במוח מווסת את חילוף החומרים של כולסטרול להתפתחות סינפסה. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. סגאטו, מ.; לבופה, ל.; טראפני, ל.; Pallottini, V. כשל הומאוסטזיס של כולסטרול במוח: השלכות על חוסר תפקוד סינפטי וירידה קוגניטיבית. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM ויסות שיעורי סינתזת כולסטרול in vivo בכבד ובגופה של החולדה נמדד באמצעות מים [3H]. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. מטבוליזם של כולסטרול בנוירונים ובאסטרוציטים. פרוג. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. ניווג, ק.; שלר, ח.; Pfrieger, FW הבדלים מסומנים בסינתזה של כולסטרול בין נוירונים ותאי גליה מחולדות לאחר לידה. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. אורם, JF; Heinecke, JW מעביר קלטת קושרת ATP A1: יצואן כולסטרול בתאים המגן מפני מחלות לב וכלי דם. פיזיול. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW מיקור חוץ במוח: האם נוירונים תלויים באספקת כולסטרול על ידי אסטרוציטים? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. כריסטופרסון, ק"ש; Ullian, EM; סטוקס, CCA; מולוני, CE; לעזאזל, JW; אגא, א.; לולר, ג'; משה, ד.פ; בורנשטיין, פ.; Barres, BA Thrombospondins הם חלבונים המופרשים על ידי אסטרוציטים המקדמים סינפטוגנזה של מערכת העצבים המרכזית. תא 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com