אבולוציה מולקולרית של חלבון קוטל חיידקים/הגדלת חדירות (BPIFA1) מסדיר את התגובות החיסוניות המולדות ביונקים חלק 1

תַקצִיר:

חלבון קוטל חיידקים/מגדיל חדירות, גורם ראשוני במערכת החיסון המולדת של יונקים, משתתף בהגנה חיסונית טבעית מפני חיידקים פולשים. BPIFA1 תורם באופן פעיל להגנת המארח באמצעות מנגנונים מרובים, כגון אנטיבקטריאלי, חומרים פעילי שטח, בקרת נוזלים משטח דרכי הנשימה ופעילויות אימונומודולטוריות. עם זאת, ההיסטוריה האבולוציונית וכוחות הברירה על הגן BPIFA1 ביונקים במהלך אבולוציה אדפטיבית אינם מובנים היטב. מחקר זה בדק את הגן BPIFA1 של בני אדם בהשוואה לזה של מיני יונקים אחרים כדי להעריך את הלחץ הסלקטיבי הנגזר מאבולוציה אדפטיבית. כדי להעריך אם התרחשה בחירה חיובית או לא, השתמשנו בכמה בדיקות אפשרויות שונות (M1 לעומת M2 ו-M7 לעומת M8).

הפרופורציות של אתרים שנבחרו בצורה חיובית היו מובהקים, עם ערך לומן סביר של 93.63 עבור חלבון BPIFA1. שרת הבחירה שימש באותו מערך נתונים כדי לאשר מחדש בחירה חיובית עבור אתרים ספציפיים על ידי שימוש במודל השילוב המכני-אמפירי, ובכך לספק ראיות נוספות התומכות בממצאים של בחירה חיובית. היו עדויות משכנעות לאותות סלקציה חיוביים בגנים BPIFA1 של מיני יונקים, שהיו משמעותיים יותר עבור סימני סלקציה ויצירת אותות.

חלבון BPIFA1, הידוע גם בשם LPLUNC1 או Nasopharyngeal Carcinoma-associated Gene 6 (NAG6), הוא חלבון המתבטא מאוד בדרכי הנשימה העליונות ובחלל הפה. חלבון BPIFA1 קשור קשר הדוק לחסינות.

מחקרים הראו כי לחלבון BPIFA1 יש השפעות אנטיבקטריאליות ואימונומודולטוריות. חלבון BPIFA1 יכול להיקשר ל-Escherichia coli פולשני ולהרוס את קרום התא שלו, ובכך למלא תפקיד אנטיבקטריאלי. בנוסף, החלבון BPIFA1 ממלא תפקיד אימונומודולטורי על ידי הפעלת מסלולי Toll-like receptor (TLR) 4 ו-TLR2, קידום תגובות דלקתיות, אפופטוזיס והפעלת תאי חיסון.

גם הקשר בין חלבון BPIFA1 למחלות בדרכי הנשימה נחקר רבות. לדוגמה, מחקרים הראו שרמת הביטוי של חלבון BPIFA1 במחלות דרכי הנשימה כמו אסתמה של הסימפונות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) קשורה קשר הדוק לחומרת המחלה. במיוחד בתנאי זיהום, ניתן להעלות משמעותית את רמת הביטוי של חלבון BPIFA1, ובכך להשתתף בוויסות התגובה החיסונית של מערכת הנשימה ואיזון הפלורה.

לכן, לא ניתן להתעלם מתפקידו של חלבון BPIFA1 במערכת החיסון, והקשר שלו עם מחלות וזיהומים בדרכי הנשימה זקוק למחקר מעמיק נוסף. לכן, עלינו להקדיש תשומת לב מיוחדת לשיפור החסינות שלנו. ל- Cistanche השפעה משמעותית על שיפור החסינות. הפוליסכרידים בבשר יכולים לווסת את התגובה החיסונית של מערכת החיסון האנושית, לשפר את יכולת הלחץ של תאי החיסון ולחזק את תאי החיסון. השפעה קוטל חיידקים.

לחץ כדי לדעת cistanche מזון מלא

ביצענו מבחני הסתברות שהשוו מודלים שונים על בסיס יחסי dN/dS כדי לזהות קודונים ספציפיים בלחץ בחירה חיובי. זיהינו אתרים שנבחרו באופן חיובי בתחום LBP-BPI של חלבוני BPIFA1 בגנום היונקים, כולל תחום קושר שומנים עם רמה גבוהה מאוד של סלקטיביות ל-DPPC. BPIFA1 מפעיל את מערכת החיסון המולדת של דרכי הנשימה העליונות בתגובה לאותות גנטיים רבים בגנום היונקים. ממצאים אלו מדגישים התקדמות אבולוציונית בהשפעות אימונו-רגולטוריות הממלאות תפקיד משמעותי בהגנות האנטיבקטריאליות והאנטי-ויראליות של מיני יונקים.

מילות מפתח:

BPIFA1; קוטל חיידקים; מערכת החיסון; אבולוציה מולקולרית; בחירה חיובית.

1. הקדמה

חלבון מגביר חדירות קוטלי חיידקים (BPI) הוא חלבון אנטי-מיקרוביאלי יעיל ביותר הקושר ומנטרל ליפופוליסכרידים המשתחררים מהממברנה החיצונית של חיידקים [1]. ידוע כי הגן המכיל BPI fold Family A member 1 (BPIFA1) הוא בעל השפעות על המערכת החיסונית המקומית, והשפעות אלו עשויות להשפיע על הצמיחה והפלישה של מיקרואורגניזמים [2]. אחד המנגנונים הפוטנציאליים העומדים בבסיס הקשר הזה הוא היכולת של BPIFA1 לשפר את ספיגת החיידקים על ידי תאים פגוציטים ואת יכולתם להשמיד אותם [3].

למרות שיש להם דמיון מינימלי ברצף, ל-BPI יש שני תחומים המאמצים את אותו קפל מבני [1,4]. פולשים לחיידקים גראם-שליליים מביאים לתגובת מארח משולבת הנעזרת בנוכחות חלבון קושר ליפופוליסכריד (LBP). LBP הוא חלבון קושר אנדוטוקסין הקשור באופן הדוק ל-BPI ומתואם איתו [5]. BPIFA1 שולט במיקרוביוטה הרירית ובאותות האינטרפרון הבסיסי. SPLUNC1 (לשעבר BPIFA1) הוא בן משפחה המכיל קפלי חלבון עם פעילויות אנטיבקטריאליות, פעילי שטח ואימונומודולטורים, שכולן תורמות להגנה על המארח. מערכת הנשימה היא האתר העיקרי לביטוי שלה [6]. SPLUNC1, ההומלוג האנושי של גן העכבר PLUNC, מציג את אותה דפוס ביטוי בדרכי הנשימה העליונות ובאזורי האף כמו ההומלוג העכבר שלו. פעולה אנטיבקטריאלית נגד חיידקים גראם-שליליים מוצגת על ידי החלבון האנטי-מיקרוביאלי המקודד [5]. בסרטן ריאות של תאים לא קטנים, הוא עשוי לשמש כסמן מולקולרי פוטנציאלי לאיתור מיקרוגרורות. גרסאות תמליל מרובות התגלו כתוצאה מהחבור החלופי של אזור 3' הלא מתורגם; עם זאת, האופי באורך המלא של רק שלוש מגרסאות התמליל הללו מובן [7].

הן לעכברים והן לבני אדם יש רמות משמעותיות של ביטוי גן BPIFA1 בחלק העליון של קנה הנשימה, אך ביטוי זה פוחת עם המרחק מקנה הנשימה, מגיע למינימום בהתפצלות הסימפונות של הגזע הראשי ואינו ניתן לזיהוי בפריפריה של הריאות. [8]. מחקרי ביטוי גנים נרחבים בעכברים ובבני אדם לא הצליחו לזהות BPIFA1 ברקמת ריאה היקפית [9]. מלבד רמות נמוכות מאוד של ביטוי mRNA של BPIFA1 בתימוס העכבר, לב החולדות ורירית הריח, BPIFA1 אינו מתבטא באף איברים או רקמות מחוץ למערכת הנשימה של מכרסמים [10]. אין אינדיקציה לכך ש-BPIFA1 mRNA קיים בכל אחת מהרקמות האנושיות הבאות: הלב, הכבד, המוח, הקיבה, המעי הדק, השליה, שריר השלד, הלבלב, הטחול, בלוטות לימפה תקינות, לימפוציטים היקפיים, ערמונית, אשך, או שחלה [11].

הביטוי של mRNA של BPIFA1 עוקב אחר דפוס הפצה דומה מאוד ברקמות עובריות ובוגרות. דפוס זה נצפה בשני סוגי הרקמות [1]. ביטוי יתר של BPIFA1 בעכברים מהונדסים יצר מקרופאגים מכתשי עם אופסוניזציה ופגוציטוזיס משופרת של ננו-צינוריות פחמן במודל של דלקת מבוקרת בדרכי הנשימה [12]. בנוסף, הוכח כי ננו-בקטריות גראם-שליליות מתמקמות יחד עם BPIFA1 בתוך תאי האפיתל של רקמות סרטן האף-לוע [13]. הדגימות נלקחו מחולים שזוהו בעבר כסובלים מקרצינומה של האף-לוע. ממצאי מחקר שנערך לאחרונה העלו שאינטראקציות בין BPIFA1 ל-LPS לא חיידקי יכולות להפחית את התגובה הדלקתית של הגוף הנגרמת על ידי LPS לא חיידקי. [1].

מגוון ההשפעות האנטיבקטריאליות שלו והשימור של המבנה שלו בחולייתנים נושמים באוויר מרמזים ש-BPIFA1 התפתח כדי לספק יכולות חיוניות להגנה על המארח [14]. עם זאת, בשל מיקומו בדרכי הנשימה הפרוקסימליות ורמתו הגבוהה בתנאים בסיסיים, BPIFA1 עשוי להיות הכרחי. הסיבה לכך היא שגורמים אנטי-מיקרוביאליים נמצאים בשפע בבעלי חיים [15]. כתוצאה מכך, נראה כי ל-BPIFA1 יש את ההשפעות המשמעותיות ביותר בהימנעות מזיהום וניקויו לפני פלישת פתוגנים. זיהומים חיידקיים במערכת הנשימה ניתנים למניעת הודות לתפקודים אלו, אשר עשויים לאותת על הפעלת חסינות וויסות משופר של תפקודים אחרים של דרכי הנשימה [15].

שינויים אדפטיביים בתגובה לדרישות סביבתיות נחשבים מוגבלים על ידי גורמים ביו-פיזיים, אך לא ניתן לחזות את ההיבטים המבניים של אתרים המכילים שינויים אדפטיביים על ידי שום תיאוריה אבולוציונית [16]. הסיבה לכך היא שהאילוצים הביו-פיזיים מגבילים את סוגי התחליפים המותרים לשמירה על תפקוד החלבון [17]. בחירה חיובית עשויה להיות נפוצה יותר בחלקים של חלבונים שבהם צפויה למוטציות השפעה נמוכה יותר מאשר בחלקים אחרים של החלבון, אם כי הדבר לא הוכח (למשל, אתרי ויסות אלוסטרי) [18]. עם זאת, אזורים תפקודיים צפויים להישאר שמורים באופן משמעותי במהלך האבולוציה, למרות ששינויים אדפטיביים קשורים לקיבוע מהיר של מוטציות חיוביות [19]. האבולוציה המולקולרית של רצפי חלבונים מושפעת באופן משמעותי מתהליך הברירה הטבעית.

ההתפתחויות האחרונות ברצף הגנום ושיטות הסקה אמינות ברמות פילוגנטיות ואוכלוסיות אפשרו לערוך הערכה מהירה וחזקה של קצבי האבולוציה וההסתגלות המונעים על ידי הברירה הטבעית [20]. הן ברמה הפילוגנטית והן ברמת האוכלוסיה, בוצעה כמות משמעותית של עבודה לבניית שיטות מסקנות. יתר על כן, הנגישות הגוברת של נתונים מבניים ותפקודיים של חלבונים אפשרה לחוקרים לבחון את ההשפעה של אילוצים מבניים ותפקודיים על האבולוציה וההסתגלות של רצפי חלבון [16]. בגלל הגבולות המוטלים על ידי המבנים והתפקודים שלהם, קצבי האבולוציה וההסתגלות שונים עבור חלבונים ואתרים שונים באותו חלבון [19].

עיקר הפונקציות של התא שלובות באופן מורכב עם הרשתות הרגולטוריות של ביטוי גנים המאפשרות לאורגניזמים לסבול רמות זיהום גבוהות יותר או למתן את ההשפעות של זיהומים אלו [21]. רוב המרכיבים המרכיבים את הפיזיולוגיה התאית קשורים קשר הדוק למערכות הוויסות של ביטוי גנים אלה, שהן לעתים קרובות התאמות אבולוציוניות ישנות [22]. מנגנונים אלה משכו מידה ניכרת של עניין במחקר שהשתמש בקבוצה מוגבלת של מיני מודל שעבורם מידע גנטי זמין [23]. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים שהובילו לאבולוציה של מערכות אלו או כיצד הן הסתגלו להגדרות סביבתיות מגוונות עם התקדמות הפיתוח.

מחקר זה נועד לחקור את המקורות האבולוציוניים של הגן BPIFA1 כדי לחשוף את התכונות הפיזיוכימיות שלו וליישם גנומיקה השוואתית כדי לספק הערכה של הגן במינים שונים של יונקים. ערכנו מחקרים השוואתיים מעמיקים של הגן חלבון קוטל חיידקים/מגדיל את החדירות (BPIFA1), המווסת את התגובה החיסונית המולדת ביונקים, כדי להבין טוב יותר כיצד גנים אלו פועלים. קיימת אפשרות שללחץ סלקטיבי תהיה השפעה משמעותית על התפתחות ההסתגלות. במחקר זה, אנו חוקרים את ההיסטוריה של גנים אלו במינים שונים של בעלי חוליות, כמו גם כיצד המגוון הגנטי והברירה הטבעית השפיעו על התפתחות משפחת הגנים הזו לאורך זמן.

2. חומרים ושיטות

2.1. אחזור וניתוח רצפים

רצפי חומצות האמינו ורצפי הנוקלאוטידים המקודדים של הגן BPIFA1 ב-34 מיני יונקים, כולל בני אדם כמין ההתייחסות במחקר זה, נאספו מ-GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, לגישה ב-20 ספטמבר 2021), והם היו מיושרים באמצעות הכלי Clustal Omega בתוכנת MEGA 6 [24]. שיטת הסבירות המקסימלית שימשה בתוכנת MEGA 6 ליצירת העץ הפילוגנטי עבור הגן BPIFA1. עץ זה נבנה על סמך היחסים האבולוציוניים בין הגנים. מבחן ה-bootstrap חישב את מספר ההחלפות הממוצע לכל אתר ואת אורך הסניף הממוצע על ידי שימוש בשיטת סבירות מקסימלית עם 1000 חזרות לקביעת אשכול טקסונומי. שיטה זו שימשה לבחירת טופולוגיה עבור ערכי סבירות יומן מתקדמים יותר [25,26]. שמות המינים ומספרי ההצטרפות המשמשים לחקר הגן BPIFA1 מסופקים בטבלה משלימה S1.

2.2. ניתוח בחירה

נעשה שימוש בגישות סבירות מקסימלית כדי להשוות את היחסים של dN/dS עבור כל אתר קודון כדי לזהות קודונים ספציפיים ברצפי גנים של יונקים BPIFA1 הנתונים לבחירה חיובית [27,28]. CODEML שבוצע ב-PAML [29] ושרת האינטרנט DATA MONKEY (https://www.datamonkey.org, ניגש אליו ב-29 בספטמבר 2021) [30] נוצלו לניתוח, והתוצאות סומנו באמצעות יחסי החלפה של קודונים היו גבוהים במידה ניכרת מ-1 עבור קודונים תחת בחירה חיובית. השלב הראשוני של מחקר זה היה לקבוע אם בחירה חיובית התרחשה או לא באמצעות מבחן יחס הסבירות המקסימלי.

ניתוח זה קבע את נוכחותם של אתרים עם יחס dN/dS גדול מאחד. במחקר זה, העמדנו מודל דיסקרטי (גנרי) שביצע פונקציה זו עם מודל null שאסר על התרחשות של אתרים בעלי ערך גדול מ-1 [31]. ניתוחים הושוו באמצעות התפלגות יומן סבירות (2∆l) עם df=4. השערת האפס (M7) טענה כי ההתפלגות מוגבלת על ידי הערכים 0 ו-1. מודל חלופי (M8) עם שני פרמטרים, אומגה (ω) ובטא ( ), מאפשר גזירת ערך מ- מערך הנתונים, שעשוי להיות גדול מ-1 [27]. ניתוחים באמצעות סבירות של אפקט קבוע (FEL), ספירת קדמונים בודדים (SLAC) וסבירות אפקט אקראית (REL) כולם מצאו שהגן BPIFA1 היה נתון לבחירה חיובית כאשר הושוו ערכים גלובליים עבור הבדלים נרדפים ושאינם נרדפים בכל אתר [32].

השלב השני היה לנצל את אומדן ההסתברות המקסימלית כדי לאתר מיקומי חומצות אמינו שהיו נושא לבחירה חיובית לאורך האבולוציה. משפט בייס, המנבא את ההסתברויות האחוריות של האתרים הכפופים לבחירה חיובית, שימש כדי להשיג מטרה זו. סלקציה חיובית נצפתה הפועלת במיקומים של חומצות אמינו עם הסתברויות אחוריות שנעות בין 95% ל-99% [33]. שאריות חומצות אמינו עם סבירות גבוהה שהערך גדול מאחד עברו הליך סלקטיבי. המודל השוויצרי ו-Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, גישה אליו ב-28 בספטמבר 2021) הם יישומים מבוססי אינטרנט המציגים את המיקומים של חומצות אמינו שנבחרו בצורה חיובית על מבני חלבון [34].

חזינו את המיקום של שימור אבולוציוני של חומצות גרעין וחומצות אמינו בחלבון באמצעות הכלי ConSurf (http://consurftest.tau.ac.il, גישה אליו ב-28 בספטמבר 2021), שהתבסס על הקשר הפילוגנטי בין רצפים [ 35]. רצף הקודון המיושר של BPIFA1 נבדק בגרסה 2.2 של Selecton (http://secton.tau.ac.il, גישה אליו ב-28 בספטמבר 2021), המאפשרת לקבוע את היחסים המגוונים של קודונים שונים בתוך הרצפים המיושרים. יחסים אלו נמדדו באמצעות גישת ההסקה בייסיאנית באמצעות מבחני סבירות שונים. זה בוצע כדי לאשר קודונים שנבחרו באופן חיובי [36]. יתרה מכך, תוצאות הבחירה הוצגו בצבעים שונים כדי לציין את קריטריוני הבחירה השונים.

2.3. ניתוח רקומבינציה

כדי למצוא עדות לרקומבינציה, ביצענו הליך בחירת מודל המבוסס על הסבירות הסטטיסטית שיכולה לנפות דרך יישורי רצף רבים בחיפוש אחר נקודות שבירה ולאתר DNA רקומביננטי סביר. טכניקה זו השתמשה באלגוריתם גנטי כדי לחפש ביישורים של מספר רצפים אחר נקודות עצירה של רקומבינציה כדי להשיג את מטרתה. גישת ה-GARD היא פשוטה לתפיסה, ניתנת להרחבה בקלות וניתנת להקבילה רבה. ניסויי סימולציה נרחבים הוכיחו כי השיטה מנצחת כלים עכשוויים אחרים כמעט בכל המקרים, במיוחד בנוגע לדיוק.

כדי לחקור את העדויות לרקומבינציה, רצפי הנוקלאוטידים הוערכו תחילה כדי לזהות הפלוטיפים (Na) ולהעריך את האתרים הפולימורפיים (S), המספר הממוצע של הבדלי נוקלאוטידים (K) ומגוון הנוקלאוטידים (π) באמצעות תוכנת DnaSP 5.10 [37] ]. זיהוי נקודות עצירה והערכת אותות רקומביננטיים ברצפי נוקלאוטידים בוצעו באמצעות כלי ה-GARD המקוון של שרת האינטרנט Datamonkey [38]. בנוסף, שימוש ב-GARD למסך רצפים לרקומבינציה מבטיח שלשיטות המתמקדות בזיהוי בחירה חיובית יש מאפיינים סטטיסטיים מקובלים.

2.4. ניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון

עניין רב הופנה לחקור כיצד אינטראקציות חלבון-חלבון נשמרות ממין אחד למשנהו. מכיוון שיש כמה מכשולים בזיהוי ואישור הניסויים של נתוני אינטראקטום, זה יהיה מסקרן להבין PPI המועבר ממין שהוכח במין אחר [39]. מאגר הנתונים של STRING הוא משאב ביואינפורמטיקה חינמי המכיל מידע המתאר כיצד חלבונים מתקשרים זה עם זה כחלק ממספר מסלולים. מספר הקווים המחברים כל צומת חלבון וערכי הביניים משמשים לזיהוי צמתים ביניים, המייצגים חלבונים הממלאים תפקידים ביולוגיים חשובים וקשורים זה לזה באופן אינטימי. יצירת הרשת בוצעה באמצעות STRING ותוכנת Cytoscape (http://www.cytoscape.org, שהגישה אליו ב-29 בספטמבר 2021) שימשה להצגת הרשת [40]. על ידי זיהוי האינטראקציות של חלבון-חלבון של BPIFA1 בין חלבוני מערכת החיסון וניתוח ביטוי משותף באמצעות STRING גרסה 9.1 (http://www.string-db.org, נגישה ב-29 בספטמבר 2021), הצלחנו לקבוע עוד יותר כיצד BPIFA1 מתפקד ברמה המולקולרית.

2.5. ניתוח מבני של חלבון BPIFA1

בניתוח זה, בנינו את המבנה הגבישי של החלבון האנושי BPIFA1 באמצעות מודלים הומולוגיים עם כלים מקוונים, כגון המודל השוויצרי (http://swissmodel.expasy. org, שאליו נגישה ב-29 בספטמבר 2021) [41], I-TESSAR [42], ו-Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, נגישה ב-29 בספטמבר 2021) [43]. שיטת שיפוע מצומד ושדה כוח Amber בתוכנת UCSF Chimera 1.10.1 שימשו להפחתת חלבון המטרה שהורכב. בנוסף, נעשה שימוש בשרת האינטרנט של ProSA כדי להעריך את המאפיינים הסטריאוכימיים של המבנה הצפוי [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com