חלבון 75 מווסת מורטלין/גלוקוז מקדם את העמידות לציספלטין של סרטן הקיבה

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר

טיפול תרופתי פלטינום הוא אחת האסטרטגיות הכימותרפיות הבולטות ביותר עבור חולים עם סרטן קיבה (GC). עם זאת, ההשפעה הטיפולית פחות משביעת רצון, בעיקר בשל העמידות הנרכשת לתרופות פלטינה. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים יכולה לשפר מאוד את היעילות הטיפולית של GC. במחקר זה, מטרתנו הייתה לחקור את התפקודים/מנגנונים הקשורים להתנגדות כימותרפיה ואת המשמעות הקלינית של חלבון 75 (GRP75) ב-GC. כאן, הנתונים שלנו הראו כי בהשוואה לתאי SGC7901, הביטוי של GRP75 היה גבוה יותר באופן ניכר בהתנגדות לציספלטין (תאים (SGC7901 *). נוק-דאון של GRP75 ביטלה את השמירה על פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MP) ועיכבה את הגורם הגרעיני אריתרואיד {{ 10}}גורם 2 קשור (NRF2), phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B (Pl3K/AKT), גורם 1a הניתן להיפוקסיה (HIF-1a), ו-c-myc, שהביאו לחסימת ההפעלה של המטרות שלהם במורד הזרם. תהליכים אלה החלישו את יכולות נוגדות החמצון/אפופטוזיס ושינו את התכנות המטבולי מחדש בתאי SGC7901, מה שהוביל לרגישות מחדש של תאים אלה לציספלטין. עם זאת, ביטוי יתר של GRP75 בתאי SGC7901 גרם להשפעות הפוכות. איששו את התוצאות הנ"ל. בחולי GC שקיבלו כימותרפיה פלטינה ומטה-אנליזה, רמה גבוהה של GRP75 הייתה קשורה באופן חיובי למאפיינים אגרסיביים ופרוגנוזה גרועה, כולל אך לא רק גסטר. סרטן המעי והיה מנבא בלתי תלוי להישרדות הכוללת. ביחד, המחקר שלנו הצביע על כך ש-GRP75 היה מעורב בהתנגדות לציספלטין של GC וש-GRP75 יכול להיות יעד טיפולי פוטנציאלי לשחזור התגובה לתרופה בתאי עמידות לפלטינה וכלי פרוגנוסטי תוסף מועיל בהנחיית ניהול קליני של חולי GC.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

סרטן הקיבה (GC) היה השכיחות המובילה הראשונה והתמותה השנייה של סרטן מערכת העיכול בסין. הטיפולים הנוכחיים עבור GC מתקדם היו ניתוח הניתוח בשילוב עם כימותרפיה מערכתית, אך שיעור ההישרדות לטווח הארוך היה פחות משביע רצון בגלל ההישנות הגבוהה לאחר הניתוח2. בפרקטיקה הקלינית, תרופות פלטינה היו אחד מהקו הראשון לתרופות מתקדמים כימותרפיה GC3. עם זאת, עמידות נרכשת לתרופות התרחשה תמיד לאחר מחזורים מרובים של טיפול מבוסס פלטינה ומצביעה על פרוגנוזה גרועה.cistanchלכן, הארת המנגנונים הפוטנציאליים וזיהוי האסטרטגיות הטיפוליות החדשות להתגבר על עמידות לתרופות פלטינה בחולי GC היו חיוניים בדחיפות.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

חלבון 75 מווסת גלוקוז (GRP75) היה המלווה המולקולרי הניתן ללחץ והשתייך למשפחת חלבוני הלם חום4. ביטוי יתר של GRP75 היה קשור קשר הדוק להתקדמות הגידול בסוגי סרטן אנושיים שונים5-7. כאן, באמצעות בחינת מטה-אנליזה, מצאנו שרמה גבוהה של GRP75 מצביעה על פרוגנוזה גרועה באופן משמעותי במספר סוגי סרטן של מערכת העיכול (סרטן המעי הגס, כלנגיוקרצינומה וסרטן הלבלב). עבור עמידות לתרופות, עיכוב של GRP75 הפך את העמידות לציספלטין ודוקסורוביצין בקרצינומה כבדית וסרטן השחלות ". GRP75 סידר באופן קלאסי את ה-p53 בציטופלזמה, מה שהוביל לביטול תפקוד p53 ודיכוי ה-app-tosis10. מחקר קודם דיווח כי GRP75 לגידולים חיוביים הייתה פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה לגידולים שליליים GRP75 ב-GC עם תפקוד תקין של p53. עם זאת, p53 היה אחד הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר ב-GC (השפיע על יותר מ-50 אחוז מהחולים)12-15. אז שיערנו שבנוסף לדיכוי הקלאסי של פעילות p53, GRP75 עשוי להיות מעורב בהשראת/שימור העמידות לתרופות פלטינה ב-GC באמצעות שימוש53-באופן עצמאי.

במחקר זה, הביטוי הגבוה יותר של GRP75 תרם לעמידות לציספלטין בתאי SGC7901 ובמודל xenografts. מבחינה מכאנית, GRP75 גרם/שמר עמידות לציספלטין באמצעות ויסות היכולות נוגדות החמצון/אפופטוטיות ותכונות התכנות המטבוליות מחדש.cistanche אוסטרליהבחולי GC, ביטוי יתר של GRP75 תרם למאפיינים האגרסיביים ולפרוגנוזה ירודה. התוצאות שלנו הצביעו על כך ש-GRP75 מקדם את העמידות לציספלטין ב-GC ויכול להיות סמן ביולוגי לניבוי התגובה לטיפול בתרופות פלטינה.יתרונות cistancheמיקוד GRP75 עשוי לספק הבנה חדשה של כימותרפיה מערכתית GC.

תוצאות

ההשפעות של GRP75 על עמידות לציספלטין במבחני הכדאיות של תאי GC הופעלו כדי לאמת את העמידות של תאי SGC7901~, ה-Ipsos (uM) של ציספלטין עבור תאי SGC7901 ו-SGC7901CR היו: 5.518 לעומת 72.46 (F). בהתבסס על מסדי נתונים של KM-Plotter, הביטוי המוגבר של GRP75 הצביע על פרוגנוזה גרועה (איור 1B). יתר על כן, עלייה ניכרת בביטויי GRP75 בתאי SGC7901CR בהשוואה לתאי SGC7901 של ההורים שלו (איור 1C), מה שמצביע על כך ש-GRP75 עשוי לתרום לעמידות לציספלטין. כדי לאמת השערה זו, תאי SGC7901~ הועברו ע"י siRNA של Scramble- או GRP75, וה-IC50s (uM) של cisplatin עבור תאי SGC7901CK שעברו טרנספקציה של siRNA או GRP75 היו: 50.83 לעומת 20, בהתאמה.{{29} .1D). בניגוד,

ביטוי יתר של GRP75 על ידי הטרנספקציה של הפלסמידים GRP75 לתאי SGC7901 הראה כי ה-IC50s של ה-cisplatin עבור תאי SGC7901 שעברו טרנספרציה או GRP75 פלסמידים היו 3.825 לעומת 6.98 (איור 1E). ביחד, תוצאות אלו חשפו ש-GRP75 מילאה תפקידים מכריעים בשמירה/גרימת עמידות לציספלטין ב-GC, אך המנגנונים נותרו חקירה נוספת.

מנגנונים פוטנציאליים שבבסיס GRP75 גרמו לעמידות לציספלטין

הורדנו מערכי נתונים של microarray GSE122130 (SGC7901CR לעומת SGC7901) ו-GSE14209 (רקמות, עמידים לציספלטין לעומת רגישים לציספלטין) מ-GEO, ולאחר מכן ביצענו את התהליך GO-Biological ו-KEGG-Pathway על בסיס העשרה וניתוח של DAVID10 העליון. התוצאות הוצגו באיור 2A-D. ההבדלים המהותיים של תהליכים ביולוגיים בין תאי SGC7901C* ותאי SGC7901 כללו הפחתת חמצון, תהליך אפופטוטי (איור 2A), ניתוח העשרה של KEGG-Pathway מצא שקבוצות DEGs נמצאות בקורלציה הדוקה עם מסלולים מטבוליים, ו-phosphatidylinositol kinase B kinase/proteinase B. (PI3K/AKT) מסלול (איור 2B). התגובה לתרופה נכללה בהבדלים המהותיים של תהליכים ביולוגיים בין רקמות גידול עמידות לציספלטין ורגישות לציספלטין, והמסלול המטבולי היה גם החוליה המרכזית בניתוח העשרה של KEGG-Pathway (איור 2C, D). חוץ מזה, רשת של 60 חלבונים שקיימו אינטראקציה משמעותית עם GRP75 נבנתה באמצעות מסד הנתונים של String, ואז ניתוח KEGG-Pathway הוכיח שמסלולים מטבוליים מילאו תפקיד חשוב בין GRP75 לבין האינטראקציות שלו (איור 2E). בהתבסס על תוצאות אלו, שיערנו שנוגדי חמצון/אפופטוזיס ותכנות מחדש מטבולי עשויים לקדם הישרדות וצמיחה של GC מה שמוביל לעמידות לציספלטין. עם זאת, המנגנונים של השתתפות GRP75 ברגולציה נזקקו למחקר נוסף (איור 2F).

השפעות של GRP75 על נוגד חמצון ואנטי אפופטוזיס כאן, רמת ה-ROS התוך תאית עלתה בתאי SGC7901CR בהשוואה למקביליו ההוריים (איור 3A), מה שמצביע על כך שתאי SGC7901Ck נחשפו לתנאי לחץ חמצוני גבוהים יותר יחסית. מחקר קודם גילה כי GRP75 היה מעורב בייצוב של MMP, מקור חשוב ליצירת ROS. כאן, נוק-דאון של GRP75 ביטל את התחזוקה של MMP בתאי SGC7901CK המושרה על ידי cisplatin, ולביטוי יתר של GRP75 הייתה השפעה הפוכה בתאי SGC7901 (איור 3B).כולסטרול cistancheלאחר מכן, אימתנו את הקשר בין GRP75 לבין אנטי חמצון ואנטי אפופטוזיס. כפי שמוצג באיור 3C, נוק-דאון של GRP75 הפחית את רמת הגורם הגרעיני-2-קשור לגורם 2 (NRF2) ואת גני היעד שלו במורד הזרם (HO-1 ו-NQO-1) ב-SGC7901 ~ תאים, וביטוי יתר של GRP75 הראו את ההשפעה ההפוכה בתאי SGC7901. יתר על כן, ביטול של GRP75 או NRF2 בתאי SGC7901CR שיפר עוד יותר את דורות ה-ROS התוך-תאיים, אפופטוזיס (איור 3D) ופעילויות קספאז-3 (איור משלים. S1) המושרה על ידי ציספלטין. לעומת זאת, ביטוי יתר של GRP75 בתאי SGC7901 החליש באופן משמעותי את דורות ה-ROS הנגרמות על ידי ציספלטין, אפופטוזיס של תאים (איור 3E), ופעילויות קספאז-3 (איור משלים. S1). תוצאות אלו גילו ש-GRP75 נשמר/מושרה עמידות לציספלטין עשויה להיות באמצעות גרימת אנטי חמצון ואנטי אפופטוזיס בתאי GC.

השפעות של GRP75 על תכנות מחדש מטבולי לאחר מכן, חקרנו עוד יותר לפיו GRP75 גרם לשינוי בתכנות מחדש מטבולי. עדויות מתגברות הראו שחילוף החומרים של תאי הגידול לא היה שינוי חריג במסלול מטבולי בודד, אלא תכנות מחדש של כל הרשת המטבולית התאית17. אונקוגנים או מסלולי איתות קלאסיים רבים היו מעורבים באופן ישיר או עקיף בתכנות מחדש מטבולי, כגון PI3K/AKT, גורם להפקת היפוקסיה la (HIF-la), c-myc וכן הלאה"'819. לכן, אימתנו אם GRP75 היה מעורב בתכנות מחדש מטבולי של תאי GC. כפי שמוצג באיור 4A, צפינו ברמות מוגברות של p-AKT, HIF-la ו-c-myc בתאי SGC7901CR בהשוואה לתאי SGC7901 ההורים שלו. יתר על כן, בתאי SGC7901CR, נפילה של GRP75 הוריד את רמות החלבון p-AKT, HIF-la ו-c-Myc המושרה על ידי ציספלטין, ואת המטרות שלהן במורד הזרם הקשורות לגליקוליזה (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvate dehydrogenase kinase l; ו-LDHA: lactate dehydrogenase A chain). להיפך, ביטוי יתר של GRP75 בתאי SGC7901 הראה את ההשפעה ההפוכה (איור 4B, C). יתר על כן, ביטול של GRP75 או AKT בתאי SGC7901CR הראה ירידה משמעותית בספיגת הגלוקוז ובכדאיות/גדילת התאים הנגרמת על ידי ציספלטין; ביטוי יתר של GRP75 בתאי SGC7901 באופן ניכר הגדילה את יכולת ספיגת הגלוקוז ואת הכדאיות/גדילה של התאים הנגרמת על ידי ציספלטין (איור. 4D-F). יחד, נתונים אלה הצביעו על כך ש-GRP75 שמר/השררה עמידות לציספלטין בתאי GC עשוי להיות באמצעות השתתפות בתכנות מחדש מטבולי בתיווך p-AKT, HIF-la ו-c-myc.

אישור של הנתונים במבחנה במודל xenograft לאחר מכן חקרנו את הרלוונטיות הקלינית הפוטנציאלית של GRP75 in vivo. נתוני ה-xenograft הצביעו על כך שטיפול ב-cisplatin בלבד או נוק-דאון של GRP75 בלבד יכול לעכב את צמיחת הגידול; עם זאת, טיפול ב-cisplatin בשילוב עם נוק-דאון GRP75 הקל באופן משמעותי על עיכוב צמיחת הגידול המושרה על-ידי ציספלטין (איור 5A). יתרה מכך, מבחני IHC ו-qPCR הראו ש-cisplatin בתוספת GRP75 siRNA הפחיתו באופן משמעותי את הביטויים של Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT ומורד הזרם בהשוואה לטיפול ב-cisplatin בלבד, אך הגבירו את האפופטוזיס (כפי שנקבע על ידי צביעת TUNEL, איור 5B , ג). יחד, תוצאות אלו הצביעו על כך שבאמצעות ויסות יכולות נוגדות חמצון/אנטי אפופטוזיס ותכנות מחדש מטבולי, GRP75 עורר את ההישרדות והצמיחה in vivo, אשר בתורו הובילו לעמידות לציספלטין של GC.

זיהוי של GRP75 כגורם מקדם סרטן אופייני והמשמעות הקלינית של GRP75 ב-GC

לאחר מכן הערכנו את ביטוי GRP75 בקטעים עוקבים של דגימות GC. כפי שמוצג באיור 6A, בהשוואה לרקמות קיבה סמוכות שאינן גידוליות, נצפתה עלייה ניכרת של ביטוי GRP75 ברקמות GC. ביטוי יתר של GRP75 הודגם ברקמות GC על ידי ציון עוצמת IHC (איור 6B). צביעה חזקה יותר עבור GRP75 נצפתה גם עם הגדלת סיווג TNM של שלב הגידולים הממאירים (איור 6C, D). לאחר מכן, חילקנו את 116 דגימות ה-GC הללו לשתי קבוצות ("GRP75 נמוך" לעומת GRP75 גבוה", לפי עוצמת IHC, איור 6E). הקטרים ​​הרוחביים של גידולים בקבוצת "GRP75 high" היו גדולים משמעותית מאלה בקבוצת "GRP75 low" (איור 6F). אימתנו עוד את הפרוגנוזה הקלינית של GRP75 ב-GC. ניתוח ההישרדות של קפלן-מאייר הראה גם שלמטופלי GC בקבוצת "GRP75 high" הייתה הישרדות כללית גרועה יותר מאלו בקבוצת "GRP75 low" (איור 6G).

ניתוח רב-משתני זיהה כי GRP75 היה מנבא בלתי תלוי להישרדות כוללת (טבלה 1).תופעות לוואי של cistanche deserticola,לסיכום, תוצאות אלו הצביעו על כך של-GRP75 היה תפקיד אופייני בהובלת התקדמות GC, עמידות לציספלטין ופרוגנוזה גרועה. מטה-אנליזה של הרמה הגבוהה של GRP75 עם תרשים זרימת הפרוגנוזה של חיפוש הספרות והבחירה ומטה-אנליזה הוצגו באיור משלים. S2. מודל ההשפעה האקראית ומודל ההשפעה הקבועה שימשו לחישוב ולנתח את ערך HR, שניהם הראו שרמות גבוהות של GRP75 קשורות באופן מובהק לתוצאות גרועות של המטופל. HR מאוחד היה 1.91 (95 אחוז CI 1.62 עד 2.25), עם הטרוגניות (I'=0.0 אחוז ,p =0.559)(איור 7A). לאחר מכן ביצענו ניתוח תת-קבוצות, שהראה כי לרמת הביטוי של GRP75 בסרטן מערכת העיכול (HR המצטבר היה 1.99,95 אחוז CI 1.64 עד 2.43), יש קשר מובהק עם פרוגנוזה הישרדות לקויה. אין ספק, תוצאות דומות נמצאו גם בגידולים אחרים (איור מאוחד היה 1.74,95 אחוז CI 1.29 עד 2.33) (איור 7B). שניהם

עלילת המשפך של Begg והמבחן של Egger שימשו להערכת הטיית הפרסום האפשרית של המחקרים הכלולים. בניתוח הקשר בין GRP75 למערכת ההפעלה, ערך ה-p של הבדיקה של Begg ושל הבדיקה של Egger היו 0.076 ו-0.024, בהתאמה (איור 7C ו-D). עם זאת, למבחן של Egger יש רגישות גבוהה יותר בהערכת הטיית פרסום. לפיכך, נעשה שימוש בשיטת החיתוך והמילוי כדי להפוך את התוצאות שלנו לאמינות יותר. כפי שמוצג באיור 7E, HR המותאם במודל האפקט הקבוע היה 1.785 (95 אחוז CI 1.530 עד 2.081, p.<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

דִיוּן

במחקר זה, השתמשנו באחד מהתרופות הכימותרפיות הקו הראשון לחולים עם GC, תרופות פלטינה. באופן קלאסי, תרופות פלטינה יכולות להיקשר קוולנטיות לגואנין בשרשרת ה-DNA ובכך לחסום את השכפול והתעתוק של DNA2. עם זאת, בגלל עמידות לתרופות ותופעות לוואי לא רצויות, זיהוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות להיפוך עמידות בחולי GC היה חיוני בדחיפות. בנוסף, חולי GC פיתחו עמידות לתרופות לאחר שקיבלו מספר קורסים של cisplatin, והתוצאות שלנו הראו שתאי SGC7901 הפגינו עמידות משמעותית לציספלטין בהשוואה לתאי SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) מילאה תפקיד מפתח בוויסות ההתחלה וההתקדמות של סרטן אנושי-7. לאחרונה, התברר כי ל-GRP75 היה גם תפקיד קריטי בעמידות לכימותרפיה. "בנוסף ל-GRP75, חלבוני הלם חום אחרים מילאו תפקידים קריטיים בעמידות לציספלטין דרך PI3K/AKT/NF-KB ומסלולים אחרים21-24 עם זאת, המנגנון המולקולרי של תנגודת GRP75 וציספלטין דווח רק לעתים רחוקות. כאן, המחקר שלנו חשף ש-GRP75 מקדם יכולות נוגדות חמצון/אפופטוזיס ושינה תכנות מחדש מטבולי, מה שהוביל לעמידות לציספלטין בתאי GC. מצאנו גם ש-GRP75 היה מווסת ב-GRP75 SGC7901~ תאים ובדגימות רקמה של חולים, והיה בקורלציה עם עמידות לתרופות, פרו-הישרדות, גדילה ותוצאות גרועות. בינתיים, ניתוח רב-משתני זיהה ש-GRP75 היה מנבא בלתי תלוי להישרדות כוללת. מלבד זאת, מטה-אנליזה הצביעה על כך ש- רמה גבוהה של GRP75 הראתה פרוגנוזה גרועה, כולל אך לא רק GC, דבר שהיה עקבי מאוד עם המחקר שלנו. כל התוצאות לעיל אימתו כי מיקוד ל-GRP75 יכול צפוי להפוך לגישה חדשה להפיכת העמידות לציספלטין ולשפר את הפרוגנוזה של חולי GC.

בתנאים פיזיולוגיים, תאים נחשפו בהכרח ל-ROS מגורמים חיצוניים וממטבוליזם אירובי תוך תאי. כחרב פיפיות, ROS מתאימות היו מולקולות איתות חשובות המווסתות את התפקוד התקין של תאים, בעוד ROS מוגזם הוביל לאפופטוזיס. לכן, מערכת וויסות נוגד חמצון מדויק קיימת בגוף לשמירה על איזון חיזור והליכים אפופטוטיים 20. עם זאת, בניגוד למצבים פיזיולוגיים, רמות ROS של גידולים היו בדרך כלל גבוהות משמעותית מבקרות רגילות מאותו מקור רקמה, מה שקבע את קיומו של גידול מיוחד. מערכת נוגדת חמצון בתאי גידול, במיוחד עבור תאי גידול עמידים לתרופות27-29. התוצאות שלנו אישרו שתאי SGC7901CR הציגו רמה גבוהה יותר יחסית של ROS בהשוואה לתאי SGC7901 וכי GRP75 העלה את היכולות של נוגד חמצון/אפופטוזיס. לתאי גידול הייתה היסטוריה ארוכה של הפרעות מטבוליות. כבר בשנות ה-30 גילה אוטו ורבורג שתאי הגידול מעדיפים גליקוליזה. אפילו בתנאים מספיק חמצן, תאי הגידול עדיין שמרו על שיעורים גבוהים של גליקוליזה ליצירת ATP. דפוס מטבולי לא תקין זה כונה "אפקט ורבורג"3031. השינויים המטבוליים שהובילו אפקט ורבורג כונו לאחרונה כתכנות מחדש מטבולי, ומחקרים על שינויים אלה סיפקו הבנה עמוקה יותר של חילוף החומרים של תאי GC. הוכח שתאי GC ותאים נורמליים הראו הבדלים מטבוליים לא רק במטבוליזם של גלוקוז אלא גם במטבוליזם של שומנים וחומצות אמינו³2-35. במחקר זה, מצאנו ששינויים בחילוף החומרים של הגלוקוז היו אחד הליבה קישורים לשמירה על צמיחת תאים, מה שמוביל בסופו של דבר לתנגודת GC cisplatin.

כפי שציינו, אונקוגנים ומסלולי איתות קלאסיים כמו PI3K/AKT, HIF-la ו-c-myc היו מעורבים באופן ישיר או עקיף בתכנות מחדש מטבולי. הפעלה של מסלול PI3K/AKT בתאי גידול שיפרה הרבה מהפעילויות המטבוליות. ראשית, הוא איפשר לתאים את הספיגה של גלוקוז, חומצות אמינו וחומרים מזינים אחרים. שנית, AKT הגביר את הגליקוליזה וייצור הלקטט באמצעות השפעותיו על ביטוי גנים ופעילות האנזים והספיק כדי לעורר אפקט War-burg בתאים סרטניים. שלישית, הפעלה של מסלול זה הגבירה את הביוסינתזה של מקרומולקולות ועוררה את הביטוי של גנים ליפוגניים וסינתזת שומנים'7. יתרה מזאת, GRP75-הפעיל AKT וקינאזות חלבון 1 ו-2 מווסתות אותות חוץ-תאיים עיכבו שינויים בקונפורמציה של Bax ואפופטוזיס 8. תאי גידול מותאמים להיפוקסיה הכוללים תכנות מחדש מטבולי באמצעות גנים מטרה HIF-la להגביר את הוויסות כדי לעורר ספיגת גלוקוז, גליקוליזה, ייצור והפרשה של חומצה לקטית, אחסון גליקוגן, גלוטמין קט-בוליזם³, וקידום הצטברות של טריגליצרידים בטיפות שומנים³. לאחרונה התברר ש-GRP75 יכול להיקשר ספציפית ל-HIF-la ולמקד את הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, הקשורה עם VDAC1 ו-HK2, שמנעו אפופטוזיס'. C-myc יכול לתווך תכנות מחדש מטבולי במספר דרכים, ותכנות מטבולי בתיווך c-myc הושג במידה רבה על ידי השפעה על המיטוכונדריה. מצד אחד, c-myc גם קידם גליקוליזה על ידי ויסות ישיר של הביטוי של אנזימים הקשורים לגליקוליטים, כולל LDHA, HK2 ו-PDK11938. מצד שני, אנזימים משופעלי c-myc המעורבים במטבוליזם של גלוטמין באמצעות שעתוק קידמו את השימוש של גלוטמין על ידי מיטוכונדריה בתאי גידול. השפעה זו נקראת "גלוטמינוליזה". יתר על כן, ביטוי יתר של GRP הפחית את Cyclin-B1 ומגביר את ה-Cyclin-D1 ואת c-myc כדי לקדם את צמיחת תאי סרטן השחלות*. בהתבסס על התוצאות הנוכחיות שלנו, סיפקנו הבנה חדשה של תנגודת GC cisplatin באמצעות GRP75 כקישור חשוב פוטנציאלי בוויסות של רשתות תכנות מחדש של גידולים מטבוליים.

מסקנות

לסיכום, הדגמנו שביטוי יתר של GRP75 יכול לקדם הישרדות/צמיחה בתאי GC על ידי ויסות אנטי חמצון/אפופטוזיס ורשתות תכנות מחדש מטבוליות, ובכך לגרום להתנגדות לציספלטין

חומרים ושיטות

תאים, ריאגנטים ותנאי תרבית

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 אחוז טוהר), נרכש מסיגמא-אלדריץ' (שנחאי, סין). תאים תורבו במדיום RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, ארה"ב), בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/ml פניצילין, 100 ug/ml סטרפטומיצין (Gibco), והודגרו ב-5 אחוז CO2 ב-37 מעלות. לשמירה על הפנוטיפ העמידות לציספלטין, תאי SGC7901CR הודגרו במדיום המכיל cisplatin （5μM）.

Xenografts וטיפולים

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג, ובעלי חיים טופלו בצורה אנושית ובהתייחס להקלת הסבל. העכברים העירומים BALB/c הושגו ממרכז החיות של מעבדת SLRC (שנחאי, סין) ונשמרו באופן קונבנציונלי כפי שתיארנו קודם*. עבור מחקר xenograft, תאי SGC7901CK של 2×10 מעלות במטריג'ל של 100ul הוזרקו תת עורית לצידי העכברים למשך 5 שבועות. כדי לקבוע את ההשפעות של GRP75 על העמידות לציספלטין של GC, ביצענו את מבחן ההזרקה התוך-גידולי והתוך-צפקי. בקצרה, עכברים חולקו באופן אקראי ל-4 קבוצות (5 עכברים לקבוצה):(1)MOCK,(2)GRP75KD,(3)MOCK＋cisplatin, ו（4） GRP75 KD＋cisplatin. 100 ul של siRNA (si-Con או si-GRP75, 100nM) היו זריקות תוך גידוליות כל 3 ימים. הקבוצות שקיבלו טיפול ב-cisplatin (5 מ"ג/ק"ג) היו זריקות תוך-צפקית 3 פעמים בשבוע והקבוצות האחרות חולפו בנפח שווה של תמיסת מלח. גידולים נמדדו מדי שבוע והנפחים שלהם חושבו באמצעות הנוסחה: V=Y (אורך רוחב2). לאחר 5 שבועות, העכברים הוקרבו, ורקמות הגידול הוסרו להמשך חקירה.

חולים ודגימות רקמה

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף השני, האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג, ובית החולים צ'אנגג'ואו מס' 2 המסונף של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג והסכמות מדעת של המשתתף התקבלו מכל מטופל. הנתונים המרפאתיים-פתולוגיים רשומים בטבלה משלימה S1. מיקרו-מערך הרקמות נבנה על ידי Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (שנחאי, סין) כפי שתיארנו קודם*

העברת תאים

עבור טרנספקציה, מקושקשת ו-pcDNA-3.1-GRP75-הדגל סונתז על ידי General Biotech (שנחאי, סין); בעוד siRNAs היו רשומים בטבלה משלימה S2. תאים הועברו באופן זמני באמצעות ריאגנט lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, ארה"ב), על פי פרוטוקול היצרן. בקצרה, תאים צופו על גבי 6-צלחות באר בצפיפות של תאים של 1×10 מעלות במדיום RPMI 1640 המכיל 10 אחוז FBS ללא אנטיביוטיקה. לאחר דגירה של 24 שעות, התאים הועברו באופן זמני עם 5 ng/ml מקושקשת או GRP75-Flag, או 20 nM si-Con או si-GRP75 למשך 12 שעות. לאחר ההעברה, התאים תורבו במדיום טרי בתוספת של 10 אחוז FBS למשך 24 שעות נוספות לפני שישמשו לניסויים אחרים.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR) הפריימרים שבהם נעשה שימוש נרשמו בטבלה משלימה S3. הבידוד של ה-RNA הכולל, השעתוק של ה-RNA ל-cDNA והביצועים של qRT-PCR עם מכשיר Applied Biosystems 7300HT היו כולם על פי המחקר הקודם שלנו 2. ה-actin הוגבר כדי להבטיח שלמות cDNA ולנרמל את הביטוי. שינויי קיפול בביטוי של כל גן חושבו בשיטת מחזור סף השוואתית (Ct) תוך שימוש בנוסחה 2-(4ACt)

מאמר זה מופק מתוך Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w