מחסור בקלוטו מגביר את הביטוי המושרה בהיפוקסיה של IFN- / באמצעות וויסות עלייה של RIG-I בכליות
Mar 25, 2022
תַקצִיר היפוקסיה היא מסלול נפוץ להתקדמות השלב הסופימחלת כליות.הגן I(RIG-I) הניתן להשראת חומצה רטינואית מקודד להליקאז של RNA המזהה וירוסים כולל SARS-CoV2, האחראי לייצור אינטרפרון (IFN)-a/ כדי למנוע התפשטות של זיהום ויראלי. לאחרונה, הפעלת RIG-l נמצאה בתנאים היפוקסיים, ומחסור בקלוטו הוכח כמגביר את ההפעלה של RIG-I במוחות של עכברים. עם זאת, התפקידים של פונקציות אלה בדלקת כליות נותרו חמקמקים. כאן, לצורך מחקר במבחנה, הביטוי של RIG-I ו-IFN-a/ נבדק בחולדה רגילהכִּליָה(NRK)-52תאי E שהודגרו בתנאים היפוקסיים (1 אחוז O2). לאחר מכן, siRNA המיקוד ל-RIG-I או ל-siRNA מקושקש הועבר לתאי NRK52E כדי לבחון את הביטוי של RIG-I ו-IFN-a/ß בתנאים היפוקסיים. חקרנו גם את רמות הביטוי של RIG-I ו-IFN-a/ ב-33humanכִּליָהדגימות ביופסיה שאובחנו עם נפרופתיה lgA. עבור מחקר ב-Vivo, גרמנו היפוקסיה כלייתית על ידי הידוק עורק הכליה למשך 10 דקות בעכברים מסוג פרא (עכברי WT) ועכברי Klotho-knockout (KIT/עכברים). דגירה בתנאים היפוקסיים הגדילה את הביטוי של RIG-lI ו-IFN-a/ בתאי NRK52E. הרגולציה העליונה שלהם הייתה מעוכבת בתאי NRK52E שהועברו עם siRNA המכוונים ל-RIG-I. בחולים עם נפרופתיה IgA, צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימות ביופסיה של הכליה גילתה שהביטוי של RIG-I היה מתאם לזה של IFN-a/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively).="" the="" expression="" levels="" of="" rig-i="" and="" ifn-a/β="" were="" upregulated="" in="">כליותשל עכברי WT היפוקסיים ושיפור ויסות נוסף נצפה בעכברים היפוקסיים. ממצאים אלו מצביעים על כך שהיפוקסיה משרה את הביטוי של IFN-a/ באמצעות וויסות העל של RIG-I וכי מחסור בקלוטו מגביר את הביטוי המושרה בהיפוקסיה בכליות.
מילות מפתח:מחלת כליות; תאי כליה; החלפת כליות; נזק כלייתי; כִּליָה
CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות
מבואכְּרוֹנִימחלת כליות(CKD) השפיע על 697.5 מיליון אנשים ברחבי העולם בשנת 2017 [1], כך שהוא מוכר היטב כדאגה בריאותית מרכזית. כדי לעכב את התקדמות CKD, נעשה שימוש במעכבי מסלול רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון (RAAS) במסגרת קלינית [2,3]. עם זאת, ההשפעות המועילות שלהם מוגבלות וחולים רבים זקוקים בסופו של דבר לטיפול חלופי כליות[4]. מבחינה פתולוגית, דלקת כרונית ופיברוזיס אינטרסטיציאלי הם המאפיינים הנפוצים של CKD, ללא קשר למחלה הראשונית [5]. למרות שגורם גדילה מתמרן (TGF)- 1 ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של פיברוזיס אינטרסטיציאלי [6-8], מחקרים קודמים הוכיחו שחדירת תאים דלקתיים אחראית לייצור TGF{{12} } [9]. ממצאים אלו מצביעים על כך שדלקת היא אירוע במעלה הזרם של פיברוזיס אינטרסטיציאלי, וכי דלקת היא יעד טיפולי מועמד ל-CKD.
היפוקסיה היא מצב שבו חוסר חמצן הופך אותו לרקמות. כתגובה תאית להיפוקסיה, גורמים הגורמים להיפוקסיה (HIF) ממלאים תפקידים חשובים במניעת נזק לרקמות [10-12]. עם זאת, היפוקסיה חמורה מובילה למחלות כלי דם חריפות, כגון שבץ [13], אנגינה פקטוריס [14], ומחלת עורקים היקפיים [15]. לאחרונה דווח כי היפוקסיה כרונית, כמו דום נשימה בשינה, תורמת אף היא להתפתחות מחלות שונות [16]. בהקשר לכִּליָהלפי הדיווחים, היפוקסיה מתעצמת עם התקדמות שלב CKD והיא נחשבת כיום לפתופיזיולוגיה נפוצה המובילה לשלב סופימחלת כליות[17]. כפי שהוזכר לעיל, דלקת נחשבת כאירוע במעלה הזרם, ולכן יש לברר את המנגנון שבו היפוקסיה גורמת לדלקת ברמה המולקולרית. דלקת מאופיינת בכאב, חום, אדמומיות, נפיחות ואובדן תפקוד[18]. עם זאת, זה בעצם מתפקד כדי לחסל את הגורם הראשוני לפציעה בתאים ולנקות תאים נמקיים ורקמות פגומות. בכל מקרה, דלקת אינה תגובה ספציפית, וחסינות מולדת נחשבת כמשתתפת בעיקר בתהליך הראשוני של הדלקת באמצעות ייצור אינטרפרון (IFN)- / [19]. בין הגורמים המעורבים בחסינות מולדת, גן I (RIG-I) המושרה על ידי חומצה רטינואית אחראי על תגובות חיסוניות לזיהומים ויראליים[20. יש לציין כי מחקרים אחרונים הוכיחו כי היפוקסיה מעלה ויסות של ביטוי RIG-I במוח ובכבד, וכתוצאה מכך לייצור של IFN- / [21,22]. עם זאת, תפקידה של היפוקסיה בביטוי בתיווך RIG-I של IFN-/B ב-כִּליָהנשאר חמקמק.
Klotho דווח לראשונה כחלבון אנטי אייג'ינג [23]. ואכן, עכברים חסרי קלוטו מציגים תוחלת חיים מקוצרת בליווי פנוטיפים הדומים להזדקנות אנושית. לעומת זאת, עכברים טרנסגניים של קלוטו מראים תוחלת חיים ממושכת [24]. במונחים של השפעות רינו-פרוטקטיביות, נמצא כי מחסור בקלוטו מגביר את הנזק הכלייתי במודלים ניסיוניים של מחלות כליות, בעוד שביטוי יתר של קלוטו או מתן חלבון קלוטו משפר אותו [25]. חלבון Klotho קיים בשלוש צורות: ממברנה, מופרשת וקוטו תוך תאי. בין אלה, דווח כי קלוטו תוך תאי מדכא את ביטוי RIG-I יחד עם דלקת [26], מה שמעלה את האפשרות שמחסור בקלוטו מחמיר את הוויסות העל של RIG-I ו-IFN-/in הנגרמת על ידי היפוקסיה.כליות.ממצאים אלה הובילו אותנו לשער שהביטוי של RIG-I ו-IFN-/ גדל בתנאים היפוקסיים בקו תאים של תאים צינוריים כליה ושההגברה המושרה על ידי היפוקסיה שלהם התגברה בעכברי קלוטו-נוקאאוט (KI-7 עכברים). במחקר זה, אנו מראים שהיפוקסיה מעלה ויסות RIG-I כמו גם IFN-a/ אצל חולדה רגילהכִּליָהתאים (NRK-52E) וכליות עכבר. אנו גם מראים ש-RIG-I אחראי לוויסות-על המושרה בהיפ-אוקסיה של IFN-c/B. באדם בפועלכִּליָהדגימות של חולים שאובחנו עם נפרופתיה IgA, ביטוי RIG-I נמצא בקורלציה חיובית עם IFN-/. לבסוף, הגברה המושרה על ידי היפוקסיה של RIG-I ו-IFN-/ התגברה בעכברי KI-/-. ממצאים אלו מצביעים על כך שמחסור בקלוטו מגביר את הביטוי המושרה בהיפוקסיה של IFN-/ באמצעות הוויסות העליונה של RIG-I בכליות.
CISTANCHE ישפר אי ספיקת כליות/כליות
חומרים ושיטות בעלי חייםעכברי C57BL/6J פראי (WT) זכרים (בני 8 שבועות ומשקלם 20-25 גרם) הושגו מ-Charles River Laboratories Japan (Yokohama, יפן). עכברים זכרים (בני 6 שבועות ומשקלם של כ-15 גרם) נרכשו מ-CLEA Japan, Inc. העכברים שוכנו במכון למדעי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת הירושימה (הירושימה, יפן), כמתואר קודם לכן [27]. כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת הירושימה (מספרי היתר: A19-158 ו-2019-156) ובוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) לגבי השימוש בחיות מעבדה. עכברי WT ו-KI-'חולקו לקבוצת ביקורת או קבוצת היפוקסיה (n=5בכל קבוצה). מצבים היפוקסיים נוצרו על ידי הידוק של עורק הכליה השמאלי למשך 0 דקות בהרדמה כללית (0.3 מ"ג/ק"ג מדטומידין, 4 מ"ג/ק"ג מידאזולם ו-5 מ"ג/ק"ג בוטורפנול)[28]. עכברים בקבוצת הביקורת עברו ניתוח מדומה שהיה זהה לזו בעכברים בקבוצת ההיפוקסיה, למעט היעדר קשירת עורקים. לאחר 10 דקות של היפוקסיה, העכברים הורדמו על ידי ניקור לבכליותנקצרו. היפוקסיה שלכִּליָהאושר על ידי סופג מערבי לביטוי אריטרופואטין (איור S1).
תרבית תאיםהחולדה הרגילהכִּליָה(NRK)-52תאי E נרכשו מ-American Type Culture Col. lection (מנאסס, VA, ארה"ב). NRK-52תאי E תורבתו במדיום RPMI-1640 המכיל 10 אחוז עוברי סרום בקר (FBS) (Nichirei Bioscience, טוקיו, יפן) ופניצילין/סטרפטומי-צין (Nacalai Tesque, קיוטו, יפן). קלילים אלה נזרעו לתוך צלחות תרבות באורך 10 ס"מ. לאחר גדילה עד תת-מפגש, התאים הודגרו בחדר אינקובטור O2Modular של 1 אחוז (MIC 101; Billups-Rothenberg, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) למשך 30,60,90 ו-120 דקות, הוכנו ליזטים של תאים שלמים והועברו לניתוח כתם מערבי. היפוקסיה של תאי NRK-52E אושרה על ידי Western blotting לביטוי HIF-1 (איור S2).
טרנספקציה של RIG-I siRNAתאי NRK52E הועברו עם siRNA של 20 ננומטר המכוונים ל-RIG-I (RSS311418: Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) או siRNA בקרה שלילית (4390843; Applied Biosystems, Waltham, MA, ארה"ב) באמצעות Lipofectamine 2000 Transfection Fisheragent (ScientThermo Fisherreagent) , בהתאם להוראות היצרן. לאחר 43-45 שעות, חלק מהתאים הללו הודגרו בתנאים היפוקסיים (1 אחוז O,) למשך 30 דקות כדי להעריך RIG-I. התאים האחרים הוחלפו למדיום טרי. לאחר 24 שעות, תאים אלה הודגרו תחת מצבים היפוקסיים (1 אחוז O2) למשך 60 ו-120 דקות כדי לאשר את הדיכוי של IFN-a/ .Lysates של תאים שלמים הוכנו ועברו ניתוח כתם מערבי.
ניתוח כתם מערביאיסוף דגימות ו-Western blotting בוצעו בהתאם לשיטות שתוארו בעבר[29]. נוגדן אנטי-RIG-I חד שבטי ארנב (#3743S; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ארה"ב), נוגדן רב שבטי נגד IFN- 11 לארנב (bs-7023R; Bioss Anti-bodies, Woburn, MA, ארה"ב), נוגדן רב שבטי נגד IFN- ארנב (GTX37658; GeneTex, Irvine, קליפורניה, ארה"ב), נוגדן אנטי-RIG-I חד שבטי ארנב (=700366; Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב), ארנב פוליקלונלי נוגדן אנטי-IFN- 2 (ab193055; Abcam, קיימברידג', בריטניה), נוגדן פוליקלונאלי נגד IFN- ארנב (PA5-20390; Invitrogen), נוגדן קלותו חד שבטי עכברוש (KO603; TransGenic, Fukuoka , יפן), נעשה שימוש נוגדן אנטי- -אקטין חד שבטי עכברים (A5316; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ארה"ב), ונוגדן חד שבטי אנטי- -טובולין של עכברים (T9026; Sigma-Aldrich) כנוגדנים ראשוניים. חזרת פרוקסידאז אימונוגלובולין G (Dako, Glostrup, דנמרק) ואימונוגלובולין G של עז נגד עכברים (Dako) שימשו כנוגדנים משניים. SuperSignal West Dura ומערכת Pico (Thermo Fisher Scientific) שימשו לזיהוי אותות. העוצמה של כל פס נמדדה על ידי תוכנת ImageJ (גרסה 1.47y; המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD, ארה"ב) ונורמלה לרמה של -אקטין או -טובולין.
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
ניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת כליות עכברצביעה אימונוהיסטוכימית בוצעה בהתאם לשיטות שתוארו בעבר [27]. כנוגדנים ראשוניים, יושמו המוצרים הבאים: נוגדן אנטי-RIG-I חד שבטי ארנב (#700366; Invitrogen), נוגדן אנטי-IFN- 2 רב שבטי ארנב (ab193055; Abcam), נוגדן רב שבטי ארנבת אנטי-IFN- ( PA5-20390; Invitrogen), ונוגדנים חד שבטיים אנטי-אנושיים של חולדות (KO603; TransGenic).RIG-I-,IFN-a/ - ואזורים חיוביים לקלוטו כומתו כממוצע של 20 שדות שנבחרו באקראי עם תוכנת ImageJ.
איסוף דגימות קליניות והצהרת אתיקהדגימות כליה התקבלו בביופסיה כלייתית בבית החולים האוניברסיטאי הירושימה בין אוגוסט 2014 לנובמבר 2016 מ-33 חולים שאובחנו עם נפרופתיה מסוג IgA. מחקר זה דבק בעקרונות הגלומים בהצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת הירושימה(E-1718), הסכמה מדעת התקבלה בצורה של ביטול הסכמה באתר(httns:/inzounaika Hiroshima-uaciplresearchl opt out.html).
ניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת כליה אנושיתצביעה חיסונית בוצעה בהתאם לשיטות שתוארו בעבר [27]. נעשה שימוש בנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדן אנטי-RIG-I חד-דוני של ארנב (#700366; Invitrogen), נוגדן חד-שבטי נגד IFN- של עכבר (sc-373757; סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס, טקסס, ארה"ב), וארנב אזורים חיוביים נגד IFN- polyclonal(PA5-20390; Invitrogen), RIG-I-ו-IFN-a/ - נכמתו כממוצע של חמישה שדות שנבחרו באקראי עם תוכנת Image].
ניתוח סטטיסטיהתוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן (SD). מתאמים חושבו באמצעות ניתוח רגרסיה חד-משתני, לצורך השוואות מרובות, השתמשנו בניתוח שונות בכיוון אחד (ANOVA) ואחריו מבחן t של Student עם תיקון Bonferroni. ההבדלים בין שתי הקבוצות נותחו על ידי Student's t-test.P<0.05 was="" considered="" as="" statistically="">
תוצאות:היפוקסיה מעלה ויסות RIG-I ו-IFN-a/ בקו תאי חולדה של תאי אפיתל כליותכדי לזהות את ההשפעה של היפוקסיה על הביטוי של RIG-Iand IFN-a/ במבחנה, ביצענו אנליזה של Western blot עבור חלבונים אלה בתאי NRK-52E שתורבתו בתנאים היפוקסיים. רמת החלבון של RIG-I הגיעה לשיא לאחר 30 דקות ולאחר מכן ירדה בהדרגה בתאי NRK-52E בגירוי היפוקסי (איור 1A). רמות IFN-/ß עלו והגיעו לשיא ב-120 ו-60 דקות, בהתאמה, ב-NRK -52תאי E עם גירוי היפוקסי (Eig 1Band1C). נוק-דאון של RIG-I מפחית את הביטוי של IFN-a/ בתאי NRK52E עם היפוקסיה כדי להעריך אם RIG-I משתתף בביטוי של IFN- / בתנאים היפוקסיים, חקרנו את הביטוי שלהם בתאי NRK-52E שהועברו עם RIG-I siRNA או שלילי
לשלוט על siRNA. ראשית, אישרנו את אפקט ה-Nockdown של RIG-siRNA בתאי NRK-52E. סופג מערבי עבור RIG-I גילה ש-RIG-I siRNA הוריד את ביטוי RIG-I בתאי NRK-52E עם או בלי גירוי היפוקסי (Eig 2A). לאחר מכן חקרנו את התפקיד של הרגולציה המושרה על ידי היפוקסיה של RIG -I בביטוי של IFN- /B בתאי NRK-52E באמצעות RIG-I siRNA או בקרה שלילית. RIG-siRNA דיכא את הביטוי של IFN- / ב-NRK-52Ecells (Eig2Band2C).
RIG-I מתאם עם רמות הביטוי של IFN- / בדגימות כליה אנושית של נפרופתיה IgAבדקנו האם רמת הביטוי של RIG-I קשורה ל-IFN-a/ בדגימות ביופסיה כליות שהתקבלו מחולים עם נפרופתיה IgA (n=33). המאפיינים הקליניים המפורטים של חולים אלה מוצגים בטבלה S1. צביעה אימונוהיסטוכימית עבור RIG-I ו-IFN- / חשפה את הביטוי שלהם בגלומרולי ובאבוביות הכליה (איור 3A), והראתה כי RIG-I נמצא בקורלציה חיובית עם IFN-o/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively)(eig="">
היפוקסיה לא משנה את רמת הביטוי של klotho בעכברים WT ו-K1-/כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי היפוקסי על ביטוי klotho in vivo, חקרנו את הביטוי שלו ב-WT ו-K-/עכברים עם או בלי 10 דקות של גירוי היפוקסי. סופג מערבי וצביעה אימונוהיסטוכימית גילו שביטוי קלוטו לא היה שונה בין עכברי WT עם ובלי היפוקסיה ושביטוי קלוטו לא נצפה ב-KIT/עכברים ללא קשר לנוכחות או היעדר גירוי היפוקסי (Eig 4Aand4B). בעכברי WT, klotho. חלבון נצבע בציטופלזמה של תאים צינוריים (איור 4B).ביטוי RIG-I מועצם בתנאים היפוקסיים בעכברי K~.קלוטו תוך-תאי מקנה את היכולת לדכא דלקת בתיווך RIG-I, ולכן בדקנו את רמת הביטוי והלוקליזציה של RIG-I בהיפוקסיותכליותשל עכברי WT ו-Kl−/−. סופג מערבי גילה שביטוי RIG-I גדל בעכברי WT עם גירוי היפוקסי ושהוא התעצם בעכברי Kl-/- (איור 5A). אימונוהיסטוכימיה הראתה שהאזור החיובי ל-RIG-I גדל בעכברי Kl-/-, דבר שהיה דומה לתוצאות שהתקבלו מ-Western blotting (איור 5B).
IFN- מווסת בתנאים היפוקסיים בעכברי KI--כדי לזהות את ההשפעות של היפוקסיה על הביטוי של-a ב-wvo, בדקנו את רמת הביטוי והלוקליזציה שלו בעכברי WT היפוקסיים ו-KI. סופג מערבי גילה שביטוי IFN- עלה בעכברי WT עם גירוי היפוקסי ושהוא עבר ויסות נוסף בעכברים (איור 6A). צביעה אימונוהיסטוכימית גם גילתה שהאזור החיובי של IFN- - נצפה בעיקר בתאים צינוריים, ושרמת הביטוי של IFN- הראתה את אותה נטייה כמו ב-Western blotting (איור 6B).
IFN- מוגבר בתנאים היפוקסיים ב-K1T-/עכבריםבנוסף ל-IFN-c, בדקנו את רמת הביטוי והלוקליזציה של WT היפוקסי IFN-Bin ועכברים. מתוצאות ה-Western blotting, ביטוי IFN- עלה בעכברי WT עם גירוי היפוקסי, בעוד שעלייה נוספת נצפתה ב-KIT/עכברים (איור 7A). לאחר כימות האזור החיובי של IFN, רמת הביטוי של IFN- עלתה בעכברי KI-/- בהשוואה לזו בעכברי WT' (איור 7B).
נצפה בעכברי Kl-/- ללא קשר לנוכחות של גירוי היפוקסי. הראינו שהיפוקסיה כלייתית הגדילה את הביטוי של RIG-I ו-IFN-/ וכי הביטוי שלהם התעצם עוד יותר בעכברי Kl-/-. ממצאים אלה הצביעו על כך שמחסור בקלוטו העצים את הביטוי המושרה בהיפוקסיה של RIG-I, וכתוצאה מכך להגברת הוויסות של IFN-/. זיהינו שהיפוקסיה גרמה לביטוי של RIG-I ו-IFN-/ הן במחקרים חוץ גופיים והן במחקרים in vivo. כדי להסתגל למצבים היפוקסיים, HIF מיוצב ומתפקד כגורם שעתוק [30]. במחקר קודם, דווח כי RIG-I מעורב במולקולות הניתנות להשראת HIF. עם זאת, לא הצלחנו לזהות ש-RIG-I הוא גורם מטה של HIF. בנוסף לזיהום בנגיף, ביטוי RIG-I עולה בתנאים היפוקסיים [31]. למרות שמחקרים קודמים דיווחו כי היפוקסיה משפיעה על תאי אפיתל צינוריים, תאי אנדותל, פריציטים, פיברובלסטים, תאי דלקת ותאי אבות בכליות [32,33], אנו מראים שהוויסות העל של RIG-I נצפתה בעיקר בתאי אפיתל צינוריים בעכברים עם גירוי היפוקסי, כמו גם בחולים עם נפרופתיה IgA. מכיוון שצינוריות הכליה נחשבות כאתר כניסה של פתוגנים טרנס-אורתרליים [34], RIG-I עשוי למלא תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית של תאי אפיתל צינוריים בתנאים היפוקסיים. התגובה החיסונית המולדת מופעלת לא רק על ידי מיקרואורגניזמים אלא גם אותות אזעקה של תאים פגועים, פצועים או לחוצים [35]. במחקר זה, הראינו שהביטוי המושרה בהיפוקסיה של RIG-I השתתף בייצור IFN-/ בקו תאי חולדה של צינוריות כליה. הנתונים המוצגים מצביעים על כך שביטוי RIG-I מתפקד כמערכת החיסון המולדת של הציטוזול בתגובה ללחץ היפוקסי כמו גם לזיהום בנגיף. מחקרים קודמים תיארו כי היפוקסיה מגבירה במהלך התפתחות CKD ללא קשר למחלה הראשונית וכי היפוקסיה תורמת להתקדמות הנזק הכלייתי [17]. במחקר קליני באמצעות הדמיית תהודה מגנטית תלוית רמת חמצון בדם, היפוקסיה כליתית לא רק התחזקה במהלך התקדמות CKD אלא גם ניבאה התקדמות כזו [36]. לפיכך, היפוקסיה נחשבת כיום כמסלול הנפוץ להתקדמות השלב הסופימחלת כליות, כך שדלקת הנגרמת על ידי היפוקסיה צריכה להיות מטרה טיפולית לדיכוי התקדמות CKD.
הראינו שהיפוקסיה גורמת לייצור של IFN-/ , המסווגים כאינטרפרונים מסוג 1. אינטרפרונים מסוג 1 מתפקדים בעצם לעיכוב שכפול ויראלי [37] ולהתנגד לדיכוי חיסוני הנגרם על ידי היפוקסיה [21,22]. עם זאת, מחקרים שבוצעו עד כה דיווחו כי אינטרפרונים מסוג 1 מובילים להפעלה של תאים הורגים טבעיים, הממלאים תפקיד חשוב לא רק בהסרה של תאים נגועים בנגיף אלא גם בפגיעה ברקמות [38]. למעשה, מחקרים קודמים דיווחו כי RIG-I תורם לדלקת באיברים שונים, כגון הריאה [39],כִּליָה[40], ומערכת העצבים [21]. במחקר זה, הראינו גם ש-upregulation-induced hypoxia של RIG-I אחראי לייצור IFN-/. לפיכך, אינטרפרונים מסוג 1 עשויים לתפקד כדי להגן מפני זיהום במצב של היפוקסיה, אך הם יהיו מזיקים בתנאים לא נגועים. יתרה מכך, מחקר קודם דיווח כי בנוסף לאינטרפרונים מסוג 1, RIG-I מעורב בייצור של ציטוקינים שונים, כגון IL-1, IL- 6 ו-TNF- [41]. מכיוון שציטוקינים אלו גורמים לנזק לרקמות, היפוקסיה הנגרמת על-רגולציה של RIG-I עשויה להשתתף בהתקדמות של CKD. הראינו כי מחסור בקלוטו מגביר את ביטוי RIG-I המושרה בהיפוקסיה, המלווה בוויסות העל של IFN-/. על פי הדיווחים, ביטוי Klotho פוחת עם ההזדקנות והתקדמות CKD [42,43]. לכן, ביטוי RIG-I עשוי להיות מווסת יותר בקרב קשישים וחולי CKD בתנאים היפוקסיים, מה שמוביל לייצור IFN-/. כפי שהוזכר לעיל, קלוטו קיים בשלוש צורות - ממברנה, מופרשת וקלוטו תוך תאית - כאשר האחרון אחראי על דיכוי ייצור ה-RIG-I של ציטוקינים דלקתיים [26]. במונחים של לוקליזציה, הראינו שביטוי קלוטו מתרחש בעיקר בתאי הצינורית הכלייתית, עם עדות לכך שביטוי RIG-I מועצם בעיקר בתאי הצינורי הכלייתי בתנאים היפוקסיים. ממצאים אלו מצביעים על כך שרמה ירידה של ביטוי קלוטו תורמת לייצור משופר בתיווך RIG-I של אינטרפרונים מסוג 1 בתנאים היפוקסיים.
CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות
לסיכום, הראינו שגירוי היפוקסי שגרם ל-RIG-I ו-IFN-/ בכליות עכברים ובקו תאי חולדה של תאים צינוריים של הכליה, וש-RIG-I היה מעורב בהיפוקסיה גרמה להגברת ויסות של IFN-/in vitro. בדגימות ביופסיה של הכליה מחולים עם נפרופתיה מסוג IgA, ביטוי RIG-I נמצא בקורלציה לוויסות העל של IFN-/. לבסוף, הביטוי המושרה בהיפוקסיה של RIG-I התגבר בעכברי קלוטו-נוק-אאוט, יחד עם הוויסות ההעלאה של IFN-/. ביטוי בתיווך RIG-I של אינטרפרון מסוג 1 עלה בתנאים היפוקסיים, ונצפה שיפור ויסות נוסף במצב של ירידה ברמת קלותו. על פי מחקרים קליניים, היפוקסיה מחמירה עם שלב CKD המתקדם [36] והיא מנבאת את ההתקדמות ארוכת הטווח של CKD [36]. בנוסף, ביטוי קלוטו פוחת עם הירידה בתפקוד הכליות, והפחתה בביטוי קלוטו קשורה לנזק כלייתי [44]. במחקר זה, אנו מראים כי מחסור בקלוטו מגביר את הביטוי המושרה בהיפוקסיה של IFN-/ באמצעות וויסות מוגברת של RIG-I בכליות ושהביטוי של RIG-I קשור לזה של IFN-/ בחולים ממשיים עם נפרופתיה IgA. אם לוקחים את הממצאים הללו יחד, הן היפוקסיה והן הפחתת קלוטו מקודמים במהלך התקדמות CKD, ולכן ההפעלה של חסינות מולדת מוגברת בחולי CKD.
