Lactobacillus Plantarum GKM3 מקדם אריכות ימים, שימור זיכרון ומפחית מתח חמצון המוח בעכברי SAMP8 חלק 1

תַקצִיר: (1) רקע: ירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל משפיעה בדרך כלל על החיים של קשישים עם תסמינים המעורבים בהפרעות מתקדמת בזיכרון ובלמידה. הוצע כי פרוביוטיקה יכולה לווסת הפרעות נוירולוגיות הקשורות לגיל דרך ציר המעי-מוח. (2) שיטות: כדי לחקור את ההשפעה האנטי-אייג'ינג של Lactobacillus plantarum GKM3 הפרוביוטי, נערכו גם בדיקות הישרדות וגם ניסויים קוגניטיביים במודל העכברים SAMP8. ה-SAMP8 בני שישה חודשים (n{{10}} בכל מגדר) הוזנו בפרוביוטיקה GKM3 במינון של 5.1 × 109 ו-1.0 × 109 cfu/kg BW/יום עד למותם הטבעי. לאחר מכן, אורך החיים נחקר. ל-SAMP8 בן שלושה חודשים (n=10 בכל מגדר) קיבל GKM3 למשך 14 שבועות. לאחר מכן, בדיקות ההתנהגות ופרמטרי החמצון נרשמו. (3) תוצאות: קבוצות GKM3 הראו חביון מוגבר באופן משמעותי במבחן ההימנעות הפסיבית וזמן הימנעות מוצלח במבחן ההימנעות הפעילה. ה-TBARS ו-8-OHdG ממוח עכברים הראו גם הפחתה משמעותית בקבוצות שטופלו ב-GKM3. בנוסף, נמצאה הצטברות נמוכה יותר של חלבון עמילואיד במוח של עכברי SAMP8 עם תוסף GKM3. (4) מסקנות: תוצאות אלו הצביעו על כך ש-L. plantarum GKM3 עיכב את תהליך ההזדקנות, הקל על ליקוי קוגניטיבי הקשור לגיל והפחתת מתח חמצוני.

לחץ על מוסף Cistanche Tubulosa

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

מילות מפתח: עכבר מואץ 8 (SAMP8); פרוביוטיקה; 8-הידרוקסי-20 -דאוקסיגואנוזין (8-OHdG); חומרים מגיבים לחומצה thiobarbituric (TBARS); עמילואיד- (א); הְזדַקְנוּת

1. הקדמה

בעיה קוגניטיבית שסבלה מהאוכלוסייה הפכה לגדולה יותר בעקבות הגידול בכמות האנשים המבוגרים בעשור האחרון [1]. לפי הדו"ח של ארגון הבריאות העולמי (WHO), מספר האנשים עם ירידה קוגניטיבית, שעמד על יותר מ-46.8 מיליון בשנת 2015, יגיע ליותר מ-74.7 מיליון בשנת 2030, אשר כמעט גדל בחצי תוך חמש עשרה שנים [2] . ההזדקנות, המוכרת כמתאם חזק עם פגיעה קוגניטיבית, נחשבת בדרך כלל כקשורה ללחץ חמצוני, המעורב בהצטברות של רדיקלים חופשיים ומקדם ליקויים פיזיולוגיים רבים, במיוחד במוח, איבר רגיש לחמצן, המוביל לניוון. תסמינים כמו אובדן זיכרון וירידה ביכולת הלמידה [3-5].

מכיוון שהזדקנות היא בלתי נמנעת והתסמינים השליליים היחסיים שלה מסובכים, אנשים נוקטים בטיפולים לאנטי-אייג'ינג, החל מטיפולים דיאטתיים ועד ליותר מטיפולים תרופתיים [6,7]. לדוגמה, תמצית שורש ג'ינסנג (Panax quinquefolius) הדגימה תפקוד קוגניטיבי משופר וסומנה כמועדפת על ידי הקוריאנים [8]. תמצית גינקו בילובה, דוגמה נוספת, הייתה אהובה על היפנים בשל תפקידיה בשיפור קוגניטיבי והפחתת חמצון [9]. למרות שדיווחים רבים העלו כי דיאטות צמחיות מספקות השפעות נוגדות חמצון ומעכבות את תהליך ההזדקנות, ישנם התמקדות מעניינים יותר במיקרוביוטה של ​​המעי או אפילו בקבוצה של חיידקים ספציפיים במעיים שיכולים לבצע חילוף חומרים תזונתיים אלו ולספק רב-מודולציה חיובית השפעות על המארח, כולל אריכות ימים [10-14]. חיידקי מעיים יכולים לייצר חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) כגון אצטט, פרופיונאט או בוטיראט מהתזונה של האדם [15]. ילדים שצרכו תזונה אנטרלית מבוססת צמחים הראו SCFAs גבוה יותר מהילדים הרגילים בדגימות הצואה שלהם [16]. SCFAs אלה יכולים למלא תפקיד חשוב באפיתל מערכת העיכול האנושי [17]. אצטט יכול לחצות את מחסום הדם-מוח, ולגרום להפעלה היפותלמומית-עצבית [18]. בנוסף, בוטיראט נחקר בנוגע להשפעה של דיכוי דלקת המעי הגס במעיים האנושיים [19]. לכן, זה משנה איזה סוג של מיקרוביוטה או חיידקים ספציפיים יש במעיים האנושיים, במיוחד במונחים של השפעה על בריאות הגוף ואריכות ימים [20,21].

המיקרוביוטה של ​​המעי יכולה גם להשפיע על ציר המעי-מוח ולעכב את תהליך ההזדקנות, ובכך למנוע התקדמות של מחלות הקשורות לגיל כגון אמנזיה, דמנציה, או אפילו מחלת אלצהיימר [22,23]. המוליך העצבי חומצה גמא-אמינו-בוטירית (GABA), למשל, יכול להיות מיוצר על ידי זני חיידקים מסוימים שדווחו עם שגשוג של תאי גזע אפיתל במעיים ושיפור של התנהגות דמוית דיכאון בעכברים [24,25]. עם נתונים תומכים עדכניים, הוספת פרוביוטיקה כשיטת מניעה הייתה מגמה להפרעות נוירולוגיות הקשורות לגיל [26,27].

לקטובצילוס הוא הפרוביוטיקה הנפוצה ביותר שהראתה אפשרות גבוהה לפתח מזון פונקציונלי כפי שהוא קיים במזון אנושי במשך זמן רב [28]. עם זאת, למין חיידקים בודדים יש ביולוגיות ייחודיות, מזן לזן, הדורשות אישור ניסוי. במחקרים הקודמים שלנו, בודדנו את הזן הפרוביוטי Lactobacillus plantarum GKM3 מעלים כבושים (Brassica juncea), הידוע גם כירק אורך החיים בחברת האקה הטייוואנית, וביצענו מחקרים תפקודיים על חיזוק מערכת העיכול והחסינות in vivo [29-31] . לכן, ציפינו לסבירות של L. plantarum GKM3 להקל על תהליך ההזדקנות ופגיעה קוגניטיבית הקשורה לגיל.

2. חומרים ושיטות

2.1. נושאים

L. plantarum GKM3 בודד מחרדל סיני (Brassica juncea) ושמר במרכז אוסף ומחקר ביולוגי, טייוואן (BCRC), עם מספר אוסף 910787. ראשית, GKM3 תורבת עם מרק MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, ארה"ב) בטמפרטורה של 37 ◦C במשך 18 שעות במבחנה. עם {{10}}.0חיסון של 1 אחוז, תרבית הזרעים של GKM3 הוגדלה בתסיסה של 50 ליטר תחת בקרת pH 6.0 ב- 37 ◦C למשך 18 שעות עם מדיום מתוכנן (5 אחוז גלוקוז, 2 אחוז תמצית שמרים, 0.05 אחוז MgSO4, 0.1 אחוז K2HPO4 ו-0.1 אחוז Tween 80). לאחר מכן, החיידקים המותססים נקצרו על ידי צנטריפוגה ב-3800 סל"ד למשך 10 דקות, נשטפו עם חיץ מלוחים של פוספט פעמיים, והגלולה עורבבה עם 10 אחוז חלב לצורך ליאופיליזציה. המינונים של אבקת L. plantarum GKM3 מיובשת בהקפאה במחקר זה הותאמו ל-5.1 × 109 cfu/kg BW/יום כמינון הגבוה ו-1.0 × 109 cfu/kg BW/יום כמינון נמוך עבור מודל העכבר על ידי מתן מתן .

העכברים המואצים בהזדקנות P8 (SAMP8) הוצגו במחקר זה כמודל חיה מזדקן. כל עכברי SAMP8 הושמו והוחזקו במחזור חושך/אור של 12 שעות מתחת ל-25 ± 2 ◦C, 65 ± 5 אחוזי לחות עם מזון ומים באופן חופשי. ההליכים הניסויים הבאים אושרו על ידי הוועדה לניהול בעלי חיים של המחלקה למזון ותזונה, אוניברסיטת פרובידנס (עיר טאיצ'ונג, טייוואן), עם מספר IACUC 20170629-A02.

2.2. מבחן הישרדות

במבחן ההישרדות, עכברי SAMP8 בני שישה חודשים קובצו עם 20 נקבות ו-20 זכרים באופן הבא: ביקורת, קבוצת GKM3 במינון גבוה וקבוצת GKM3 במינון נמוך. פרוביוטיקה L. plantarum GKM3 סופקה מדי יום לעכברי הטיפול עד שהגיעו למותם הטבעי. עכברי SAMP8 החיים/מתים בכל קבוצה תועדו ואורך החיים הממוצע חושב.

2.3. עיצוב ניסוי לליקוי קוגניטיבי הקשור לגיל

עכברי SAMP8 בני שלושה חודשים אוכסנו לצורך הניסוי של ליקוי קוגניטיבי. עכברי SAMP8 זכרים ונקבות קובצו באופן הבא (n=10 בכל מגדר): קבוצת ביקורת, קבוצת GKM3 במינון גבוה וקבוצת GKM3 במינון נמוך. העכברים בקבוצות הטיפול קיבלו דרך הפה L. plantarum GKM3 למשך 14 שבועות. פעילות התנועה נערכה בשבוע ה-11 לניסוי. מבחן ההימנעות הפסיבית ומבחן ההימנעות הפעילה נערכו בהתאמה בשבוע ה-13 וה-14, ולאחר מכן הוקרבו עכברים לניתוח ביוכימי ובדיקה היסטולוגית.

2.4. פעילות תנועה

כל עכבר הונח במרכז כלוב מעבורת (25 ס"מ × 25 ס"מ × 25 ס"מ, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, ארה"ב) והתנועה שלו תועדה על ידי מנתח נתיבי וידאו של מוניטור פעילות למשך 10 דקות הזמן הממוצע של תנועת העכבר נותח כל 5 דקות (שניות/5 דקות). תהלוכה זו התנהלה בתנאי אור עמומים ושקטים.

2.5. מבחן הימנעות פסיבית

כלוב מעבורות (35 ס"מ × 17 ס"מ × 20 ס"מ, קולבורן אינסטרומנטס דגם E10-15, Lehigh, PA) חולק לחדר חשוך ובהיר. הייתה דלת גיליוטינה (7.5 ס"מ × 6.5 ס"מ, קולבורן אינסטרומנטס דגם E10-15GD, Lehigh, PA, ארה"ב) בין שני החדרים. במבחן ההכשרה למבחן ההימנעות הפסיבית הונח עכבר בחדר האור להסתגלות של דקה ולאחר מכן נפתחה דלת הגיליוטינה. העכבר יקבל 0.5 µA התחשמלות למשך 0.5 שניות כשהוא נכנס לחדר החשוך. ההלם התרחש ללא הרף שלוש פעמים כל חמש שניות. העכבר הוחלף באותה פעולה ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר האימון למבחן הזיכרון, פרט לכך שלא הופיע הלם. נמדדו הזמנים הממוצעים של עכברים השוהים בחדר האור. נקבע זמן חתך עליון של 180 שניות.

2.6. מבחן הימנעות אקטיבית

במבחן האימון למבחן ההימנעות הפעילה, העכבר יקבל גירוי מותנה (CS) של 10 שניות המבוסס על אור וקול, ולאחר מכן 5 שניות של הלם חשמלי של 0.3 mA (גירוי בלתי מותנה, UCS) אם העכבר נשאר באותו חדר, בעוד שלא הייתה קליטת הלם אם העכבר עבר לחדר השני. כל עכבר התאמן במשך 5 מחזורי CS ו-UCS. העכבר נבדק באותה פעולה (מערכת CS/UCS) עם מרווחי ניסויים של 15-20 דקות ארבע פעמים ביום ונבדק ללא הרף במשך ארבעה ימים. זמן ההימנעות הממוצע נמדד כהשפעת למידה של זיכרון.

2.7. ניתוח מתח חמצוני

לזיהוי של 8-הידרוקסי-20 -דאוקסיגואנוזין (8-OHdG) מה-DNA המיטוכונדריאלי במוח, חולצו 30 מ"ג של רקמת מוח על ידי מערכת Miniprep DNA Extraction Genomic Blood & Tissue (Viogene Biotek) Corp., Taipei, Taiwan) והערכת 8-OHdG Check ELISA רגישה מאוד (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, יפן) הושמה עם ספיגה של 450 ננומטר. עבור ניתוח חומרים תגובתיים לחומצה thiobarbituric (TBARS), 25 מ"ג של רקמת מוח נטחנו עם 250 µL חיץ RIPA ועברו צנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000×g למשך 10 דקות מתחת ל-4 ◦C. בסך הכל, נאספו 100 μL של סופרנטנט ונוספו עם 100 μL תמיסת SDS ו-4 מ"ל מגיב צבעוני, ולאחר מכן רתחו במשך שעה לפני טיפול הקירור. דגימות שטופלו הועברו בצנטריפוגה ב-16,000×g למשך 10 דקות והונחו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. תכולת TBARS (mM/g חלבון) מכל דגימה של 150 µL נמדדה בספיגה של 535 ננומטר עם העקומה הסטנדרטית.

2.8. מדידות של המוח עמילואיד- חלבון

חלבון העמילואיד (A) מקטע רקמת המוח נצבע בשיטת אימונוהיסטוכימיה. אחוז הצטברות A נותח על ידי מערכת תמונה (Leica, Q500, Wetzlar, גרמניה) עם מיקרוסקופ תחת שדה של 40×. החישוב התבסס על האחוז של אזור הצטברות A בכל המוח: (-שטח שקיעת עמילואיד/אזור המוח כולו) × 100 אחוז.

2.9. היסטולוגיה

המוח נכרת ותוקן עם 10 אחוז פורמלין. רקמת ההיפוקמפוס עובדה בתהליך של התייבשות, ניקוי, הסתננות והטבעה לצורך חתך. לאחר מכן, רקמת אזור ההיפוקמפוס נבדקה על ידי צביעה Hematoxylin ו-Eosin (H&E).

2.10. סטטיסטיקה

הצואה הסטטיסטית SPSS 19.0 שימשה במחקר זה. כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM ומוערכים על ידי ANOVA חד כיווני להשוואת האמצעים בין הקבוצות השונות. הבדל משמעותי נשקל כאשר ערך ה-p היה קטן מ-0.05 על ידי מבחני הטווח המרובים של דאנקן. במבחן ההישרדות, מבחן קפלן-מאייר יושם לניתוח ומבחן ה-log-rank נערך כדי לאמת את ההבדלים בין הקבוצות.

3. תוצאות

3.1. השפעת L. plantarum GKM3 על מבחן ההישרדות SAMP8

בניסוי ההישרדות, תוחלת החיים של עכברי SAMP8 נצפתה עד למותם הטבעי ולקח 21 חודשים להשלמת כל הרשומות האישיות. תוחלת החיים הממוצעת של עכברי SAMP8 זכרים שלא טופלו הייתה 11.90 ± {{10}}.18 חודשים ולנקבות זה היה 11.20 ± 0}.21 חודשים. בקבוצות האכלה פרוביוטיות של GKM3, תוחלת החיים הממוצעת של הגבר התארכה ל-12.05 ± 0.15 חודשים ו-13.50 ± 0.14 חודשים במינונים נמוכים וגבוהים של טיפולי GKM3, בהתאמה. ההשפעה התלויה במינון של GKM3 פרוביוטיקה על הארכת תוחלת החיים בנשים הייתה יכולה להופיע גם עם 12.15 ± 0.21 חודשים בקבוצת המינון הנמוך ועם 14.30 ± 0.17 חודשים בטיפול במינון גבוה (לא מוצגים נתונים).

לסיכום תוחלת החיים, הוערך שיעור ההישרדות. עם שיעור הישרדות של 50 אחוזים, המינון הנמוך של GKM3 בקבוצת הגברים היה 12.67 חודשים והמינון הגבוה של קבוצת הגברים GKM3 היה 13.33 חודשים, בעוד שקבוצת הביקורת הגברית הציגה רק 12.50 חודשים (איור 1A). בדומה לתצפית בעכברי SAMP8 נקבות, 12.00 חודשים ו-15.50 חודשים עם שיעור הישרדות של 50 אחוז הוצגו בקבוצות שניזונות פרוביוטיקה GKM3 במינון של 1.0 × 109 CFU/ק"ג BW/יום ו-5.1 × 109 CFU/kg BW/יום, בהתאמה; עם זאת, 10.50 חודשים עם שיעור הישרדות של 50 אחוז נצפו בקבוצת הביקורת הנשית (איור 1B). נקבות עכברי SAMP8 הציגו תוחלת חיים קצרה יותר מזכרים כבסיס בניסוי זה; לעניין, ההשפעה של L. plantarum GKM3 במונחים של תוחלת החיים השפיעה יותר על הנקבות. מוצע כי L. plantarum GKM3 יכול להגדיל את אורך החיים בעכברי SAMP8 משני המינים, במיוחד במין נקבות.

3.2. משקל גוף, צריכת מזון וצריכת מים בעכברי SAMP8

בניסוי על ליקוי קוגניטיבי הקשור לגיל, לא היו הבדלים משמעותיים בצריכת האנרגיה ובשינוי במשקל בין כל עכברי SAMP8 מקבוצות הטיפול השונות לפני ההקרבה (טבלה 1). המשמעות היא שהפרוביוטיקה GKM3 לא השפיעה על הפרמטרים המטבוליים הללו במודל העכבר המבוגר.

3.3. השפעת L. plantarum GKM3 על שימור זיכרון ושיפור למידה

בדיקת פעילות תנועה הראתה שלא היה הבדל משמעותי בין כל עכברי SAMP8 במרווח ה5-דקות הראשון, ללא קשר למין (טבלה 2). למרות שהייתה ירידה במרווח ה-5-דקות השני, בהשוואה למרווח ה5-דקות הראשון, לא היה שינוי משמעותי בין הקבוצות שטופלו והלא טופלו.

בדיקות הימנעות פסיביות בוצעו על קבוצות זכר ונקבה של עכברי SAMP8 (איור 2). לא היו הבדלים מובהקים בין כל הקבוצות במהלך מבחן הניסוי (p > 0.05). ההשהיה של עכברים זכרים SAMP8 שניזונו עם GKM3 פרוביוטי גדלה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת ביום הראשון (p < 0.05) (איור 2A). זמן השהייה של נקבות עכברי SAMP8 בחדר האור גדל גם ביום הראשון בטיפול ב-GKM3, עם ערך p של פחות מ-0.05 בקבוצת המינון הנמוך וערך p של פחות מ-0.01 בשיעור הגבוה. -קבוצת מינון בהשוואה לביקורת. עם זאת, לא היו הבדלים משמעותיים לאחר היום השני של מבחן ההימנעות הפסיבית. חביון ארוך יותר שבוצע בקבוצת האכלה GKM3, הן בזכרים והן בעכברי SAMP8, הצביע על כך ש-GKM3 פרוביוטי יכול לתרום לשימור זיכרון הקשור לגיל ולשיפור הלמידה.

בהליך הימנעות אקטיבי, העכברים נדרשו לנקוט כל פעולה כדי להימנע מהגירוי המזיק. ביום הניסוי של מבחן ההימנעות הפעילה, גם עכברי SAMP8 הזכרים וגם הנקבות שניזונו עם GKM3 הראו נטייה להצלחה גבוהה יותר בהימנעות (איור 3) אך לא הגיעו להבדל הסטטיסטי (p > 0.{{ 9}}5) בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, התוצאה בימים ראשון ושני של מבחן ההימנעות הפעילה הראתה שהזמן המוצלח גדל באופן משמעותי בקבוצות הזכרים עם GKM3 שניזונו בהשוואה לעכברי SAMP8 הזכרים שלא טופלו (איור 3A) (p <0.05). תוצאה דומה נצפתה גם בקבוצות הנשים (איור 3B). מעניין לציין שלא היו הבדלים סטטיסטיים (p=0.157) בתוצאה של היום הרביעי בין קבוצת הביקורת והפרוביוטיקה. המשמעות היא שעכברי הבקרה נזקקו לאימון במשך ארבעה ימים כדי להדביק את נוכחותם של העכברים שניזונו פרוביוטיקה. מוצע כי תוספת של GKM3 פרוביוטי לתזונה יכולה לעזור לקוגניציה של המארח שמשפיעה על ההתנהגות המתאימה בשני המינים.

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】