Natalenamides A–C, Tripeptides Cyclic From The Termite-Associated Actinomadura Sp. RB99

תַקצִיר:

בשנים האחרונות גברו החקירות בביוכימיה של חיידקים הקשורים לחרקים. בשילוב עם תהליכי דפליקציה אנליטיים, מחקרים אלה מספקים אסטרטגיה רבת עוצמה לזיהוי תרכובות חדשות מבחינה מבנית ו/או ביולוגית. לפפטידים מחזוריים שאינם מסונתזים באופן ריבוזומי יש ספקטרום ביולוגי רחב עם פוטנציאל רפואי גבוה.

כאן אנו מדווחים על גילוי של שלושה טריפפטידים מחזוריים חדשים: natalenamides A-C (תרכובות 1-3). תרכובות אלו זוהו ממרק התרבות של Actinomadura sp. RB99 באמצעות שיטת דה-פליקציה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC)/אולטרה סגול (UV)/ספקטרומטריית מסה (MS). מבנים כימיים של התרכובות החדשות (1-3) הוקמו על ידי ניתוח של שיטות ספקטרוסקופיות מקיפות, כולל חד-ממדיות (1H ו-13C) ודו-ממדיות (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) גרעיניות. ספקטרוסקופיה תהודה (NMR), יחד עם נתוני ספקטרומטריית מסה יינון באלקטרוספריי (HR-ESIMS) ברזולוציה גבוהה. התצורות המוחלטות של התרכובות החדשות הובהרו באמצעות הניתוח של מרפיי. באמצעות מספר בדיקות ביולוגיות עבור הטריפפטידים, מצאנו כי תרכובת 3 הפגינה השפעות מעכבות משמעותיות על ייצור המלנין המושרה על 3-isobutyl-1-מתילקסנטין (IBMX). ההשפעה של תרכובת 3 הייתה דומה לזו של חומצה קוג'ית, תרכובת בשימוש נרחב כחומר קוסמטי בעל אפקט הלבנת עור.

עור בהיר, חלק ועדין תמיד הייתה המטרה של נשים מזרחיות. המחקר והפיתוח של חומרי הלבנה למוצרי טיפוח מתבססים בעיקר על עיכוב פעילות טירוזינאז.

לתרכובות המכילות טבעות בנזן או מבני הידרוקסיל פנוליים יש השפעות הלבנה פוטנציאליות, כמו חומר ההלבנה הנפוץ כיום ארבוטין, שיכול להפעיל השפעות הלבנה על ידי עיכוב הפעילות של טירוזינאז.

ומצאנו שלCistanche deserticola יש אפקט הלבנה. המרכיב הפעיל העיקרי של Cistanche deserticola, phenylethanoid גליקוזידים, הוא סוג של תרכובת גליקוזיד טבעית. מחקרים מצאו שגליקוזידים פנילתנואידים יכולים לעכב את פעילות טירוזינאז וייצור המלנין במלנוציטים של האפידרמיס האנושי, ולהיות בעלי אפקט הלבנה. יעילות הסוכן.

אבקת תמצית לחץ cistanche tubulosa

מילות מפתח:

טרמיט הגדל פטריות; Actinomadura sp.; טריפפטידים; natalenamides A–C; השפעות הלבנת העור.

1. הקדמה

הניתוח הכימי של סימביונות חיידקים מגנים של חרקים חקלאיים משך תשומת לב רבה בקרב כימאים של מוצרים טבעיים בשנים האחרונות [1-5]. באמצעות תהודה מגנטית גרעינית מתקדמת (NMR)/ספקטרומטריית מסה (MS) המבוססים על תהליכי ריקון ובדיקות ביולוגיות רלוונטיות מבחינה אקולוגית, נחשפה כמות מרשימה של מוצרים טבעיים מסקרנים מבחינה מבנית, כולל מספר פפטידים מחזוריים שאינם מסונתזים באופן ריבוזומי. מסימביונטים מיקרוביאליים [6]. הדוגמאות הבולטות כוללות את ה-dentigerumycin האנטי-פטרייתי, דפספפטיד מחזורי המבודד מ-Pseudonocardia sp. [7], והגרומיצינים A-C, דפסיפפטידים מחזוריים נושאי חומצה פיפראזית שזוהו מ-Pseudonocardia sp. [8].

הוכח כי פפטידים מחזוריים מציגים מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות, ומטפחים מספר גישות סינתטיות כלפי המבנים המבטיחים הפרמקולוגית הללו [9-12]. למעלה מ-40 תרופות פפטיד מחזוריות משווקות כיום ונמצאות בשימוש נרחב בסביבות קליניות, וכתרופה פפטיד מחזורית חדשה אחת נכנסת לשוק מדי שנה, בממוצע [13].

כחלק מהמאמצים המתמשכים שלנו לזהות מטבוליטים משניים חדשניים מבחינה מבנית ו/או ביו-אקטיביים מחיידקים הקשורים לטרמיטים [14-17], התמקדנו ב- Actinomadura sp. RB99, מבודד מהטרמיט המגדל פטריות, Macrotermes natalensis. האסטרטגיה שלנו מבוססת על כרומטוגרפיה נוזלית (LC)/אולטרה סגול (UV)/ספקטרומטריית מסה (MS) הניבה מוצרים טבעיים ביו-אקטיביים חדשים. במחקר זה, אנו מדווחים על בידוד וזיהוי כימי של שלושה טריפפטידים מחזוריים חדשים, natalenamide A-C (תרכובות 1-3, איור 1), באמצעות שיטת דה-פליקציה מבוססת LC/UV/MS וכן הערכות ביולוגיות שלהם עבור ציטוטוקסיות. , פעילות אנטי דלקתית והלבנת עור.

2. תוצאות ודיון

2.1. כרומטוגרפיה נוזלית (LC)/אולטרה סגול (UV)/ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססת בידוד של תרכובות 1-3

Actinomadura sp. RB99 בודד מפני השטח של עובד טרמיטים (M. natalensis). ניתוח פילוגנטי של רצף חומצה ריבונוקלאית ריבונוקלית 16S כמעט מלאה (rRNA) מצביע על כך שהזן RB99 שייך לסוג Actinomadura, עם השכנה הקרובה ביותר Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. ניתוח מבוסס LC/UV/MS של תמציות תרבות מועשרות לאחר מכן חשף קבוצה של ספיגות UV אופייניות עם פסגות יונים מולקולריות ייחודיות המכילות אטומי חנקן.

כדי לזהות את המטבוליטים המתאימים ולחקור את פעילותם, התססה בקנה מידה גדול תוך שימוש בתנאי גידול אופטימליים (100 לוחות אגר מ-2 ליטר ISP2 אגר, pH 6, 10 ימים ב-30 ◦C) והליך עיבוד וטיהור מבוסס. הוחל [17]. חלוקה מונחה LC-UV/MS לאחר מכן וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים למחצה (HPLC) חוזרות ונשנות הביאו לבידוד של שלושה מטבוליטים עם דפוס NMR/MS ייחודי. ביצענו מחקרי גדילה ומדיה באמצעות מלח שונים (NaCl, KBr 1–3 אחוז) והרכבי מדיה (ISP1-6 מדיה) כדי לחקות את הסביבה הטבעית ולעורר ייצור מטבוליטים, מה שהוביל גם לנוכחות שלושת החדשים מטבוליטים (ראה איור משלים S19).

2.2. בירור מבני של התרכובות

Natalenamide A (1) נרכש כאבקה אמורפית. הנוסחה המולקולרית של 1 נקבעה כ-C19H25N3O5 מהיון המולקולרי המוסף לנתרן ב-m/z 398.1691 [M פלוס Na] פלוס (מחושב עבור C19H25N3O5Na, 398.1692) באמצעות שימוש בשיטת יון חיובית ברזולוציה גבוהה של ריסוס-המוני HR. נתונים של ESIMS). ספקטרום האינפרא אדום (IR) הראה פס ספיגה חזק ב-1670 cm−1, מה שמרמז על נוכחות של קבוצות אמידים במולקולה. הניתוח המפורט של נתוני 1H NMR של 1 (טבלה 1) הצביע על האותות האופייניים של שלד פפטיד, המציג שני אותות מתיל (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) ו-0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), שלושה אותות מתילן (δH 1.95 (1H, m, H-7a), 2.27 (1H, m, H-8a), 2.36 (1H, m, H-8b), 2.48 (1H , m, H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), ו-3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), ארבעה אותות מתין (δH 2.02 (1H) , m, H-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4.5 הרץ, H-6), ו-4.63 (1H, dd, J=8.0, 5.0 הרץ, H-11)), וחמישה פרוטונים ארומטיים חופפים (δH 7.18 (1H, m, H-16), 7.23 (2H, m, H-14/18), ו-7.24 (2H, m, H-15/17)).

ספקטרום 13C NMR (טבלה 1), בסיוע ספקטרום HSQC ו-HMBC, הראה בסך הכל 19 תהודות פחמן האחראיות לשני אותות מתיל (δC 18.9 ו-19.9), שלושה אותות מתילן (δC 27.0, 30.6 ו-38.8), תשעה אותות מתין (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) ו-130.6 (×2)), כולל חמישה פחמנים ארומטיים, פחמן אולפיני אחד אות (δC 138.8), וארבעה אותות פחמן קרבוניל (δC 173.2, 173.3, 174.8 ו-181.3). בשילוב עם הנתונים הספקטרוסקופיים לעיל, בדיקה מפורטת של NMR דו מימדי (2D) (1H-1H COSY, HSQC ו-HMBC ניסויים) גילתה נוכחות של שלוש חומצות אמינו ב-1: גלוטמט (Glu), פנילאלנין ( Phe), ו-Valine (Val) (איור 2). הקישוריות של חומצות אמינו אלו נקבעה על ידי מתאמי HMBC של H-1/C-5 ו-C-19, H-11/C-10 ו-C{ {50}}, ו-H-6/C-5 ו-C-10 (איור 2).

כדי לזהות את התצורה המוחלטת של 1, השיטה של ​​Marfey יושמה כדי לקבוע את הסטריאוכימיה של כפולות -H (C-1, C-6 ו-C-11). ההידרוליזטים של חומצה של 1 וחומצות אמינו סטנדרטיות (L/D-Glu, Phe ו-Val) הופקו עם 1-פלואורו-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine אמיד (L-FDAA). ברציפות, התערובת הנגזרת של 1 וחומצות האמינו הסטנדרטיות נותחה על ידי LC/MS כדי לבחון את זמן השמירה שלהן. התצורות המוחלטות של החלקים Glu, Phe ו-Val נקבעו כולן כצורת L, בהתבסס על זמני השמירה של נגזרות L-FDAA של 1 בהשוואה לאלו של חומצות האמינו הסטנדרטיות. לפיכך, המבנה של 1 הובהר בתור הטריפפטיד המחזורי המוצג באיור 1.

Natalenamide B (2) בודד כאבקה אמורפית. הנוסחה המולקולרית שלו (C20H27N3O5) נגזרה מפסגות של יונים מולקולריים שמקורם במימן ונתרן ב-390.2032 [M פלוס H] פלוס (מחושב עבור C20H28N3O5, 390.2029) ו-412.1849 [M פלוס 720 פלוס, 412.1849 [M פלוס 720 פלוס, H4120 בהתאמה) בהשוואה לנוסחה המולקולרית ולנתונים הספקטרליים של NMR של 1, נראה שלתרכובת 2 יש קבוצת CH2 נוספת בשלד הפפטידים. בדיקה מקיפה של הספקטרים ​​החד-ממדיים (1D) (1H ו-13C NMR) ו-2D NMR (1H-1H COSY, TOCSY, HSQC ו-HMBC) של 2 גילתה את קיומם של שלוש שאריות חומצות אמינו: Glu, Phe ו-Leu (לאוצין). הרצף של חומצות אמינו אלו נבנה על סמך מתאמי HMBC של H-1/C-6 ו-C-20, H-12/C-11 ו-C -20, ו-H-7/C-6 ו-C-11 (איור 2). כדי לקבוע את התצורה המוחלטת של 2, בוצעה נגזרת של שאריות Glu, Phe ו-Leu עם L-FDAA ולאחר מכן נותחה על ידי LC/MS. בנתוני LC/MS, L-Glu, L-Phe ו-L-Leu זוהו על ידי השוואת זמני השמירה של נגזרות L-FDAA של 2 עם אלו של חומצות האמינו הסטנדרטיות. לפיכך, המבנה הכימי של 2 נקבע בתור הטריפפטיד המחזורי המוצג באיור 1.

נתוני HR-ESIMS במצב חיובי של natalenamide C (3) הציגו יונים מולקולריים שמקורם במימן ונתרן ב-424.1870 [M פלוס H] פלוס (מחושב עבור C23H26N3O5, 424.1872) ו-446.1694 [M פלוס C2O3] פלוס (2,5 עבור 424.1692). זה הציע שהנוסחה המולקולרית שלו הייתה C23H25N3O5. ניתוח מפורט של ספקטרום ה-1D וה-2D NMR של 3 הצביע על כך שהמבנה הכימי שלו דומה לזה של 2, למעט Leu הוחלף ב-Phe ב-3. הקישוריות של שלוש חומצות האמינו שזוהו ב-3 אומתה באמצעות מתאמי HMBC של H-1/C-9 ו-C-23, H-15/C-14 ו-C-23 ו-H-10/ C-9 ו-C-14 (איור 2). על ידי יישום השיטה של ​​Marfey על תרכובת 3, התצורות המוחלטות של כפולות -H (C-1, C-10 ו-C-15) הובהרו להיות L-Glu אחד ושני L -חלקי Phe. בהתאם לכך, המבנה המלא של 3 נקבע כפי שמוצג באיור 1.

Natalenamides A-C הם פפטידים טריציקליים, ככל הנראה ממקור לא ריבוזומלי. נכון לעכשיו, מספר טריפפטידים מחזוריים ביו-אקטיביים אופיינו כמוצרים טבעיים: טריפפטידים מחזוריים ציטוטוקסיים 17-(לדוגמה, OF4949 I–IV) שבודדו מ-Penicillium rugulose [18]; סקלרוטומיות אנטי-פטרייתיות A-K, שזוהתה ממרק התסיסה של חיידקים סובלים מ-halotolerant [10]; ו-E antiproliferative psychrophilic, מבודד מתרבות מעורבת של שני זני פטריות שמקורם באצות ימיים מהסוג Aspergillus [19].

2.3. פעילויות ביולוגיות של התרכובות 1-3

מאחר שדווחו כי פפטידים מחזוריים מציגים מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות, השפעות ביולוגיות של הטריפפטידים המחזוריים המבודדים ({{0}}) הוערכו באמצעות שלוש פעילויות ביולוגיות. הציטוטוקסיות של תרכובות 1-3 נחקרה כנגד ארבע שורות תאים סרטניים (תאי סרטן שד MCE7, תאי סרטן צוואר הרחם HeLa, תאי סרטן ריאות אנושיים A549 ותאי סרטן כבד HepG2) בריכוזים שונים (0, 6.25 , 12.5, 25, 50 ו-100 uM). תרכובת 1 לא השפיעה על כדאיות התא של תאי MCF-7, HeLa או A549. עם זאת, הטיפול בתאי HepG2 עם 100 M של תרכובת 1 הפחית את כדאיות התא ל-78.5 פלוס 3.2 אחוזים (איור 3). תרכובת 2 הפחיתה את חיוניות התא של תאי HeLa ו-A549 ל-82.9  2.1 אחוז ו-73.5=3.0 אחוזים, בהתאמה, אך לא השפיעה על הכדאיות של MCF-7 או תאי HepG2 (איור 3). תרכובת 3 לא השפיעה על הכדאיות של אף אחת משורות התאים (איור 3).

לאחר מכן, נעשה שימוש במקרופאגים RAW264.7 כדי לחקור את ההשפעות האנטי-דלקתיות של התרכובות המבודדות. כדי למנוע טעויות בייצור NO הנגרמות על ידי שינוי שיעורי הישרדות תאים, נבדקו ריכוזים לא רעילים של כל תרכובת. כפי שמוצג באיור 4, לתרכובות 1-3 היו מעט השפעות ציטוטוקסיות בתאי RAW264.7 (איור 4A-C) ולא השפיעו השפעות מעכבות על ייצור NO בתאי RAW264.7 מעוררי ליפופוליסכריד (LPS) (איור 4D-F) .

ההשפעות המעכבות של תרכובות 1-3 על תכולת המלנין בתאי B16F10 נבדקו כראיה לפעילות הלבנת העור שלהן (איור 5). מכיוון ששינויים בכדאיות התא גורמים לשגיאות בייצור ובמדידה של מלנין, בדקנו תחילה את ההשפעות של תרכובות 1-3 על הישרדות תאי B16F10. תרכובות 1-3 לא הפעילו השפעות ציטוטוקסיות בתאי B16F10 בכל אחד מהריכוזים שבהם נעשה שימוש (איור 5A-C). לאחר מכן הערכנו את ההשפעות המעכבות של התרכובות על ייצור מלנין המושרה על ידי 3-isobutyl-1-מתילקסנטין (IBMX) בתאי B16F10 (איור 5D-F). IBMX, ממריץ ידוע של מלנוגנזה, גורם לעלייה משמעותית בייצור המלנין בעקבות טיפול בודד בתאי מלנומה. בין התרכובות שהוערכו, תרכובת 3 (ב-5-100 מיקרומטר) הפגינה השפעות מעכבות משמעותיות על סינתזת מלנין בתיווך IBMX באופן תלוי מינון. חומצה קוג'ית, השליטה החיובית שלנו, הייתה בשימוש נרחב כחומר קוסמטי עם השפעות הלבנת עור [20]. ההשפעה המעכבת של תרכובת 3 על ייצור המלנין המושרה על ידי IBMX הייתה דומה לזו של חומצה קוג'ית (איור 5F), מה שמצביע על כך שתרכובת 3 מתפקדת כמעכבת חזקה של ייצור מלנין המושרה על ידי IBMX בתאי מלנומה B16F10.

יתר על כן, תרכובת 3 הייתה מזוהמת במספר קטן של זיהומים, אשר נקבעו כאנלוגים של חומצות שומן על ידי פרשנות של נתונים ספקטרוסקופיים של NMR וניתוח LC/MS (חומרים משלימים, איורים S11-S15 ו-S23). כדי לזהות את פעילות הזיהומים, נערכו ניסויים נוספים עם האנלוגים של חומצות שומן על השפעותיהם המעכבות על ייצור המלנין המושרה על ידי IBMX בתאי B16F10, אשר גילו כי לתרכובות שנבדקו אין אפקט הלבנה (חומרים משלימים, איור S24). לפיכך, למרות שאיננו יכולים לשלול שהזיהומים בתרכובת 3 אחראים להשפעה המעכבת על ייצור המלנין המושרה על ידי IBMX, זה נראה לא סביר.

3. חומרים ושיטות

3.1. נהלי ניסוי כלליים

ספקטרום אינפרא אדום נרכשו בספקטרומטר Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, ארה"ב). יינון האלקטרוספריי וספקטרום HR-ESIMS נמדדו בספקטרומטר מסה SI-2/LCQ DecaXP DecaXP (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). ספקטרום NMR, כולל ניסויי 1H–1H COSY, HSQC ו-HMBC, בוצעו באמצעות ספקטרומטר Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, ארה"ב) הפועל בתדרים 800 מגה-הרץ (1 שעות) ו-200 מגה-הרץ (13C), עם שינויים כימיים נתונים ב-ppm (δ). HPLC הכנה השתמש במשאבת Waters 1525 Binary HPLC עם Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, ארה"ב). סיליקה ג'ל 60 (230-400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, ארה"ב) ו-RP-C18 סיליקה ג'ל (230-400 mesh, Merck, שימשו לכרומטוגרפיה של עמודות. HPLC חצי הכנה השתמשה במערכת Shimadzu Prominence HPLC עם SPD{ {22}}גלאי A/20AV Series Prominence HPLC גלוי אולטרה סגול (UV–Vis) (Shimadzu, טוקיו, יפן). ניתוחי LC/MS בוצעו על מערכת HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארה"ב) מצויד בגלאי מערך דיודות וספקטרומטר מסה ESI מסדרה 6130 עם קינטקס אנליטי (4.6 × 100 מ"מ, 3.5 מיקרומטר). לוחות סיליקה ג'ל F254 של Merck וצלחות RP-18 F254s שימשו עבור דקים כרומטוגרפיה שכבתית (TLC). כתמים זוהו ב-TLC תחת אור UV או על ידי חימום לאחר ריסוס עם תמיסת אניסלדהיד-חומצה גופרתית.

3.2. חומר מיקרוביאלי

Actinomadura sp. RB99 בודד מפני השטח של פועל טרמיטים מהסוג, M. natalensis, (מושבה Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) ב-2 בינואר{ {13}}10. חומר ביולוגי הוכנס לשקיות ניילון נקיות ועובד תוך יום אחד מהאיסוף. טרמיטים נשטפו במים סטריליים מפושטים, וחיידקים בודדו על ידי ציפוי התרחיפים שהתקבלו על גבי מדיה דלת תזונה עם כיטין (לליטר: 4 גרם כיטין, 0.7 גרם K2HPO4, 0.3 גרם KH2PO4, 0.5 גרם MgSO4·5H2O, 0.01 גרם FeSO4·7H2O, 0.001 גרם ZnSO4, 0.001 גרם MnCl2 ו-20 גרם אגר) [21]. מבודדים עם מורפולוגיה דמוית אקטינובקטריה הועברו לאגר ISP2 (לליטר: 10 גרם תמצית מאלט, 4 גרם תמצית שמרים, 4 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר), ותופחו משנה עד לקבלת מבודדים טהורים.

3.3. מיצוי DNA והגברת תגובת שרשרת פולימראז

Actinomadura sp. RB99 גדל במדיה נוזלית עשירה בחומרי מזון ISP2 למשך חמישה עד שבעה ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. תאים נקצרו, ו-DNA גנומי חולץ באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן עם השינויים הבאים: (א) הטיפול בליזוזים הוארך ל-40 דקות, ו (ב) הטיפול בפרוטאינז K הוארך ל-40 דקות. ה-DNA כומת באופן פוטומטרי באמצעות ספקטרומטר Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

עבור מחקרים פילוגנטיים, הגן rRNA 16S הוגבר באמצעות ערכת ה-primer, 1492R/27F. כל תגובת הגברה הוכנה בנפח תגובה סופי של 25 μL המכיל 7.25 μL מים מזוקקים, 5 μL של חיץ HF, 5 μL מכל פריימר (2.5 μM), {{10}}}.5 μL של dNTPs (10 μM), 0.25 μL של Phusion High-Fidelity DNA פולימראז (New England Biolabs, Ipswich, MA, ארה"ב), ו-2 μL של DNA מופק (תבנית). תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בוצעה בתנאים הבאים: 98 ◦C למשך 38 שניות; 32 מחזורים של 98 ◦ למשך 30 שניות, 52 ◦C למשך 45 שניות, 72 ◦C למשך דקה אחת ו-20 שניות; והארכה סופית של 72 ◦C למשך 8 דקות. תוצר ה-PCR הוצג על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose, ותגובות PCR טוהרו באמצעות ערכת טיהור PCR (Thermo Scientific). שברי DNA רוצו ב-GATC (קונסטנץ, גרמניה).

3.4. רצף וזיהוי מינים

רצפים הוערכו לגבי טוהר ואי התאמה באמצעות BioEdit [22]. הרצפים קדימה ואחורה שהתקבלו עבור כל זן הורכבו עם BioEdit ונבדקו עבור כימרות באמצעות DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). הרצפים שהתקבלו הופקדו ב-GenBank (מספר גישה: KY558684). ניתוחי פיצוץ עם רצפי rRNA של 16S כמעט מלאים (1368 bp) בוצעו באמצעות מסד הנתונים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI) (רצפי RNA התייחסות). התוצאות הצביעו על כך שהזן RB99 הוא חבר בסוג, Actinomadura. רצפים של 10 ההתאמות הראשונות הורדו ממסד הנתונים של NCBI ויושרו עם רצף 16S rRNA של Actinomadura sp. RB99 באמצעות שירות יישור רצפי Sina [23]. שני עצים פילוגנטיים שונים שוחזרו עם אלגוריתמים של הצטרפות שכן או סבירות מקסימלית באמצעות תוכנת MEGA גרסה 7.0.26 [24-26]. מודל המרחק האבולוציוני של Tamura ו-Nei שימש ליצירת מטריצות מרחק אבולוציוניות עבור אלגוריתמים של סבירות מקסימלית והצטרפות שכנים, עם מחיקת פערים מלאים ונתונים חסרים [27]. עבור אלגוריתם הסבירות המקסימלית, נעשה שימוש בחלוקת גמא נפרדת (בתוספת G), ומודל וריאציות הקצב איפשר לכמה אתרים להיות בלתי משתנה מבחינה אבולוציונית (פלוס I). עבור האלגוריתם של הצטרפות שכנים, וריאציות הקצב בין אתרים עוצבה באמצעות התפלגות גמא (בתוספת G). ערכי הביטחון של צמתים הוערכו על ידי ניתוחי bootstrap המבוססים על 1000 שלבי דגימה מחדש [28].

3.5. מיצוי ובידוד

Actinomadura sp. RB99 גדל במרק ISP2 של 50 מ"ל במשך שבעה ימים ב-30 ◦C (קדם-תרבית) ושימשו לחיסון 100 לוחות אגר ISP2. הצלחות הודגרו במשך 10 ימים ב-30 ◦C, חתכו לחתיכות קטנות, אוחדו וטבלו למשך הלילה ב-MeOH. שלב MeOH סונן ואודה בלחץ מופחת. תמצית MeOH (20 גרם) הומסה במים מזוקקים (700 מ"ל) ולאחר מכן חולקה ממס עם EtOAc (700 מ"ל) שלוש פעמים, ויצרה 1.1 גרם שאריות. החלק המסיס ב-EtOAc (1.1 גרם) מתמצית MeOH הוטען על עמודת סיליקה ג'ל (230-400 mesh) לכרומטוגרפיה ונפלט עם מערכת ממס גרדיאנט של CH2Cl2-MeOH (100:1 ל-1: 1, v/v). זה סיפק שישה חלקים (A-F), שהיו נתונים לניתוח מבוסס LC-UV/MS. ניתוח דה-פליקציה באמצעות ספריית UV ספקטרלית פנימית הצביע על קיומם של אנלוגים פפטידים מינורים בשבריר E. אלה הציגו דפוס UV פשוט בסביבות 220 ננומטר ופסגות יונים בנוסחה מולקולרית ייחודית המכילים אטומי חנקן. השבר הקוטבי E (233 מ"ג) חולק על ידי HPLC הכנה הפוכה (Phenomenex Luna C18, 250 × 21.2 מ"מ id, 5 מיקרומטר, Torrance, CA, ארה"ב) באמצעות CH3CN/H2O (1:9 עד 9:1, v /v, מערכת שיפוע, קצב זרימה: 5 מ"ל/דקה) כדי להניב חמישה חלקי משנה (E1-E5). חלק משנה E2 (27 מ"ג) טוהר על ידי HPLC הפוך למחצה הכנה (Phenomenex Luna C18, 250 × 10.0 מ"מ id, 5 מיקרומטר) עם 33 אחוז MeOH/H2O (מערכת איזוקרטית, קצב זרימה: 2 מ"ל/דקה ) כדי להניב תרכובת 1 (5.8 מ"ג, tR=57.0 דקות). תרכובות 2 (1.6 מ"ג, tR=42.0 דקות) ו-3 (1.5 מ"ג, tR=55.0 דקות) בודדו מתת-שבריר E3 (15 מ"ג) על ידי שלב הפוך למחצה הכנה. HPLC מוציא 43 אחוז MeOH/H2O (מערכת איזוקרטית, קצב זרימה: 2 מ"ל/דקה).

3.5.1. Natalamide A (1)

3.5.2. Natalamide B (2)

3.5.3. Natalamide C (3)

3.6. הידרוליזה חומצית של תרכובות 1-3

כמות בסך 0.4 מ"ג מכל תרכובת (1-3) עברה הידרוליזה עם 6 N HCl (500 µL) למשך שעה אחת ב-110 ◦C. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, ההידרוליזטים של 1-3 התאדו כדי להסיר עקבות של HCl. מים מזוקקים (500 μL) נוספו לתערובות ההידרוליזה ולאחר מכן התאדו כדי להסיר עקבות של HCl; תהליך זה בוצע שלוש פעמים.

3.7. קביעת התצורה המוחלטת של חומצות אמינו ב-1-3

תערובות ההידרוליזטים (1-3), כמו גם חומצות האמינו הסטנדרטיות (L/D-Leu, Glu, Phe ו-Val), הומסו ב-1 N NaHCO3 (100 μL) ולאחר מכן טופלו עם 50 μL של L-FDAA (10 מ"ג/מ"ל באצטון). ברציפות, כל הידרוליזט חומם במשך 10 דקות ב-80 ◦C. כל תערובת נכבתה עם 2 N HCl (50 μL) ורוכזה בוואקום. השאריות הומסו ב-300 μL של MeOH. כל מנה (5 μL) שנרכשה מתערובות ההידרוליזה הוזרק ישירות ל-LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4.6 × 100 מ"מ, 3.5 מיקרומטר, קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה), וסריקה מלאה בחיוב ובשלילי אופני יונים (טווח סריקה מ-m/z 100 עד 1000) יושמו כדי לזהות את זמני השמירה של חומצות האמינו הנגזרות מ-L-FDAA.

הפאזה הניידת, המורכבת מחומצה פורמית במים מזוקקים ({{0}}.1 אחוז v/v) (A) ואצטוניטריל (B), הועברה עם מערכת ממס שיפוע באופן הבא: 20–40 אחוז (B) למשך 10 דקות, 100 אחוז (B) איזוקרטי למשך 5 דקות, ולאחר מכן 20 אחוז (B) איזוקרטי למשך 5 דקות, כדי לבצע הליך כביסה לאחר הריצה עבור העמוד. זמני השמירה של חומצות האמינו הנגזרות של L-FDAA המשמשות כסטנדרטים היו 16.7 דקות (L-Glu, m/z 400 [M ועוד H] פלוס ), 18.2 דקות (D-Glu, m/z 400 [M פלוס H] פלוס ), 22.1 דקות (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25.1 דקות (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25.6 דקות (L-Phe, m/ z 418 [M פלוס H] פלוס ), 27.0 דקות (D-Phe, m/z 418 [M פלוס H] פלוס ), 25.5 דקות (L-Leu, m/z 384 [M פלוס H] פלוס ), ו-28.2 min (D-Leu, m/z 384 [M ועוד H] פלוס ). זמני השמירה של ההידרוליזטים הנגזרים של 1-3 היו L-Glu (16.9 דקות), L-Phe (25.7 דקות) ו-L-Val (22.5 דקות) מ-1; L-Glu (16.7 דקות), L-Phe (25.7 דקות), ו-L-Leu (25.6 דקות) מ-2; ו-L-Glu (16.9 דקות) ו-L-Phe (25.7 דקות) מ-3.

3.8. בדיקות ציטוטוקסיות באמצעות תאים סרטניים

תאי MCF7, HeLa ו-A549 נרכשו מאוסף American Type Culture Collection (Rockville, MD, ארה"ב). תאי HepG2 נרכשו מבנק הסלולר הקוריאני (סיאול, קוריאה). תאי MCF7 תורבו במדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי. תאי HeLa ו-A549 תורבו במדיום המינימלי החיוני של Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, ארה"ב) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי. תאי HepG2 תורבו ב-Minimal Essential Medium בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי. תנאי התרבות נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5 אחוז CO2. ציטוטוקסיות נבדקה על ארבע שורות תאים אנושיות אלה (MCF7, HeLa, A549 ו- HepG2) באמצעות ערכת בדיקת כדאיות התא EZ-CyTox (מעבדות Dojindo, Kumamoto, יפן). בקצרה, 5 × 103 תאים/באר נזרעו בצלחות של 96-בארים. לאחר 24 שעות, התאים טופלו בתרכובות בריכוזים המצוינים. לאחר 72 שעות של דגירה, נעשה שימוש בערכת בדיקת כדאיות תאי EZ-CyTox. לאחר 2 שעות של דגירה, הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר עם התייחסות ב-620 ננומטר. כדאיות התא חושבה כאחוז מהביקורת.

3.9. פעילות אנטי דלקתית

קו התאים של מקרופאג עכברים RAW264.7 נרכש מ-American Type Culture Collection. תאים תורבו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי (FBS), 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, והודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2. כדאיות התא נמדדה באמצעות ערכת זיהוי הכדאיות של תאי Ez-Cytox. תאים הודגרו בצלחות של 96-בארות בריכוז של 2500 תאים לבאר במשך 24 שעות וטופלו בריכוזים המצוינים של תרכובות 1-3 למשך 24 שעות. לאחר מכן, נוספו ריאגנטים Ez-Cytox לכל באר. הצפיפות האופטית ב-450 ננומטר נמדדה לאחר שעה אחת באמצעות קורא מיקרו-לוחים (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ארה"ב) כדי להעריך את כדאיות התא. בניסוי נפרד, תאי RAW264.7 הודגרו ב96-צלחות באר בריכוז של 30,000 תאים לבאר במשך 24 שעות. לאחר הרעבה בסרום במשך 12 שעות, תאים טופלו מראש בתרכובות 1-3 למשך שעה אחת ולאחר מכן עוררו עם 1 מיקרוגרם/מ"ל של LPS למשך 24 שעות. הספיגה של מדיית תרבית בתגובת Griess נמדדה ב-540 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות PowerWave XS כדי להעריך את רמת ה-NO.

3.10. מדידת תוכן מלנין

קו תאי המלנומה של העכבר, B16F10, נרכש מ-American Type Culture Collection. תאים תורבו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS, 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5 אחוז CO2. תאי B16F10 הודגרו בכלי תרבית של 6 ס"מ ב-250,{12}} תאים לבאר ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-100 יחידות למ"ל פניצילין למשך 24 שעות. התאים נשטפו פעמיים עם מי מלח מבוצר פוספט (PBS) ולאחר מכן עוררו על ידי IBMX והודגרו עם ריכוזים שונים של תרכובות 1-3 או חומצה קוג'ית (בקרה חיובית) במדיום RPMI נטול פנול אדום בתוספת 10 אחוז FBS, 100 יחידות /מ"ל פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין למשך 24 שעות ו-48 שעות. הספיגה של מצע התרבות נמדדה ב-405 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלטות PowerWave XS להערכת תכולת המלנין. התוצאות מתבטאות כשינוי קיפול בהשוואה לבקרה (תאים שאינם מגורים על ידי IBMX).

3.11. ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים, כולל כדאיות התא, ייצור NO ומלנין, הוצגו כערך ממוצע וסטיית תקן (SD). כל המבחנים נעשו בשלושה עותקים וחזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים. במחקר זה נכללו רק מספר חזרות בודדות של כל ניסוי תא, ולכן אומצה שיטת הניתוח הלא פרמטרית לניתוח סטטיסטי. מבחן Kruskall–Walis שימש לניתוח סטטיסטי של כל משתנה. החבילה הסטטיסטית SPSS שימשה עבור כל הניתוחים (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS סטטיסטיקות גרסה 21, בוסטון, MA, ארה"ב). מובהקות סטטיסטית נחשבה לערך p נמוך מ-0.05.

4. מסקנות

הדו"ח שלנו מספק ניתוח כימי של מבודדים מיקרוביאליים מטרמיט הגדל פטריות. שלושה טריפפטידים מחזוריים חדשים, natalenamides A-C (1-3), בודדו ואופיינו מבחינה מבנית ממרק התרבות של Actinomadura sp. RB99 באמצעות שיטת דה-פליקציה מבוססת LC-UV/MS. כל התרכובות המבודדות הוערכו עבור פעילות ביולוגית באמצעות מבחני תאים. תרכובות 1 ו-2 הפגינו ציטוטוקסיות חלשה כנגד תאי HepG2 ו-HeLa/A549, בהתאמה. אף אחת מהתרכובות המבודדות לא הראתה השפעות מעכבות משמעותיות על ייצור NO בתאי RAW264.7 מעוררי LPS. תרכובת 3 הראתה השפעות מעכבות משמעותיות על סינתזת מלנין בתיווך IBMX באופן תלוי מינון. ההשפעה הייתה דומה לזו של חומצה קוג'ית, המשמשת כחומר קוסמטי עם השפעות הלבנת עור.

תודות:

אנו מודים מאוד למייקל תומס-פולן (המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת קופנהגן, דנמרק) על התמיכה בעבודת השדה שלנו.

ניגוד עניינים:

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

הפניות

1. ניומן, DJ; Cragg, GM מוצרים טבעיים כמקורות לתרופות חדשות מ-1981 עד 2014. J. Nat. לְדַרבֵּן. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. משרה, ב"ב; Tiwari, VK מוצרים טבעיים: תפקיד מתפתח בגילוי תרופות עתידיות. יורו J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; גואו, ה.; רישר, מ.; Poulsen, M. מוצרים טבעיים מחיידקים הקשורים לחרקים. ביילשטיין J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; בימלמנס, סי; Currie, CR; Clardy, J. סימביונים של חיידקים במערכות חקלאיות מספקים מקור אסטרטגי לגילוי אנטיביוטיקה. J. אנטיביוט. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. הארווי, אל. אדרדה-איבל, ר.; Quinn, RJ ההופעה המחודשת של מוצרים טבעיים לגילוי תרופות בעידן הגנומיקה. נאט. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; פישבצ'ב, מ.א.; Walsh, CT ביוסינתזה כוללת: בנייה מחדש במבחנה של מסלולי פוליקטיד ופפטידים לא ריבוזומים. נאט. לְדַרבֵּן. רפ' 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. אה, ד.; סקוט, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, פוליאן מי חמצן מ-Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. שב, CS; Ruzzini, AC; ואן ארנם, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. ארכיטקטורות גנטיות משתנות מייצרות מולקולות כמעט זהות בסימביונטים חיידקיים של נמלים המגדלות פטריות. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. נמוך, KE; לר, ש; חן, ק"ג; Campbell, RL; Hickey, JL; טאן, ג'; סקאלי, CCG; דייויס, RL; יודין, א"ק; Zaretsky, S. עיצוב רציונלי של מעכבי קלפין המבוססים על קלפסטטין פפטידומימטיקה. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. ג'נג, ג'; שו, ז; וואנג, י.; הונג, ק.; ליו, פ.; Zhu, W. Cyclic Tripeptides מפטריית ה-halotolant Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. לְדַרבֵּן. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; מושניקובה, א.; אל-סייד, נ"ס; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; גוליגנין, י. Tiwari, RK; אנדרייב, OA; פארנג, ק.; Reshetnyak, YK פפטידים מחזוריים רגישים ל-pH. Sci. נציג 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. ז'או, מ.; לין, HC; Tang, Y. ביוסינתזה של הטריפפטיד המחזורי המכיל-ניטרו. J. אנטיביוט. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. זורזי, א.; דייל, ק.; Heinis, C. טיפולי פפטידים מחזוריים: עבר, הווה ועתיד. Curr. דעה. Chem. ביול. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. קים, KH; Ramadhar, TR; בימלמנס, סי; Cao, S.; פולסן, מ.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin מ-Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. קאנג, HR; לי, ד.; בננדורף, ר.; יונג, WH; בימלמנס, סי; קאנג, ק"ש; Kim, KH Termisoflavones A–C, גליקוזידים איזופלבונואידים מ-Streptomyces sp. RB1. J. Nat. לְדַרבֵּן. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. בימלמנס, ג.; Ramadhar, TR; קים, KH; קלאסן, JL; Cao, S.; Wyche, TP; הו, י.; פולסן, מ.; בוגני, TS; Currie, CR; et al. Macrotermycins A-D, מקרולקטמים מסוכרים מ-Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. גואו, ה.; בננדורף, ר.; לייכניץ, ד.; קלאסן, JL; וולמרס, י. Görls, H.; שטינאקר, מ.; וייגל, ג; דאהסה, ח"מ; קסטר, א.ק; de Beer, ZW; et al. בידוד, ביוסינתזה ושינויים כימיים של רובטרולונים A–F: אלקלואידים טרפולונים נדירים מ- Actinomadura sp. 5–2. Chem. יורו י' 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. סאנו, ש.; איקאי, ק.; קטיאמה, ק.; Takesako, K.; נקאמורה, ט.; אובאישי, א.; עזור, י.; Enomoto, H. OF4949, מעכבים חדשים של aminopeptidase B. II. הבהרת מבנה. J. אנטיביוט. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. סיאסולו, ל.; קאספולו, א.; Cutignano, A.; ביפולקו, ג.; דביטוס, ג; הופר, ג'; גומז-פלומה, ל.; Riccio, R. Renieramide, טריפפטיד מחזורי מהספוג של ונואטו Reniera n. sp. J. Nat. לְדַרבֵּן. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. סולאנו, פ.; בריגנטי, ש.; פיקרדו, מ.; Ghanem, GH סוכני היפופיגמנטציה: סקירה מעודכנת על היבטים ביולוגיים, כימיים וקליניים. פיגם. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. ויסר, ע"א; נובר, ט.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. בחינת הפוטנציאל לאקטינובקטריה כסימביונטים הגנתיים בטרמיטים המגדלים פטריות. מיקרוב. אקול. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: עורך יישור וניתוח רצפים ביולוגיים ידידותי למשתמש עבור Windows 95/98/NT. סימפטום חומצות גרעין סר. 1999, 41, 95–98.

23. פרואס, ע.; Peplis, J.; Glöckner, FO SINA: יישור רצפים מרובים בתפוקה גבוהה מדויקת של גנים ריבוזומליים של RNA. ביואינפורמטיקה 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. סאיטו, נ.; Nei, M. שיטת הצטרפות השכנים: שיטה חדשה לשחזור עצים פילוגנטיים. מול. ביול. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. עצים אבולוציוניים מרצפי DNA: גישת סבירות מקסימלית. י.מול. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. קומאר, ש.; סטכר, ג.; Tamura, K. MEGA7: ניתוח גנטיקה אבולוציונית מולקולרית גרסה 7.0 עבור מערכי נתונים גדולים יותר. מול. ביול. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. תמורה, ק.; Nei, M. אומדן מספר החלפות הנוקלאוטידים באזור הבקרה של DNA המיטוכונדריאלי בבני אדם ושימפנזים. מול. ביול. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: גישה המשתמשת ב-bootstrap. אבולוציה 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

זמינות לדוגמה:

דוגמאות של התרכובות אינן זמינות מהמחברים.

For more information:1950477648nn@gmail.com