ליזוזומלי ליפיד חמצון מווסת את חסינות הגידול

עיכוב ליזוזומלי הנגרם על ידי מעכבי Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) כגון DC661 יכול לייצר מוות של תאים, אך המנגנון לכך אינו מובן לחלוטין. מסלולי מוות מתוכנתים של תאים (אוטופגיה, אפופטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס) לא נדרשו כדי להשיג את ההשפעה הציטוטוקסית של DC661. עיכוב של קתפסינים, או קלציית ברזל או סידן, לא הצילו ציטוטוקסיות הנגרמת661- של DC. עיכוב PPT1 גרר חמצון ליזוזומלי שומנים בדם (LLP), מה שהוביל לחדירת קרום ליזוזומלי ולמוות של תאים שיכול להיות הפוך על ידי נוגד החמצון N-אצטילציסטאין (NAC) אך לא על ידי נוגדי חמצון אחרים של שומנים. טרנספורטר ציסטאין הליזוזומלי MFSD12 נדרש להובלה תוך-ליזוזומלית של NAC והצלה של LLP. עיכוב PPT1 יצר אימונוגניות פנימית של התא עם ביטוי פני השטח של קלרטיקולין שניתן היה להפוך רק עם NAC. תאים שטופלו ב-DC661- פיתחו תאי T נאיביים והגברו רעילות בתיווך תאי T. עכברים שחוסנו בתאים שטופלו ב-DC661- יצרו חסינות אדפטיבית ודחייה של גידולים בגידולים "חמים חיסוניים", אך לא בגידולים "קרים חיסוניים". ממצאים אלה מוכיחים כי LLP מניע מוות תאי ליזוזומלי, צורה אימונוגנית ייחודית של מוות תאי, המצביע על הדרך לשילובים רציונליים של אימונותרפיה ועיכוב ליזוזומלי שניתן לבדוק בניסויים קליניים.

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

מבוא

עם פעילות מעודדת בניסויים קליניים הכוללים את המעכב הליזוזומלי הידרוקסיכלורוקין (HCQ) (1), זיהוי של פלמיטויל-חלבון thioesterase 1 (PPT1) כמטרה מולקולרית של נגזרות של כלורוקין (2), והשקה של מעכבי PPT1 חדשים לקליניים בניסויים (3, 4), יש צורך להבין את המנגנון שבו מעכבי ליזוזומלי גורמים למוות של תאים ואת ההשפעה של עיכוב ליזוזומלי על חסינות הגידול. המנגנון הקנוני של מוות תאים ליזוזומלי המתואר עבור HCQ כולל פרמיביליזציה של ממברנה ליזוזומלית (LMP), דליפת קתפסינים והפעלה של אפופטוזיס בתיווך קספאז (5, 6). הראינו בעבר שהמעכב הליזוזומלי DC661 חודר לתאים במיקרו-סביבה של הגידול החומצי ומתמקם לליזוזום בצורה יעילה יותר מאשר HCQ (2, 7). DC661 מייצר מוות תאים חזק על פני קווי תאים סרטניים רבים (2). DC661 קושר ומעכב PPT1, מבטל את החומצה של הליזוזום ומעכב אוטופגיה. DC661 גם גורם ל-LMP ומגביר את רמות ה-caspase 3 מפוצל (2, 7). בשנים האחרונות הוגדרו מנגנונים חדשים של מוות תאים בעלי השלכות אימונוגניות וכוללים נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס (8). הוכח כי אוטופגיה תלוית ליזוזום מפרקת MHC Class I (9), כמו גם מרכיבים של האימונופרוטאזום (10), מה שמצביע על כך שעיכוב אוטופגיה יכול לשפר את עיבוד האנטיגן. עם זאת, ההשפעות האימונוגניות של עיכוב ליזוזומלי ומוות תאים בעקבותיו לא אופיינו במלואן. כדי להתמודד עם פער הידע הזה, חקרנו את ההשפעות של DC661 על מנגנוני מוות תאים קנוניים כדי לקבוע אם מוות תאים ליזוזומלי הוא צורת המוות של תאים שלו או פשוט מבשר לאחד מהמנגנונים האחרים המבוססים. מצאנו ש-HCQ ו-DC661 גרמו לעלייה משמעותית במספר קטן בלבד של חלבונים בפרוטאום המלנומה ורובם היו חלבונים הקשורים לאוטופגיה ואפופטוזיס. מעכבי מוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס) לא הפחיתו את ההשפעות הציטוטוקסיות לאחר פגיעה ליזוזומלית על ידי DC661. פרוקסידציה ליזומלית ליפידית (LLP) היא המניע העיקרי של מוות תאי המושרה על ידי LMP הקשור לביטוי קלרטיקולין (CALR) על פני התא. צורה זו של מוות תאים ניתנת לביטול רק על ידי שימוש בנוגדי החמצון N-אצטילציסטאין (NAC). פעילות NAC נפגעה עקב עיכוב של יבואן ציסטאין ליזוזומלי MFSD12. LLP העלה פנוטיפים אימונוגניים המקדמים הרג בתיווך תאי T. ממצאים אלה מוכיחים שמוות תאים ליזוזומלי הוא צורה ייחודית שעלולה להיות מוות אימונוגני של תאים.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

תוצאות

עיכוב ליזוזומלי גורם לשינויים משמעותיים בפרוטאום הקשור לאוטופגיה ואפופטוזיס. כדי לבסס את ההשפעות הציטוטוקסיות של מעכבי ליזוזומלי, הערכנו את הכדאיות של מלנומה A375P, קרצינומה של המעי הגס RKO ו-MIA PaCa -2 סרטן הלבלב מטופלים במעכבי ה-Vacuolar H+-ATPase bafilomycin-A1 (1 00 ננומטר); מעכבי PPT1 DC661 (3 מיקרומטר) או HCQ (10 מיקרומטר או 30 מיקרומטר); palmitate mimetic hexadecyl sulfonyl fluoride (HDSF; 60 מיקרומטר); מעכבי cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), או PepA+E64; ומפרק ממברנה ליזוזומלית Leu-Leu מתיל אסטר הידרוברומיד (20 מיקרומטר) למשך 48 שעות. רק bafilomycin-A1 ו-DC661 גרמו לירידה משמעותית בכדאיות התא על פני קווי התאים הסרטניים (איור 1A ואיור משלים 1A; חומר משלים זמין באינטרנט עם מאמר זה; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), כאשר DC661 מייצר הפחתה עמוקה יותר בכדאיות התא מאשר bafilomycin-A1. בהתבסס על נתונים אלה והתכונות הפרמקולוגיות הדומות לתרופות של נגזרות של כלורוקין, התמקדנו במחקר שלנו בנגזרות של כלורוקין ככלים להבנת מוות תאי ליזוזומלי. ניתוח פרוטאומה גלובלי חסר פניות הוחל על תאי מלנומה A375P שטופלו ב-DC661 (3 מיקרומטר) או HCQ הפחות חזק (10 מיקרומטר או 30 מיקרומטר) למשך 24 שעות. מתוך 4,264 החלבונים המכומתים בעלי ביטחון גבוה, רק 87 ו-55 חלבונים גדלו באופן משמעותי עם DC661 (3 מיקרומטר) ו-HCQ (30 מיקרומטר), בהתאמה; בנוסף, 14 ו-15 חלבונים ירדו באופן משמעותי עם DC661 (3 מיקרומטר) ו-HCQ (30 מיקרומטר), בהתאמה (שינוי קיפול מוחלט של יותר מ-2; q <0.05) עם DC661 (3 מיקרומטר) או HCQ (30 מיקרומטר), בהתאמה. , בהשוואה לשליטה ברכב. המינון הנמוך של HCQ (10 מיקרומטר) לא הראה שינויים משמעותיים בחלבון בהשוואה לבקרת הרכב. 50 החלבונים המובילים שהוגדלו באופן משמעותי בעקבות טיפול ב-DC661 היו קשורים בעיקר לאוטופגיה ואפופטוזיס, ושינויים דומים נצפו במינון הגבוה יותר של HCQ (איור 1B). מסיבות אלו, בחרנו להתמקד במחקרים נוספים ב-DC661 החזק יותר. דוגמאות לכמה משינויי החלבון הגדולים ביותר הקשורים באוטופגיה ואפופטוזיס היו 1-מחייב חלבון 1 (TAX1BP1; גדל פי 15-); BCL2-באינטראקציה חלבון 3 (BNIP3; גדל פי 6-); שכן של חלבון גן 1 BRCA1 (NBR1; גדל פי 12-); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; גדל פי 5-); Coactivator קולטן גרעיני 4 (NCOA4; גדל פי 3-); ו-LC3B (MAP1LC3B; גדל פי 3-). Apolipoprotein B-100 (APOB; גדל פי 66-) נגזר מסרום עגל עוברי ולא נחקר יותר. אימונובלוטינג אישר שטיפול עם DC661 או ריכוזים גבוהים יותר של HCQ יצר עליות ניכרות בביטוי של קולטני מטען אוטופגיה NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 ו-NCOA4 באופן תלוי מינון וזמן (איור משלים 1, B ו-C). CRISPR/Cas9 KO של PPT1 בתאי A375P העתיקו את ההשפעות של DC661 על חלבונים אלה בהשוואה לעמיתיהם ל-WT (איור משלים 1D). עם זאת, הביטוי של קולטני מטען אוטופגיה והעליות היחסיות שנגרמו על ידי טיפול ב-DC661 היו משתנים על פני סרטן המעי הגס, סרטן הלבלב וקווי תאי מלנומה אחרים שבהם DC661 מפגין ציטוטוקסיות (איור משלים 1E). זה הצביע על כך שקולטני מטען אוטופגיה עצמם, למרות שהם גדלים ברמת החלבון, לא צפויים להיות אחראים למוות תאי בעקבות טיפול ב-DC661. כדי לאשר זאת, התמקדנו בקולטני מטען אוטופגיה TAX1BP1 ו-BNIP3 מכיוון שהם יודעים השפעות פרואפופטוטיות בתאים סרטניים (איור 1C). TAX1BP1 הוא מתאם מטען אוטופגיה (11) וגם מווסת אפופטוזיס המושרה על ידי מעכבי סינתזת חלבון או חומרים מזיקים ל-DNA בתאים סרטניים (12). ביטול של TAX1BP1 על ידי siRNA (איור 1D) לא השפיע על ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי DC661- במבחני כדאיות לטווח קצר (איור 1E) ולטווח ארוך (איור 1F). תוצאות אלו הוכיחו ש-TAX1BP1 אינו ממלא תפקיד חיוני בציטוטוקסיות{126}}מתווכת DC. BNIP3 הוא חלבון פרואפופטוטי הפוגע בביו-אנרגטיה של המיטוכונדריה ומווסת את המיטופגיה (13). נפילה יעילה של BNIP3 (איור 1G) לא השפיעה על ציטוטוקסיות המושרה על ידי DC (איורים 1, H ו-I). תוצאות אלו הראו כי ההשפעות הציטוטוקסיות של DC661 אינן תלויות בביטוי BNIP3. לאחר מכן, חקרנו את ההשפעות של דלדול תאים של גנים אוטופאגיים קנוניים הנדרשים לייצור אוטופאגוזום על יעילות DC661 על ידי הפלה של unc-51 כמו אוטופגיה מפעילה קינאז 1 (ULK1) וגן 7 הקשור לאוטופגיה (ATG7). נוק-דאון יעיל של ULK1 או ATG7 (תמונה משלימה 2, A ו-B) עיכבה שטף אוטופגי (איור משלים 2C) אך לא השפיעה על ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי DC (איור 1, J-M). תוצאות אלו הראו כי היעדר מנגנון האוטופגיה החיוני הליבה אינו מבטל את ההשפעות הציטוטוקסיות של DC661. עיכוב ליזוזומלי על ידי DC661 גורם למספר מסלולי מוות מתוכנתים של תאים. נקודת המבט הקנונית היא שמוות תאים ליזוזומלי נובע מאפופטוזיס (5). אימונובלוטינג גילה שטיפול ב-DC661 הביא להפעלה של caspase-3, -7 ו--9 ולביקוע PARP-1, מה שמאשר ש-DC661 הפעיל אפופטוזיס (איור 2A). מעכב ה-pan-caspase Z-VAD-FMK מנע הפעלת קספאז על ידי DC661 אך לא עיכב את הצטברות LC3B ו-p62, מה שמוכיח שהפעלת אפופטוזיס וחסימת אוטופגיה ניתנים להפרדה בעקבות עיכוב ליזוזומלי (איור 2B). חסימת אפופטוזיס עם ZVAD-FMK לא הגדילה או הגבילה את הציטוטוקסיות של DC661, מה שמרמז על אפופטוזיס למוות תאים ליזוזומלי (איור 2, C ו-D). ההשפעות הציטוטוקסיות של DC661 היו דומות בתאי מח עצם ראשוניים של Bax/Bak כפול-KO שאינם מסוגלים לעבור אפופטוזיס ותאי WT (איור 2E). חסימת אפופטוזיס לא השפיעה על ציטוטוקסיות המושרה על ידי DC661- גם בסרטן המעי הגס ובתאים סרטניים של הלבלב (איור משלים 2, D-F). מכיוון שמצאנו שאפופטוזיס ניתנת לביטול עבור מוות תאי המושרה על ידי DC661-, חקרנו האם DC661 גורם לנקרופטוזיס, צורה נוספת של מוות תאי מתוכנת המווסת על ידי חלבון קינאז בעל אינטראקציה עם קולטן (RIPK) וחלבון דמוי תחום קינאז מעורב ( MLKL). רמות הצורות המפוזרות והמשופעלות של RIPK ו-MLKL עלו בעקבות טיפול DC661 מ-0.1-1 מיקרומטר (איור 2F). ב-3 מיקרומטר DC661 היה היעדר RIPK1 מזרחן אך MLKL מזרחן מתמשך, מה שמצביע על כך שבריכוז גבוה זה, ניתן להפעיל צורות נוספות של מוות תאי. טיפול מקדים עם מעכבי RIPK1 necrostatin-1 או necrostatin-1s או מעכב MLKL necrosulfonamide מנע זרחון של RIPK1 לאחר טיפול DC661 (1 מיקרומטר) בתאי מלנומה (איור 2G DC2) אך נכשל }}ציטוטוקסיות המושרה בתאי מלנומה (איור 2H) או סרטן המעי הגס או תאי סרטן הלבלב (איור משלים 2G). ממצאים אלה מצביעים על כך שהנקרופטוזיס מופעל אך ניתנת להפרדה עבור מוות תאי מתווך661-ב-DC.

איור 1. עיכוב אוטופגיה ליזוזומלית גורם לשינויים משמעותיים בחלבוני אפופטוזיס ואוטופגיה. (א)

ליזוזומים הם אחד מאתרי האחסון העיקריים של ברזל. מטבוליזם של ברזל תוך תאי לא מווסת יחד עם ירידה ביכולת ההפחתה יכולים לגרום למוות של תאים לא אפופטוטיים המכונה פרופטוזיס. סימן ההיכר של פרופטוזיס הוא וויסות העל של פרוסטגלנדין-אנדופרוקסיד סינתאז 2 (PTGS2), הומולוג 1 של הווסת קטיון (CHAC1) וסינתזת cysteinyl-tRNA (CARS) (14). כל 3 סמני הפררופטוזיס הללו הווסרו על ידי טיפול ב-DC661 (איור 3A), מה שמצביע על כך שעיכוב ליזוזומלי גורם לפרופטוזיס. DC661 גרם לשינוי פלואורסצנטי בתאי A375P שטופלו ב-C11-BODIPY, מה שמעיד על חמצון שומנים, אופייני לפרופטוזה. השינוי המושרה של DC661- התהפך באופן משמעותי בנוכחות מעכבי פרופטוזיס ferrostatin-1 או lip roxstatin-1 שניתנו בריכוז יעיל (איור 3B ואיור משלים 3A), מה שמצביע עוד יותר על כך ש-DC661 פרופטוזיס מושרה. עם זאת, עיכוב פרופטוזיס לא הציל את הציטוטוקסיות הקשורה ל-DC661 (איור 3, C ו-D). טיפול משותף של תאים סרטניים עם chelator ברזל deferoxamine (DFO) ו-DC661 לא הציל את הציטוטוקסיות של DC661 (איור 3E). טיפול ב-ferrostatin-1, lip roxstatin-1, או DFO לא הציל עיכוב DC661 של כדאיות לטווח קצר או צמיחה clonogenic לטווח ארוך בתאי סרטן מלנומה, המעי הגס והלבלב (איור משלים 3, B –ה, ואיור משלים 4, א-ד). נתונים אלה מוכיחים כי פרופטוזיס מופעלת אך ניתנת להפרדה עבור מוות תאי מתווך661-ב-DC. פירופטוזיס היא צורה של מוות תאי מתוכנת הקשור לתגובה דלקתית הכוללת הפעלה של קספסות המעבדות גסטרין (GSDM), המאפשרות היווצרות נקבוביות על קרום הפלזמה ושחרור לאחר מכן של דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק, כגון ניידות גבוהה. תיבת קבוצה 1 (HMGB1). טיפול DC661 בשורות תאים מרובות מלנומה (A375P, A375, WM35 ו-WM793) הביא להפעלה של initiator caspase-8 ו--9 ו-explainer caspase-7, אופייני לפירופטוזיס, ויוצר מחשוף של GSDME באורך מלא, דומה בהיקפו לגורם המוכר לפירופטוזיס PLX4720 ו-PD0325901 (איור משלים 5A). DC661 יצר שחרור חוץ-תאי חזק יותר של HMGB1 מאשר מעכב הפירופטוזיס הידוע, BRAF ו-MEK ב-1% FBS (15), המשקף את ההשלכה התפקודית של פירופטוזיס פעיל. לאחר מכן, בדקנו האם עיכוב של pyroptosis על ידי GSDME KO ישפר את ההשפעות הציטוטוקסיות של DC661. הטיפול ב-DC661 גרר הצטברות LC3II ו-SQSTM1/p62 והפעלת קספאז, אך שחרור HMGB1 בוטל כמעט לחלוטין בתאים אנושיים GSDME-KO WM35, מה שמוכיח שהתוצאה התפקודית של עיכוב פירופטוזיס הושגה (איור 3F). עם זאת, טיפול DC661 יצר ציטוטוקסיות שווה ב-YUMM1.7 WT, וקטור ריק (EV), ובתאים Gsdme KO1 ו-KO2 בתנאי FBS של 10% ו-1% (איור 3G ואיור משלים 5B). אחת התוצאות השכיחות של צורות מרובות של מוות תאי היא שחרור של LDH. DC661 יצר עלייה משמעותית בשחרור LDH, ולא ניתן היה לבטל זאת על ידי אפופטוזיס, נקרופטוזיס או עיכוב פרופטוזיס (איור משלים 5C). תוצאות אלו הראו ש-DC661 משרה אופנים מרובים של מוות תאי, כולל אפופטוזיס ופירופטוזיס וכן נקרופטוזיס ופרופטוזיס, אך אף אחד ממצבי המוות הללו של תאי אינו נדרש למוות תאי המושרה661-ב-DC. עיכוב קתפסין או קלציית סידן אינם מונעים מוות של תאים כתוצאה מחדירת ממברנה ליזוזומלית. לאחר שהוכחנו שהפעלת קספאז (שנדרשת לאפופטוזיס ופירופטוזיס) היא הכרחית למוות תאי המושרה661- של DC, שיערנו ששחרור קתפסין מליזוזומים עלול לגרום למוות תאים תלוי קספאז. עיכוב כימי (DC661) או גנטי (PPT1 siRNA [siPPT1]) של PPT1 יצר חדירות ממברנה ליזוזומלית (LMP), בעוד HDSF, מעכב בלתי הפיך בעל עוצמה פחותה של PPT1 שמתרוקן במהירות בתרבית תאים, לא יכול היה לגרום ל-LMP, כפי שנמדד. על ידי galectin -3–positive puncta (איור 4A). LMP מביא לשחרור של קתפסינים ותכנים ליזוזומים אחרים לתוך הציטופלזמה ונחשב כמאפיין פרוקסימלי מרכזי של מוות תאים מבוסס ליזוזום. LMP המושרה על ידי DC661 היה קשור לעלייה משמעותית בפעילות ציטופלסמית של cathepsin-L, אשר נחסמה באופן משמעותי עם מעכב ציסטאין פרוטאז E64 (איור 4B). דיווחים קודמים העלו כי שחרור קתפסין מליזוזומים שבור מעודד הפעלת קספאז, מה שמוביל למוות של תאים אפופטוטיים (16-18). עיכוב מוחלט של קתפסין לא מנע מחשוף קספאז (איור 4C) ולא הציל ציטוטוקסיות שגרמה DC661- במבחני כדאיות לטווח קצר וארוך טווח במלנומה (איור 4, D ו-E), סרטן המעי הגס והלבלב תאים סרטניים (איור משלים 6, A-C). תוצאות אלו נוגדות את ההשקפה הקנונית של מוות תאים ליזוזומלי, כפי שהיא מונעת על ידי מוות תאים בתיווך קתפסין. מלבד שחרור קתפסין מליזוזומים דולפים, שחרור סידן מליזוזומים היה מעורב בתפקוד תאי כאשר PPT1 פגום (19). הטיפול ב-DC661 הביא לשחרור נרחב של סידן, שבוטל על ידי טיפול מקדים של קלטור סידן קבוע (Ca{101}}), BAPTA-AM. (איור 4F). יש לציין, BAPTA-AM לא מנע מ-DC661-השראת LMP (איור 4G) או מחשוף קספאז (איור משלים 6, D ו-E) ובעיקר, לא הצילה ציטוטוקסיות הנגרמת661- של DC ( איור 4H). ממצאים אלה נצפו גם בשורות תאים RKO ו-MIA PaCa-2, בהן לא נצפו הבדלים משמעותיים בערכי IC50 עם BAPTA-AM ו-DC661 (איור משלים 6F), אשר הצביעו על כך שמוות תאים הקשור ל-LMP הוא לא תלוי בסידן או קתפסינים.

איור 2. DC661-מושרה אפופטוזיס ונקרופטוזיס. (א)

איור 3. DC661-מושרה פרופטוזיס ופירופטוזיס. (א)

LLP מניע את LMP. לאחר שקבע כי מעכבי מסלולי מוות תאים עיקריים (אפופטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס), קתפסינים (PepA ו-E64) ומכלאטרי יונים (BAPTA-AM [Ca2+] ו-DFO [Fe{{3} }]) לא מנע מוות של תאים על ידי DC661 ומציאת עדויות לחמצן שומנים על ידי C-11-BODIPY, ביצענו ניתוח ליפידום גלובלי שעתיים וארבע שעות לאחר הטיפול ב-DC661. DC661 גרמה לעלייה מוקדמת ומתמשכת 3- עד פי 10- בכל מחלקה של ליזופוספוליפידים (איור 5A). לעומת זאת, שינויים מזעריים או לא נראו בשיעורי פוספוליפידים, כולל פוספטידילכולין, פוספטידיל-אתנולמין, פוספטידיל-סרין, פוספטידילינוזיטול, פוספטידילגליצרול וחומצה פוספטית (איור משלים 7A). ניתן ליצור מינים של ליזופוספוליפידים על ידי ROS, המחמצן את שרשרת חומצות השומן הרוויה, אשר לאחר מכן מפורקת על ידי פוספוליפאז (20). כדי לקבוע אם נוגדי חמצון יכולים למנוע נזקי שומנים מתיווך ROS, חקרנו ציטוטוקסיות המושרה על ידי DC661- בנוכחות ה-pan-ROS-scaventer N-acetylcysteine ​​(NAC) (21, 22) ומעכבי חמצון שומנים משוערים Trolox (23) ) וויטמין C (חומצה אסקורבית) (24, 25). שלא כמו כל אחד מהסוכנים האחרים שנבדקו עד כה, טיפול משותף עם NAC הציל ל-DC661- ציטוטוקסיות על פני מספר שורות תאים (איור 5B ואיור משלים 7B). מבחני CFU ארוכי טווח הראו ש-NAC, שלא כמו כל מעכבי מוות תאי, קלאטורי יונים ומעכבי קתפסין שנבדקו כאן, מנעו את ההשפעות הציטוטוקסיות של DC661 בתאי A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 ו-MC38 ( איור 5C ואיור משלים 7C). באופן מעניין, Trolox וויטמין C לא הצילו ציטוטוקסיות DC661 במלנומה אנושית, סרטן המעי הגס, תאי סרטן הלבלב ומלנומה עכברת ותאי סרטן המעי הגס (איור 5D ואיור משלים 7, D-H). הפער הזה הניע אותנו לבדוק אם NAC, Trolox וויטמין C השפיעו על LMP. התוצאות שלנו הראו ש-NAC היה נוגד החמצון היחיד שהפחית באופן משמעותי את LMP661-מ-DC (איור 5E). שיערנו כי LLP מניע את ייצור LMP על ידי DC661, אשר עשוי להיות מוחזר על ידי NAC אך לא על ידי Trolox וויטמין C. כדי לחקור את תהליך ה-LLP השתמשנו בבדיקה הפלורסנטית FOAM-LPO (26), אשר מתמקמת באופן ספציפי לליזוזום ומייצרת שינוי ספקטרלי מ-586 ל-512 ננומטר (אדום לירוק) כאשר הוא נחשף לפרוקסיד ליפידים. מצאנו ש-DC661 גרם ל-LLP בהשוואה לבקרה (איור 5F). NAC הפחית את החמצן של שומנים בליזוזומים של תאי המלנומה המטופלים ב-DC661-, בעוד Trolox וויטמין C לא הצליחו להפחית את LLP (איור 5F). ל-NAC, Trolox וויטמין C בפני עצמם לא הייתה השפעה משמעותית על חמצון שומנים. נוק-דאון של PPT1 (איור משלים 8A), או טיפול עם ריכוזים גבוהים של HCQ (איור משלים 8B) גרמו גם הם ל-LMP שניתן לבטל על ידי NAC, בעוד שעיכוב כימי של ULK1 לא גרר LMP (איור משלים 8C). חשוב לציין, כיבוי של siPPT1 כלל גם LLP שניתן להפוך עם NAC (איור משלים 8D) תוצאות אלו הראו שעיכוב PPT1 גורם ל-LLP שניתן להצילו על ידי NAC והוא ככל הנראה הגורם ל-PPT1- של עיכוב LMP. יתר על כן, ממצאים אלה הצביעו על כך ש-LLP הוא קריטי למוות של תאים ליזוזומליים.

עשב סיני cistanche plant-Antitumor

יבוא של ציסטאין לליזוזומים על ידי MFSD12 מחליש מוות תאים ליזוזומלי. מתוך 3 מעכבי חמצון שומנים, רק NAC מנע LLP. דוח שנערך לאחרונה הראה כי תחום משפחת המנחה העיקרי המכיל 12 (MFSD12) הוא מרכיב חיוני של יבואן הציסטאין לליזוזומים ומלנוזומים (27). הסברנו ש-NAC, או המטבוליט שלו ציסטאין, מועבר לליזוזום דרך MFSD12, שם ציסטאין מתחמצן לדיסולפיד שלו, ציסטאין. כדי לבדוק השערה זו, השווינו את היכולת של NAC להציל ציטוטוקסיות DC661 בתאי siNT ו-siMFSD12 A375P-hGal{10}}EGFP. התוצאות שלנו הראו ש-NAC הצילה DC{11}}מעורר LMP בתאי siNT, אך לא הציל LMP בתאי siMFSD12 (איור 6A). NAC הפחית את ה-LLP של תאי siNT-A375P661-מטופלים ב-DC אך לא תאי siMFSD12. תאי siMFSD12 שטופלו ב-DMSO או NAC היו בעלי LLP בסיסי מוגבר (איור 6B) בהשוואה לתאי siNT. בעוד NAC הציל ציטוטוקסיות DC661 בתאי siNT, היכולת של NAC להציל ציטוטוקסיות DC661 בוטלה לחלוטין בתאי siMSFD12 (איור 6C). זה הראה ש-MFSD12 נוק-דאון חוסם את ההשפעות הציטו-פרוטקטיביות של NAC נגד DC661. NAC עובר דה-אצטילציה על ידי אצילאז בציטוזול (28). כדי לקבוע אם טיפול ב-NAC מייצר הצטברות של ציסטאין או ציסטין בתוך ליזוזומים, השתמשנו בטכניקת משקעים ליזוזומליים (Lyso-IP) (29) כדי לטהר ליזוזומים מתאי A375P שטופלו ב-DMSO וב-NAC (איור 6D ואיור משלים 9A) וביצענו מטבולומיקה ממוקדת כדי לכמת NAC ומטבוליטים קשורים. כצפוי, NAC זוהה בליזאט של תא שלם שטופל ב-NAC ושברים לא קשורים. רמות L-ציסטאין עלו באופן משמעותי בתוך ליזוזומים שטופלו ב-NAC. L-cystine היה ניתן לזיהוי רק בתוך ליזוזומים שטופלו ב-NAC. באופן מדהים, לא מצאנו עלייה משמעותית בגלוטתיון (מופחת) בקבוצות שטופלו ב-NAC (איור 6E); זה היה מפתיע כי מקובל להאמין שטיפול ב-NAC גורם לייצור מוגבר של גלוטתיון, ומתקן איזון חיזור. תוצאות אלו מצביעות על כך שציסטאין המיובא לליזוזומים דרך יבואן MFSD12 הוא קריטי להצלת LLP, LMP ומוות תאים ליזוזומלי. LLP הוא אימונוגני. כמה צורות של מוות תאים מווסת המושרה על ידי DC661 (פירפטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס) זוהו כאימונוגניות. בעבר, תואר מוות תאים אימונוגני עבור תרופות כימותרפיות המבוססות על מאפיינים אופייניים, הכוללים הצגת דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק, כולל ביטוי פני התא של CALR ושחרור חלבון HMGB1 ואדנוזין טריפוספט (ATP) (30). CALR פועל כאות "אכול אותי" כאשר הוא נחשף למשטחי תאים בזמן לחץ של תאים. שחרור חוץ-תאי של HMGB1 ו-ATP פועל כאות "מצא אותי" המזוהה על ידי תאים פגוציטים. השווינו שני מודלים: תאי B16F10, שבמודלים של גידול סינגניים הם נטולי לימפוציטים חודרים לגידול כמעט לחלוטין, ותאי MC38, שבמודלים של גידולים סינגניים אכן יש לימפוציטים חודרים לגידול. ראשית, הדגמנו שטיפול DC661 או siPpt1 גורם באופן משמעותי לביטוי CALR על פני השטח שניתן לבטל לחלוטין עם טיפול משותף NAC בתאי MC38 (איורים 7, A ו-B). ממצאים דומים נצפו בתאי B16F10 (איור 7C). מעכבי מסלולי מוות תאים עיקריים (אפופטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס) לא הצליחו למנוע את ביטוי פני השטח של CALR (איור 7D). כדי לקבוע אם מוות תאים אימונוגני המושרה על ידי DC661 נובע מ-MHC class I upregulation, תאי B16F10 ו-MC38 טופלו עם DC661 (3 מיקרומטר) או DMSO במשך 24 שעות. מצאנו שטיפול ב-DC661 לא הגביר את הביטוי של MHC class I ו-upregulation immunoproteasome (איור 7E ואיור משלים 9, B ו-C).

איור 4. עיכוב קתפסין או קלציית סידן אינם מונעים מוות תאי המושרה על ידי DC661-. (א)

כדי להבין את ההשפעות של עיכוב אוטופגיה על תחול תאי T, ביצענו ניסוי תחול ותרבות משותפת במבחנה באמצעות ספלנוציטים C57BL6/J כפי שתואר קודם לכן (31). לצורך הכנה, חשפנו ספלנוציטים לתאי B16F10 או MC38 שטופלו ב-DC661- או ב-DMSO. לאחר מכן, ספלנוציטים אלה תורבו עם תאי B16F10 או MC38 חיים, ונמדדה ציטוטוקסיות (איור 8A). ספלנוציטים עם תאי B16F10 שטופלו ב661-DC יצרו עלייה משמעותית ב-IFN- בהשוואה לספלנוציטים שנחשפו לתאי B16F10 שטופלו ב-DMSO. הרג בתיווך תאי T של תאי T של תאי B16F10 מתרבים גדל באופן משמעותי בספלנוציטים661-מתקדמים DC בהשוואה לספלנוציטים מודרכים DMSO (איור 8, B ו-C). תאי MC38 שטופלו ב-DC661 יצרו אפילו יותר ציטוטוקסיות של תאי T IFN ו-Primed בהשוואה לתאי B16F10 (איור 8, D ו-E). טיפול משותף של NAC עם DC661 הצליח לבטל לחלוטין את שחרור IFN- מספלנוציטים וציטוטוקסיות של תאי T קהה (איור 8, F ו-G). הדחת קלרטיקולין על ידי siCalr בתאי MC38 (איור משלים 9D) ביטלה את יעילות ההכנה של הטיפול ב-DC661 והפחיתה משמעותית את הציטוטוקסיות של תאי T (איור 8, H ו-I). יחד, נתונים אלה תומכים בתפקיד מכניסטי של וויסות עלייה של CALR הקשור ל-LLP בקידום חסינות תאי T אנטי-גידוליים. לאחר מכן, הרחבנו את הממצאים הללו במבחנה למחקר חיסון נגד גידולים in vivo במודלים של עכברים בעלי כושר חיסוני וחסר חיסוני. עבור בדיקה זו, תאי B16F10 או MC38 מטופלים בהקפאה במבחנה או מטופלים ב-DC{{40} הוזרקו sc בצד שמאל כדי להגן על עכברים בעלי יכולת חיסונית C57BL/6 או NOD/SCID מפני אתגר חוזר עם תאי גידול חיים מאותו סוג שהוזרקו 7 ימים לאחר מכן לתוך האגף הימני (איור 9A). תאי B16F10 שטופלו ב-DC661- לא הצליחו למנוע את דחיית הגידול למרות מבחני מבחנה, מה שמרמז ש-DC661 גרם למוות של תאים אימונוגניים (איור 9B ואיור משלים 9E). לעומת זאת, חיסון של אגף אחד עם תאי MC38 שטופלו ב-DC661- קידם דחייה מוחלטת של תאי MC38 חיים שהושתלו על האגף הנגדי (איור 9C ואיור משלים 9F). כדי לקבוע אם חסינות אדפטיבית הייתה קריטית להשפעת החיסון שנראה היה שיש ל-DC661 עם גידולי MC38, חזרנו על הניסוי בעכברי NOD/SCID. באופן מדהים, מצאנו שתאי MC38 שטופלו ב661-DC לא גרמו לדחייה של גידולים מאתגרים בעכברי NOD/SCID בעלי חסר חיסוני (איור 9D ואיור משלים 9G), מה שמצביע על כך שנדרשת חסינות אדפטיבית להשפעת החיסון שנצפה. כדי לבדוק את חוסנו של ממצא זה, בחרנו קו תאי סרטן אימונוגני ידוע נוסף, CT26, וביצענו את ניסוי החיסון כמפורט לעיל. כצפוי, ההשתלה של תאי CT26 שטופלו ב661- DC באגף אחד של העכבר יצרה אפקט דמוי חיסון ומנעה את הצמיחה של תאי CT26 חיים שהושתלו בצד השני (איור 9E ואיור משלים 9H). הממצאים שלנו העלו כי LLP המושרה על ידי DC661- הוא קריטי למוות של תאים אימונוגניים בתיווך LMP, שמתהפך על ידי ייבוא ​​ציסטאין לליזוזום על ידי טרנספורטר ליזוזומלי MFSD12 (איור 9F).

דִיוּן

עיכוב ליזוזומלי נראה כגישה טיפולית מבטיחה במחקרים פרה-קליניים, וניסויים קליניים של HCQ הניבו תוצאות מעודדות אך מעורבות (1, 32). PPT1 הוא המטרה המולקולרית של HCQ, ומעכבי PPT1 חזקים יותר, כגון DC661 (2) ו- GNS561 (3), גורמים למוות תאי בתיווך LMP במבחנה. המנגנון המדויק של מוות תאים ליזוזומלי ותפקידו באימונוגניות הגידול לא הובהר במלואו. חסינות נגד גידולים מוגברת כאשר עיכוב אוטופגיה משולב עם אימונותרפיה (9, 10, 31). המנגנונים המוצעים לאימונוגניות פנימית של התא בעקבות עיכוב אוטופגיה כוללים MHC Class I ו-Upregulation immunoproteasome, אשר שניהם תומכים בשיפור עיבוד והצגה של אנטיגן. בנוסף, אובדן חלבוני אוטופגיה או עיכוב אוטופאגיה על ידי תגובת תאי T מסוג CD8+ מוגדלת של כלורוקין על ידי הגדלת רמות פני השטח של MHC Class I בתאים דנדריטים (33). הראינו בעבר שעיכוב PPT1 מערכתי יכול לקטב מחדש מקרופאגים מפנוטיפ M2 ל-M1. מעכבי PPT1 יכולים לשפר את רמות STING, מה שמוביל לשחרור IFN ולהגברה של הרג בתיווך תאי T במודלים של מלנומה (31). כאן, הדגמנו כי LLP עצמו מייצר צורה אימונוגנית מהותית של תא גידול של מוות תאים. מצאנו שעיכוב ליזוזומלי גרר מעט מאוד שינויים בחלבון בתאי סרטן, והחלבונים המוגברים ביותר כללו קולטני מטען אוטופגיה ומווסתים של אפופטוזיס. הגישה שלנו המכוונת לחלק מהגנים הללו על פני פונקציות הראתה שחלבונים המושרים על ידי תרופות לא היו ככל הנראה המווסתים העיקריים של מוות תאי. עיכוב גנטי של ULK1 או ATG7 גם לא הציל ציטוטוקסיות DC661. הדגמנו שעיכוב ליזוזומלי מפעיל צורות מרובות של מוות תאי מתוכנת, כולל אפופטוזיס, נקרופטוזיס, פרופטוזיס ופירופטוזיס, אך כל אחד מהם היה נחוץ עבור ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות. יש לציין, מנגנוני מוות תאי מתוכנתים יכולים לחפוף ומיקוד של מנגנוני מוות תאים מרובים יכול לספק ציטו-הגנה מפני מוות תאי בעקבות חדירת ממברנה ליזוזומלית. העבודה שלנו שללה מנגנונים תלויי קתפסין וסידן למוות תאי ליזוזומלי והדגישה את חשיבות ה-LLP כגורם הקובע הקריטי למוות תאי. מצאנו עדויות ל-LLP שהיה הפיך על ידי נוגד חמצון שהועבר לליזוזום, NAC והיה קריטי לחדירת ממברנה ליזוזומלית וציטוטוקסיות. NAC היה הגורם היחיד שיכול להפחית או להפוך את המוות של661- DC661-, ויכולת זו הייתה תלויה בנוכחות של טרנספורטר ציסטאין ליזוזומלי MFSD12. חוסר חדירה ליזוזומלית עשוי להיות הסיבה לכך שמעכבי חמצון שומנים משוערים אחרים, Trolox וויטמין C, לא הצליחו למנוע ציטוטוקסיות DC661. NAC מומר לציסטאין, אשר מיובא לליזוזומים ומתחמצן לצורתו הדיסולפידית, ציסטין. ציסטין מיוצא לציטוזול על ידי טרנספורטר ליזוזומלי אחר, cystinosis, שם הוא מופחת לציסטאין שממחזר מקורות תזונתיים פנימיים, מפעיל מחדש את המטרה של קומפלקס rapamycin 1 ומקדם אוטופגיה (34). מחזור חימצון-הפחתת זה של ציסטאין לציסטין (ליזוזומים) ובחזרה לציסטאין (ציטוסול) יכול להיות מנגנון הצלה אפשרי של NAC נגד ציטוטוקסיות DC661 או פגיעה ליזוזומלית כללית יותר בהקשרי מחלה אחרים שבהם הוכח כי NAC שימושי מבחינה טיפולית (35) . NAC לא רק הפך את DC661-השראת LLP ו-LMP אלא גם ביטוי פני השטח של סמן המוות האימונוגני של תאים קלרטיקולין. נדרש ביטוי משטח התא של חלבון CALR עבור הציטוטוקסיות המוגברת בתיווך תאי T המושרה על ידי ספנוציטים מתקדמים של DC661-, מה שמוכיח שעיכוב ליזוזומלי מייצר צורה ספציפית של אימונוגניות פנימית של התא.

בעוד שמחקרים קודמים הוכיחו שעיכוב ליזוזומלי יכול לשפר את הפעילות האנטי-גידולית של עיכוב נקודת ביקורת חיסונית בגידולי אגף מבוססים (9, 31), המחקר שלנו הוא הראשון למיטב ידיעתנו להדגים השפעה דמוית חיסון לגידולי MC38 אך לא לגידולי B16 ב תאי גידול שטופלו מראש ב-DC661 לפני ההשתלה. זה מדגים שמוות תאים ליזוזומלי יכול לגרום לאימוגניות מהותית של התא, אבל שינויים אלה כשלעצמם אינם סבירים מספיק כדי להפוך מיקרו-סביבה של גידול "קר חיסוני" למיקרו-סביבה של גידול "חסוני". המחקרים הקודמים שלנו במודלים של מיקרו-סביבה של גידולים "קור חיסוני" B16 ו-BRafCA PtenloxP Tyr: מודלים של עכברים מהונדסים גנטית של CreERT2 (31) הוכיחו שעיכוב ליזוזומלי מערכתי יצר השפעות על מקרופאגים הקשורים לגידול ותאי מדכא תאים מיאלואידים שהיו מספיקים כדי לשפר היעילות של אימונותרפיה. יכול להיות שהאימונוגניות הפנימית של התא משחקת תפקיד גם בגידולי קור חיסוניים אלה שהופכים מגיבים יותר ל-ICD בעקבות עיכוב ליזוזומלי. ההשפעה הדומה לחיסון של עיכוב ליזוזומלי שנצפתה בסביבת מעבדה מבוקרת עשויה להתורגם למרפאה ואולי לא, אבל היא יכולה להסביר מדוע לחלק מהחולים שטופלו ב-dabrafenib, trametinib ו-HCQ במלנומה מוטנטית BRAF שטופלה בעבר הייתה כזו עמוקה ועמידה תגובה על משטר זה (32). יש צורך במחקר נוסף כדי להבין כיצד עיכוב PPT1 מייצר ROS ליזוזומלי וחמצן שומנים. ויסות PPT1-תלוי של ה-V-ATPase והחמצה הליזוזומלית אינו הסבר מספיק מכיוון ש-bafilomycin מעכב חומצה ליזוזומלי אך אינו מייצר LMP (לא מוצגים נתונים). ההשלכות של ממצאים אלה מצביעות על כך שניתן לשלב באופן רציונלי מעכבי ליזוזומליים המשפרים את האימונוגניות הפנימית של תאי הגידול עם טיפולים המשפרים את ההפעלה של תאי T, או הסתננות למיקרו-סביבת הגידול, שעלולים להניב השפעות סינרגטיות.

איור 5. N-אצטיל ציסטאין מונע מוות תאים המושרה על ידי DC661-. (א)

שיטות

תרבית תאים. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), שורות תאים A549 (CRM-CCL-185) ועכבר B16F10 (CRL-6475) נרכשו מ-ATCC. קווי A375 אנושיים (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 ועכבר YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, ו-Gsdme KO1 ו-KO2) הושגו בבית. תאי MC38 ו-CT26 של עכבר סופקו על ידי אנדי מין, אוניברסיטת פנסילבניה. FL5.12 ו-IL-3-תלויי Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) תאי מח עצם ראשוניים הושגו מ- Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. קו התא האנושי Panc-1 (CRL-1469, ATCC) סופק על ידי Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. קו התאים YUMMER 1.7 של העכבר התקבל מ- Xiaowei (George) Xu, אוניברסיטת פנסילבניה. כל שורות התאים נבדקו ל-Mycoplasma מדי שנה על ידי מתקני הליבה של אוניברסיטת פנסילבניה ואומתו באמצעות טביעת אצבע חוזרת קצרת טנדם על ידי ליבת Wistar Institute Genomics. קווי תאים A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 ו-Bax/Bak DKO תופחו ב-RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); קווי תאים A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 ו-MC38 תורבו ב-DMEM (Invitrogen, 11995); ו-YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, ו-Gsdme KO1 ו-KO2) (15) תורבו ב-DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). אמצעי תרבית נוספו עם 10% סרום בקר עוברי (12306C, MilliporeSigma) ותמיסת 1× אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית (Gibco, 15140-122). קווי תאים FL5.12 ו-Bax/Bak DKO נשמרו במדיה RPMI מלאה בתוספת של 50 מיקרומטר -מרקפטואתנול (Life Technologies, 21985-023), 10 מ"מ HEPES (H3537, MilliporeSigma), ו-0.35 ננוגרם/מ"ל ו-3.5 ננוגרם /mL IL-3, בהתאמה. קווי תאים YUMMER1.7 ו-YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ו-Gsdme KO) נשמרו במדיה שלמה בתוספת 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). תאי WM35 ו-WM793 תורבו במדיה MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), המכילה 10% FBS במדיום 1× Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7.5% w/v נתרן ביקרבונט ( Corning, 25-035-CI), 1× תמיסה אנטיביוטית אנטי-מיקוטית (Gibco, 15140-122), ו-5 ug/mL אינסולין (MilliporeSigma, I0516). תאים גודלו ב-37 מעלות בנוכחות 5% CO2. כימיקלים וריאגנטים. הכימיקלים שנרכשו כללו את HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) ו-DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) שימש כדי לצבוע את התאים עבור סידן לפי הוראות היצרן. רשימה של נוגדנים ומעכבים מסופקת בטבלה משלימה 1 ובטבלה משלימה 2.

איור 6. NAC הופך את ה-LLP באופן תלוי MFSD12-. (A–C)

מיצוי חלבון ועיכול עבור כרומטוגרפיה נוזלית - ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם עבור פרוטאומיקה. {{0}}.7 × 106 תאי מלנומה A375P תורבו בצלחות תרבית של 60 מ"מ. תאים טופלו ב-DMSO (בקרה), DC661 (3 מיקרומטר), HCQ (10 מיקרומטר), או HCQ (3{{70}} מיקרומטר) במשך 24 שעות ב-5{{ 112}}% מפגש. כדורי תאים קפואים חולקו עם 50 mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL פפסטטין, ו-1 ug/mL leupeptin. ליזטים מובהרים (10 ug כל אחד) עברו אלקטרופורזה באורך 0.5 ס"מ לתוך ג'ל ביס-טריס ואחריו קיבוע וצביעה בקומאסי קולואיד. כל נתיב ג'ל באורך 0.5 ס"מ נכרת, נמחק, הצטמצם עם טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין, עבר אלקיל עם יודואצטמיד, ועוכל עם טריפסין כפי שתואר קודם (36). העיכול (1 ug) נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדמית (LC-MS/MS) בספקטרומטר מסה Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) בקנה אחד עם nanoAQUITY UPLC (Waters). הפרדה אנליטית בוצעה על עמודת 1.7 מיקרומטר × 250 מ"מ פפטיד BEH C18 (Waters, 186003546) באמצעות שיפוע של 245-דקה עם 0.1% חומצה פורמית במים (פאזה ניידת A) ואצטוניטריל (פאזה ניידת B) כדלקמן. : 5%–30% B במשך 225 דקות, 30%–80% B במשך 5 דקות, החזקה של 15-דקות ב-80% B, וחזרה לתנאים ההתחלתיים. ספקטרום MS מלאים נרכשו ברזולוציה של 70,000, עם טווח סריקה של 400-2,000 m/z, יעד בקרת רווח אוטומטי של 3 × 106 יונים, וזמן הזרקה מקסימלי של 50 מילישניות. ספקטרות MS2 תלויות נתונים נרכשו עבור 20 היונים הנפוצים ביותר ברזולוציה של 17,500, עם רוחב בידוד של 1.5 מ"ר/ז, יעד בקרת רווח אוטומטי של 5 × 104 יונים וזמן הזרקה מקסימלי של 50 אלפיות שניות. התאמת פפטיד הוגדרה כמועדפת, ויונים לא מוקצים וטעונים יחיד נדחו (37). נתוני טרשת נפוצה גולמיים נותחו באמצעות MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) עם מסד נתונים של רצפים אנושיים של Uniprot (נגישה אליו ב-10 באוקטובר 2019) ומסד נתונים של מזהמים נפוצים, כולל טריפסין, קרטינים, חלבוני בקר, ומיקופלזמה (38). בחיפוש נעשה שימוש בספציפיות של פפטיד טריפטי עם מקסימום 2 מחשופים שהוחמצו, שינוי קבוע על ציסטאין (קרבמידו-מתילציה) וחמצון מתיונין משתנה או אצטילציה N-טרמינלית (39). ניתוק של 1% FDR שימש לפפטידים וחלבונים. התאמה בין ריצות הופעלה; חלבונים הוכמתו באמצעות כמות ללא תווית (40). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). חלבונים נדרשו להיות מזוהים על ידי לפחות 3 פפטידים ייחודיים ובעלי 3 ערכים תקפים (כמות שאינם אפס) בתוך קבוצת מדגם, ומזהמים וחלבונים הפוכים סוננו ממערך הנתונים. ערכים חסרים נזקפו מהתפלגות נורמלית. השוואות זוגיות בין מצבים בוצעו ברמת החלבון באמצעות 2-מבחן t Student's tailed עם FDR מבוסס פרמוטציה עם s0=0.1 ו-250 אקראיות. שינויים משמעותיים הוגדרו כ-FDR של פחות מ-5% ושינוי קיפול מוחלט הגדול מ-1.5 או 2.0, כמפורט. Lyso-IP. תאי A375P הודבקו ב-pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus ונבחרו באמצעות 1 mg/mL puromycin (MilliporeSigma, P4512). כ-3 × 106 תאי A375P מתויגים HA טופלו ב-10 mM NAC או בקרת רכב מים במשך 24 שעות בתנאי תרבית שתוארו קודם לכן. לאחר הטיפול, התאים נשטפו ב-PBS, נקצרו ב-0.5 מ"ל KPBS קר, והומוגגו בעדינות באמצעות 20 פעימות בהומוגנית של 2 מ"ל Dounce. כ-2.5% מההומוגנט נשמר לניתוח ליזט של תא שלם, והשאר עבר צנטריפוגה ב-3,000g למשך 2 דקות ב-4 מעלות כדי להסיר פסולת ממברנת התא. הסופרנטנט הומוגנאט הועבר לאחר מכן לצינור נקי של 1.5 מ"ל והודגרה עם 50 μL חרוזי אנטי-HA (Pierce, 88836) או חרוזי אנטי-DDK/דגל (OriGene, TA150042) למשך 15 דקות ב-4 מעלות. לאחר מכן זרעו דגימות על ידי הנחת צינורות על DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) וטלטלו בעדינות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט נשמר לניתוח שברים לא קשורים. IP נשטף 3 פעמים עם KPBS המכיל 8 mM CaCl2. ה-Lyso-IP חולץ ב-80% MeOH לניתוח מטבולומי. מיצוי וניתוח ליפידים באמצעות LC-MS/MS עבור ליפידום גלובלי. תאי מלנומה A375P נזרעו בכלי 60 מ"מ ב-0.7 × 106 תאים לכל צלחת. כאשר התאים היו בכ-50% מפגש, הם טופלו ב-DMSO (בקרה), DC661 (3 מיקרומטר) או HCQ (30 מיקרומטר) במשך 24 שעות. התאים נשטפו 2 פעמים עם HBSS, גרדו לתוך מתנול קר כקרח והועברו לצינורות זכוכית למיצוי שומנים עם כלורופורם/מתנול/0.88% NaCl (2:1:1) המכילים תקן שומנים פנימי EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). דגימות נערכו במערבולת ולאחר מכן בוצעו אמבט מים בצלילים במשך 5 דקות על קרח. לאחר צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 15 דקות ב-40 מעלות, השלב התחתון הועבר לצינור זכוכית אחר. השלב העליון חולץ מחדש באמצעות שלב תחתון סינטטי. לאחר סוניציה וצנטריפוגה, השלב התחתון שולב עם אוסף השלב התחתון הראשון. הדגימות יובשו תחת חנקן, הושענו מחדש ב-10% כלורופורם/90% מתנול, והועברו לבקבוקוני LTQ מזכוכית. דגימות ליפידים נותחו ב-Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X ספקטרומטר מסה ומערכת Vanquish Horizon UHPLC. ההפרדה האנליטית השתמשה בעמודת Accucore C30 (2.1 מ"מ × 150 מ"מ, Thermo Fisher Scientific) עם 50:50 אצטוניטריל/מים ו-88:10:2 איזופרופנול/אצטוניטריל/מים, כל אחד מכיל 5 מ"מ אמוניום פורמט ו-0.1% חומצה פורמית. נתוני LC-MS/MS נרכשו בנפרד בקוטביות חיוביות ושליליות עם הפרמטרים הבאים של המכשיר: MS1 scan 120,000 רזולוציה; MS2 תלוי נתונים על 20 היונים הנפוצים ביותר ברזולוציה של 15,000; רוחב בידוד של 0.4 מ"ר; ואנרגיית התנגשות מנורמלת מדורגת של 20:30:40 (43).

איור 7. N-אצטיל ציסטאין מונע ביטוי משטח קלרטיקולין המושרה על ידי DC661-. (מוֹדָעָה)

ליפידים זוהו ונכמתו באמצעות LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). מיני הליפידים שזוהו סוננו על ידי אדדוקטים צפויים וציון זיהוי בהתבסס על מעמד. אזורי השיא נורמלו לתקני EquiSPLASH עבור מחלקות נתמכות ונורמלו עוד יותר על סמך השטח הכולל של כל דגימה כדי לתקן את השונות במספר התא. ניתוח סטטיסטי בוצע על נתונים שעברו טרנספורמציה ביומן באמצעות Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). מיצוי וניתוח מטבוליטים באמצעות LC-MS/MS עבור מטבלון. מטבוליטים קוטביים חולצו מתאי שלמים, שברים לא קשורים Lyso-IP ודגימות הקשורות ל- Lyso-IP באמצעות 80% מתנול ואוחסנו ב-8{{30}} מעלות לפני כרומטוגרפיית נוזלים ניתוח ספקטרומטריית מסה (LC-MS). תמציות נותחו על ידי LC-MS באמצעות ספקטרומטר מסה Thermo Scientific Q-Exactive HF-X עם בדיקה HESI II בקנה אחד עם מערכת Thermo Vanquish Horizon UHPLC. הפרדת LC בוצעה באמצעות עמודת ZIC-HILIC (2.1 מ"מ × 150 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר, EMD Millipore) עם עמודת הגנה ZIC-HILIC (2.1 מ"מ × 20 מ"מ, EMD Millipore) המוחזקת ב-45 מעלות עם קצב זרימה של 0.2 מ"ל/דקה. כרומטוגרפיה בוצעה בתנאים חומציים כדי להפחית את התגובתיות של קבוצות תיול. שלב נייד A היה מים ו-B היה אצטוטריל, שניהם מכילים 0.1% חומצה פורמית. שיפוע ה-LC היה 85% B למשך 2 דקות, 85% B עד 20% B במשך 15 דקות, 20% B עד 85% B במשך 0.1 דקות ו-85% B למשך 8.9 דקות. הדגימה האוטומטית הוחזקה ב-4 מעלות, ו-4 μL מכל דגימה הוזרקו לכל אנליזה. נעשה שימוש בפרמטרים הבאים של MS: קצב זרימת גז נדן, 40 AU; קצב זרימת גז עזר, 10 AU; קצב זרימת גז לטאטא, 2 AU; טמפרטורת דוד גז עזר, 350 מעלות; מתח ריסוס, 3.75 קילו וולט למצב חיובי ו-3.5 קילו וולט למצב שלילי; טמפרטורת נימי, 375 מעלות; ורמת RF במשפך, 40%. כל הדגימות נותחו על ידי MS מלא עם החלפת קוטביות. סריקות MS מלאות נרכשו מ-65 עד 975 m/z ברזולוציה של 120,000 עם יעד בקרת רווח אוטומטי של 1 × 106 יונים וזמן הזרקה מקסימלי של 100 מילישניות. נתונים גולמיים נותחו באמצעות TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). מטבוליטים ממוקדים זוהו על ידי מסה וזמן שמירה מדויקים בקוטביות המועדפת עליהם בהתבסס על סטנדרטים אנליטיים. זיהוי שיא השתמש באלגוריתם ICIS עם החלקה של 1. כימות יחסי בוצע באמצעות אזור שיא משולב, וערכים אלו תוקנו לכמות הכוללת לדגימה (מוגדרת כשטח השיא הכולל). עריכת PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-לא מטרה ותאים KO הוכנו כפי שתואר קודם (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) היה מתנה מ-Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). אוליגוים של Guide RNA (IDT) חוללו, זרחנו ולאחר מכן קשרו לתוך פלסמיד pX459 מעוכל ו-dephosphorylated BbsI בעקבות פרוטוקולי מעבדה של Zhang, הזמינים דרך Addgene. פלסמידים מקושרים הומרו לתאי Stbl3 (Invitrogen). רצף של הכנת פלסמידים אישר את נוכחותם של רצפי ה-RNA המדריכים הרצויים. תאי A375P הועברו באמצעות Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), ולאחר מכן בחירת פורומיצין. מבחני סקר אישרו עריכה של הגן PPT1 על ידי CRISPR/Cas9, ודפיקת PPT1 אושרה על ידי Western blotting עם נוגדן PPT1 (Origene). הרצפים לאוליגו RNA מנחה הם כדלקמן: RNA מנחה ללא מטרה קדימה (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), RNA מנחה ללא מטרה לאחור (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), אנושי PPT1 מנחה RNA 1 קדימה (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), אנושי PPT1 מנחה RNA 1 מדריך הפוך 1 PPT1 מדריך RNA 1 הפוך קדימה (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), ו-PPT1 אנושי מנחה RNA 3 לאחור (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). השיבוטים הגדלים מתאי בודדים המשמשים במאמר זה כוללים את הדברים הבאים: שיבוט C8 הוא מדריך אנושי 1 ושיבוט B5 הוא מדריך אנושי 3. Immunoblotting. מיליון תאים צופו בצלחת של 10 ס"מ, וטיפולים ניתנו למחרת; תאים נאספו על ידי גרידה. ליזטים של תאים שלמים הוכנו באמצעות חיץ תמוגה SDS. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug חלבון שימש עבור SDS-PAGE והועבר על גבי ממברנת PVDF (Bio-Rad, 1620177). הממברנה נחסמה באמצעות 5% BSA או 5% חלב רזה, לפי תנאים אופטימליים, והודגרה עם נוגדן ראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות. ממברנות PVDF נשטפו עם 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) והודגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני מצומד ל-HRP ספציפי למין. לאחר מכן, הממברנות נשטפו ופותחו באמצעות מצע Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) וסרטי אוטורדיוגרפיה (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). עבור מחקרי פירופטוזה, ליזטים של חלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF. לאחר חסימה ב-5% BSA, ממברנות PVDF הודגרו עם הנוגדנים הראשוניים המצוינים למשך הלילה ב-4 מעלות, נשטפו ב-PBS/Tween, והודגרו עם נוגדנים משניים הצמודים לפרוקסידאז. פעילות אימונולוגית זוהתה באמצעות נוגדנים משניים מצומדים ב-HRP (CalBioTech), מצע כימי-לומינסנציה (Thermo Fisher Scientific) ומערכת הדמיה של ChemicDoc MP (Bio-Rad). עבור ניסויים הכוללים סופרנטנט, תאים תורבו במדיום ללא FBS כדי למנוע עיוות של SDS-PAGE. סופרנטנטים של תאים נקצרו וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-500 גרם ב-4 מעלות כדי להסיר פסולת תאים. הסופרנטנטים שהתקבלו רוכזו 10× באמצעות Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-4,500 גרם ב-4 מעלות. תרכיזים עורבבו עם חיץ מדגם ונותחו באמצעות Western blotting כמתואר לעיל. צביעת ג'ל חלבון בוצעה באמצעות צביעת פונסאו אדום. בדיקת פעילות LMP ו-cathepsin L. פלסמיד pEGFP-hGal3 אנושי היה מתנה מ-Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) ושימש ליצירת קו A375P-Galectin-3. עמוד השדרה של וקטור פלסמיד בקרת pEGFP-C1 נרכש (novo prolabs, V012024). פלסמידים הועברו (1 ug/mL) לתוך תאי A375P באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) לפי פרוטוקול היצרן; תאים שעברו טרנספקציה נבחרו ביציבות באמצעות G418 (Gibco, 10131035). עבור LMP, סה"כ נספרו 25 A375P-galectin-3 תאים פונקטה חיוביים בשדות תמונה מרובים. אחוז התאים הפונקטה חיוביים חושב בכל שדה בנפרד, ואחוז ממוצע חושב לכל קבוצה. ערכת הבדיקה Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) שימשה לפי פרוטוקול היצרן. תאים צולמו תחת מיקרוסקופ הפוך של Zeiss Axio Observer 7. העוצמה המשולבת הגולמית של Magic Red חושבה באמצעות תוכנת Fiji - ImageJ (NIH). מבחן חיוניות תאי MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide. 2,000 תאים צופו בשלושה עותקים בכל באר של 96-צלחת באר, ומבחני MTT של 3-יום בוצעו באמצעות ערכת Cell viability Kit (Roche, 11465007001) לפי פרוטוקול היצרן. טיפול מקדים של מעכבים ניתן למשך שעה, ולאחר מכן טיפול משותף של התאים עם מעכבים עם או בלי DC661. שיטת הרגרסיה הלא ליניארית (התאמה לעקומה) שימשה לחישוב IC50.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

בדיקת יצירת מושבות. 2,000 תאים לבאר נזרעו לצלחת 6-באר וטופלו למחרת; תאים נשמרו תחת הטיפול במשך 8 ימים בסך הכל. מושבות שנוצרו בכל באר נשטפו עם PBS, קבועים עם מתנול קר ב-20 מעלות למשך 20 דקות, והוצבעו בתמיסה מימית קריסטל 0.5% (V5265; MilliporeSigma).

בדיקת אי הכללת צבע טריפן כחול. תערובת התגובה למבחן Trypan blue הוכנה על ידי ערבוב של חלק אחד של 0.4% טריפן כחול (25- 900-CI, Corning) וחלק אחד של דגימות תאים מדוללות. התערובת הודגרה במשך דקה אחת, והתאים נספרו ב- Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

איור 8. ביטוי משטח של קלרטיקולין המושרה על ידי DC661- מקדם תאי T נגד תאי גידול. (א)

איור 9. חיסון של תאים שטופלו ב-DC661- מייצרת דחיית גידול בהקשרים ספציפיים. (א)

FOAM-LPO. LLP נחקר באמצעות בדיקה פלורסנטית, FOAMLPO. FOAM-LPO סונתז כפי שתואר קודם (26). תאים תורבו על 8 Wells μSlide (שם, 80807) וטופלו עם מעכבים ועם או בלי DC661. תאים הודגרו עם מדיה המכילה FOAM-LPO (1 M) באווירה של 5% CO2 ו-95% אוויר למשך 5 דקות ב-37 מעלות. התאים נשטפו פעמיים עם מדיה, ולאחר מכן נצפו תאים מתחת למיקרוסקופ (מיקרוסקופ הפוך של Zeiss Axio Observer 7) כדי לזהות מעבר פלואורסצנטי מ-586 ל-512 ננומטר בתגובה ל-LLP. qRT-PCR ופריימרים. תאי A375P (3 × 105) תורבו בצלחות של 60 מ"מ וטופלו ב-DMSO או DC661 (3 מיקרומטר) למשך 24 שעות. RNA כולל בודד עם ערכת בידוד RNA (QIAGEN, 74134) לפי פרוטוקול היצרן. cDNA סונתז באמצעות ערכת iScript Reverse Transcriptase עם 500 ng של RNA מטוהר לפי פרוטוקול היצרן (Thermo Scientific, K1642). תגובת qPCR הוגדרה באמצעות SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) המכילה 1 μL cDNA. כל המדידות בוצעו בשלושה עותקים, ו-BACTIN שימש כתקן פנימי לחישובי ΔCT. ניתוח ביטוי גנים נעשה באמצעות הפריימרים הבאים: PTGS2/COX-2 קדימה (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 הפוך (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS קדימה (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS הפוך (GACCAGGATGATGTCAACAG) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 לאחור (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN קדימה (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), ובאקטין לאחור (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

טרנספקציה של siRNA. מחקרים גנטיים של ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 ו-MFSD12 בוצעו בשורות תאים A375P. מחקרי עיכוב גנטי עבור Ppt1 עכבר ו-Calreticulin בוצעו בתאי MC38. siRNA לא יעד (sc{{10}}), ULK1 אנושי (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), עכבר Ppt1/Cln1 (sc-142398) ו-Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNAs נרכשו מ-Santa Cruz Biotechnology. siRNAs אלה מורכבים ממאגרים של 3-5 siRNAs ספציפיים למטרה. ציטומטריית זרימה. אינדוקציה של פרופטוזיס נמדדה באמצעות C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). תאי A375P נזרעו ב6-צלחת באר וטופלו ב-DMSO, ferrostatin{{40}} (10 מיקרומטר), רוקססטטין שפתיים-1 (2 מיקרומטר), אלסטין (5 מיקרומטר) ), DC661 (3 מיקרומטר), או שילוב למשך 24 שעות. תאים נקצרו על ידי צנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות. התאים הושעו מחדש ב-500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) המכילים 1 מיקרומטר C11-BODIPY והודגרו ב-37 מעלות למשך 15 דקות. תאים חולקו והוקפו מחדש ב-500 μL 1X HBSS, ועוצמת הקרינה נמדדה בציטומטר BD LSRII באמצעות 530/30 כחול (מתקן זרימה של אוניברסיטת פנסילבניה). כמות ביטוי פני התא של calreticulin למוות תאים אימונוגני בוצעה כפי שתואר קודם לכן (45) על ידי ציטומטריית זרימה. תאי B16F10 או MC38 תורבו וטופלו עם NAC (10 מ"מ) או DC661 (3 מיקרומטר) למשך 24 שעות. תאי MC38 טופלו עם siPpt1 או siNT למשך 48 שעות בנוכחות או היעדר 10 mM NAC למשך 24 שעות. תאים נצבעו בנוגדן CALR (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 נוגדן שני נגד ארנב עז (Invitrogen), ו-propidium iodide (PI) (Biolegend, 421301). דגימות מוכתמות נרכשו בציטומטר זרימה BD LSRII באמצעות 710/50 כחול ו-670/30 אדום כדי ללכוד קרינת PI ו-CALR, בהתאמה (מתקן Flow Core של אוניברסיטת פנסילבניה), והניתוח הוגבל לתאים חיוביים CALR ותאים PI שליליים כדי להימנע מאירועים חיוביים כוזבים. תחול תאי T ואחוז ציטוטוקסיות. תאי גידול B16 או MC38 (5 × 104) תורבו וטופלו ב-NAC (10 מ"מ) או DC661 (1 מיקרומטר או 3 מיקרומטר), בהתאמה, במשך 24 שעות. עבור עיכוב גנטי של Calr, תאי MC38 טופלו עם Calr siRNA או nontarget siRNA (siNT) במשך 48 שעות, ולאחר מכן טיפול עם DMSO או 3 מיקרומטר DC661 למשך 24 שעות. לאחר מכן תורבו ספלנוציטים עם DC661 עם או בלי תאי B16 או MC38 בנוכחות IL-2 (5 IU/mL) ותופחו יחד במשך 72 שעות. פרימה אושרה על ידי IFN-ELISA (Biolegend, 430815) של הסופרנטנט. לאחר מכן תורבו בתרבית משותף של ספלנוציטים עם תאי B16 או MC38 טריים עם יחס מטרה לאפקטור (B16 או MC38 ל-splenocytes) של 1:20 ו-1:50 עבור תאי B16 ו-MC38, בהתאמה. שחרור LDH הקשור למוות תאי B16 או MC38 ולאחר מכן אחוז הציטוטוקסיות נמדדו לפי פרוטוקול היצרן (MilliporeSigma, 4744926001) (31). מבחני חיסון נגד גידולים ומחקרי כימותרפיה עם מודלים מבוססים של סרטן. עכברי נקבות WT C57BL/6, עכברי NOD/SCID ו-BALB/c בנות שישה עד שמונה שבועות הושגו מ-The Jackson Laboratory. עבור ניסויי חיסון נגד גידולים, תאי WT B16F10, MC38 ו-CT26 טופלו ב-DC661 (3 מיקרומטר) במשך 36 שעות בצלוחיות של 175 ס"מ. לאחר מכן, סופרנטנטים ותאים מנותקים נאספו בצינור בז של 50 מ"ל. התאים עברו צנטריפוגה ונשטפו עם PBS קר כקרח. לחיסון, תרחיף סלולרי של 150 μL הוזרק sc בצד שמאל של עכברי C57BL/6 בעלי יכולת חיסונית, עכברי NOD/SCID בעלי חוסר חיסוני (1.8 × 104 תאי B16F10, 1.5 × 106 תאי MC38 לכל עכבר), או עכברים סינגניים (BALB). × 106 תאי CT26 לכל עכבר). תאים שהופשרו בהקפאה שהושעו מחדש ב-PBS הוזרקו כביקורת שלילית. שבוע לאחר מכן, תאים סרטניים חיים מאותם סוגים (3 × 104 תאי B16F10, 2 × 105 תאי MC38, או 5 × 105 תאי CT26 לכל עכבר) עם נפח שווה של Matrigel (Corning, 354248) הוזרקו באגף הימני של עכברים מחוסנים. גידולים נמדדו באמצעות קליפרים אלקטרוניים, ונפח חושב כ- L × W2 × 0.5. צמיחת הגידול נוטרה באופן קבוע במשך הימים הבאים, והיעדר גידולים נחשב כאינדיקציה לחיסון יעיל נגד גידולים. מחקרי חיסון DC661-MC38 חזרו על עצמם בעכברי NOD/SCID. סטָטִיסטִיקָה. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי שימוש במבחן ה-t-t-tailed 2-הבלתי מזווג של התלמיד כאשר משווים בין 2 קבוצות. נעשה שימוש במבחן ANOVA 1-כאשר הושוו יותר מ-2 קבוצות. השערת אפס נדחתה באופן מובהק אם ערך P היה נמוך מ-0.05. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. אישור לימודים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה.

עשב סיני cistanche plant-Antitumor

הפניות

1. Zeh HJ, et al. מחקר אקראי שלב II טרום ניתוחי של עיכוב אוטופגיה עם מינון גבוה של הידרוקסיכלורוקין וגמציטאבין/נאב-פקליטקסל בחולי סרטן הלבלב. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. רבקה פולקסווגן, et al. PPT1 מעודד צמיחת גידול ומהווה יעד מולקולרי של נגזרות של כלורוקין בסרטן. סרטן דיסקוב. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et al. GNS561, מעכב אוטופגיה חדש הפעיל נגד תאי גזע סרטניים בקרצינומה כבדית וגרורות בכבד מסרטן המעי הגס. J סרטן. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et al. GNS561, מעכב PPT1 בשלב קליני, יעיל נגד קרצינומה כבדית באמצעות אפנון של תפקודים ליזוזומליים. אוטופגיה. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. חדירת ממברנה ליזוזומלית ושחרור קתפסין הם אירוע מגביר התלוי ב-Bax/Bak של אפופטוזיס בפיברובלסטים ובמונוציטים. מוות תאים שונה. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Lysosomal membrane permeabilization במוות של תאים. אונקוגן. 2008;27(50):6434–6451.

7. רבקה פולקסווגן, et al. גישה מאוחדת למיקוד תפקידי האיתות השפלים והצמיחה של הליזוזום. סרטן דיסקוב. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et al. פרופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזה בחסינות נגד סרטן. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. אוטופגיה מקדמת התחמקות חיסונית מסרטן הלבלב על ידי השפלה של MHCI. טֶבַע. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et al. עיכוב ULK1 מתגבר על הצגת אנטיגן שנפגעת ומשחזר חסינות נגד גידול בסרטן ריאות מוטנטי LKB1. סרטן נאט. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. Ubiquitin kinase PINK1 מגייס קולטני אוטופגיה כדי לגרום למיטופגיה. טֶבַע. 2015;524(7565):309–314.

12. צ'וי י.ב. ואח'. TAX1BP1 מרסן אפופטוזיס הנגרמת על ידי וירוסים על ידי הקלה על פירוק מתווכת גירוד של מתאם המיטוכונדריאלי MAVS. מול תא ביול. 2017;37(1):ה00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 פוגע בביו-אנרגטיה של המיטוכונדריה וממריץ את התחלופה של המיטוכונדריה. מוות תאים שונה. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. בסיס מכני לפרופטוזיס לקויה בתאים המבטאים את וריאנט S47 המתמקד באפריקה של p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. מעכבי BRAF ו-MEK מוטנטים מווסתים את המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול באמצעות פירופטוזיס. סרטן דיסקוב. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. פרמיביליזציה של ממברנה ליזוזומלית במוות תאים: עדויות חדשות והשלכות על בריאות ומחלות. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. אוטופגיה הנגרמת על ידי Quinacrine בסרטן השחלות מעוררת חדירת קרום ליזוזומלית/מיטוכונדריאלית בתיווך קתפסין-L ומוות תאים. סרטן (באזל). 2021;13(9):2004.

18. מיכלת MC, et al. אפופטוזיס תלוי קתפסין המופעל על ידי הפעלה על-אופטימלית של לימפוציטים T: מנגנון אפשרי של סבילות למינון גבוה. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. מונדאל א, ואח'. מחסור ב-Ppt1- אינו מווסת הומאוסטזיס ליזוזומלי Ca++ תורם לפתוגנזה במודל עכבר של מחלת CLN1. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. אנגל ק.מ. ואח'. פוספוליפאזות ומיני חמצן תגובתיים נגזרים סמנים ביולוגיים של שומנים בבני אדם ובעלי חיים בריאים וחולים - התמקדות בליזופוספטידילכולין. פרונט פיזיול. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. היעילות של N-אצטילציסטאין בדיכוי פנוטיפי של מודלים של עכברים של מחלת נימן-פיק, סוג C1. הום ​​מול ג'נט. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et al. N-אצטילציסטאין מונע עקה חמצונית המושרה על ידי olanzapine בנוירונים היפותלמיים של mHypoA-59. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 ו-ASL מדכאים צמיחה בקרצינומה של תאי כליה צלולים באמצעות חילוף חומרים של חנקן. סרטן Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et al. השוואה של ההשפעה המגנה של חומצה אסקורבית על אינטראקציות חיזור ומערכות אנדוקנבינואידיות במבחנה בתרבית של פיברובלסטים בעור אנושי החשוף לקרינת UV ומי חמצן. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. ניצול פגיעות של תאי סרטן לפיתוח טיפול משולב לגידולים מונעי ראס. תא סרטן. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et al. ניטור חמצון שומנים בתוך תאי קצף על ידי בדיקה ניתנת למטרה וליזוזום. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. ניתוח מבוסס ביואינפורמטיקה מגלה MFSD12 מוגבר כמקדם מפתח של שגשוג תאים ומטרה טיפולית פוטנציאלית במלנומה. אונקוגן. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-אצטילציסטאין כנוגד חמצון וחומר שביר דיסולפיד: הסיבות לכך. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. אבו-רמיאלה מ, ואח'. מטבולומיה ליזוזומלית חושפת ויסות תלוי V-ATPase ו-mTOR של פליטת חומצות אמינו מהליזוזומים. מַדָע. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et al. מוות תאים אימונוגני בטיפול בסרטן: מעוררים קיימים ומתעוררים. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. עיכוב PPT1 משפר את הפעילות האנטי-גידולית של נוגדן אנטי-PD-1 במלנומה. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. מהנרט JM, et al. BAMM (BRAF autophagy and MEK inhibition in melanoma): ניסוי שלב I/II של dabrafenib, trametinib וה-hydroxychloroquine ב-BRAFV{1}}mutant melanoma מתקדם. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. חלבוני Macroautophagy שולטים ברמות MHC Class I בתאים דנדריטים ומעצבים תגובות אנטי-ויראליות של CD8(+) תאי T. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. גיוס ציסטאין ליזוזומלי מעצב את התגובה של TORC1 וצמיחת רקמות לצום. מַדָע. 2022;375(6582):eabc4203.

35. שוולפנברג ג.ק. N-אצטילציסטאין: סקירה של שימושיות קלינית (תרופה ישנה עם טריקים חדשים). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, et al. גילוי שיטתי של סמנים ביולוגיים של הריון חוץ רחמי באמצעות 3-פרופיל חלבון D בשילוב עם כמות ללא תווית. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. ההשפעה העיקרית על הפרוטאומה של קרצינומה של תא שחלתי שחלתי שעבר מוטציה ב-ARID1A היא הירידה בוויסות של מסלול ה-mevalonate ברמה שלאחר התעתוק. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant מאפשרים שיעורי זיהוי גבוהים של פפטידים, דיוק מסה אינדיבידואלי של טווח ppb, וכימות חלבון בכל פרוטאומה. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et al. Andromeda: מנוע חיפוש פפטידים משולב בסביבת MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et al. כימות מדויק ללא תווית פרוטאום על ידי נורמליזציה מושהית ומיצוי יחס פפטידים מקסימלי, המכונה MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et al. הפלטפורמה החישובית של Perseus לניתוח מקיף של נתוני (prote)omics. שיטות נאט. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: פלטפורמת ביואינפורמטיקה לניתוח אינטגרטיבי של נתוני פרוטאומיקה בחקר הסרטן. שיטות מול ביול. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. שינויים בחילוף החומרים של שומנים פיברובלסטים מיושנים מעוררים עמידות של תאי מלנומה תלויי גיל לטיפול ממוקד באמצעות טרנספורטר חומצות השומן FATP2. סרטן דיסקוב. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. הנדסת גנום באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. נאט פרוטוק. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. כמות של חשיפה לקלרטיקולין הקשורה למוות של תאים אימונוגניים. שיטות אנזימול. 2020;632:1–13.