תאים משולבים בכליות הם פגוציטים ומחומצים Escherichia Coli מופנמים אורופתוגניים
Feb 28, 2022
כִּליָהתאים משולבים מעורבים בהומאוסטזיס על בסיס חומצה באמצעות ביטוי ואקוולרי ATPase. כאן אנו מדווחים על שישה תת-סוגים של תאים משולבים אנושיים, כולל תאים משולבים עיקריים היברידיים שזוהו מתעתיקי תא בודד. התבגרות פגוזומית היא תהליך ביולוגי שעולה בדרגת ניתוח המסלול הביולוגי בעקבות חשיפה ל-Escherichia coli uropathogenic בשניים מתת-סוגי התאים המשולבים. הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית בזמן אמת של עכבריםשֶׁל הַכְּלָיוֹתצינוריות משולבות בחלבון פלואורסצנטי ירוק המבטאים Escherichia coli או pHrodo Green E. coli BioParticles מדגימים שתאים משולבים פעילים חיידקים פגוציטים ואז מחמצים את הפגוליזוזומים. בנוסף, תאים משולבים הגדילו את ביטוי ATPase ואקוולרי בעקבות UTI ניסיוני in vivo. ביחד, תאים משולבים מציגים תגובה תעתיק המתאימה לכליותהגנה, בולעת חיידקים ומחמצת את החיידקים המופנמים. תאים משולבים מייצגים תא אפיתל עם מאפיינים של פגוציטים מקצועיים כמו מקרופאגים.
מילות מפתח:מחלת כליות;רקמת כליה;תאי כליה;כליה; שֶׁל הַכְּלָיוֹת
צינורית איסוף הכליות היא המיקום הסופי לוויסות חומצה-בסיס 1. צינור האיסוף מורכב מתאי עיקריים ותאים משולבים (ICs). תאים עיקריים (PC) מתווכים ספיגת מלח ומים ומאופיינים באקוופורין ציטופלזמי 2 (AQP2) 2 . ICs עוזרים לשמור על הומאוסטזיס חומצי-בסיס ויש להם שלושה תת-סוגים מתוארים, סוג A (A-IC), סוג B (B-IC) ו-nonA-nonB 2,3. A-ICs מפרישים פרוטונים באמצעות H-ATPase vacuolar apical (V-ATPase) ומחדשים ביקרבונט באמצעות טרנספורטר כלוריד/ביקרבונט בזילארי (Cl - /HCO 3), חילופי אניונים 1 (AE1/band 3/SLC4A1) 1,4. B-ICs מפרישים HCO 3 - באמצעות טרנספורטר אפיקלי Cl - /HCO 3, pendrin (SLC26A4), ומבטאים V-ATPase 2,3 בזולטרליים. ICs nonA-nonB של מכרסמים הם בעלי pendrin אפיקלי ו-V-ATPase, אך ללא AE1, והם זוהו בצינור האיסוף ובצינורית החיבור (CNT) 3 . עדויות הולכות וגדלות תומכות בתפקיד חיסוני מולד עבור ICs יחד עם הפונקציה המסורתית שלהם של ויסות pH. ראשית, רובם של עשרה חולים לא קשורים עם דיסטלישֶׁל הַכְּלָיוֹתחמצת צינורית, מצב המאופיין בתפקוד לקוי של IC, דווח עם היסטוריה של UTI 5 . שנית, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), האורגניזם שבודד ב-70 אחוזים של pyelo-nephritis חריפה בזכרים ו-80 אחוז בנקבות, מתמקם באופן סלקטיבי לציטופלזמה של ICs 6,7. שלישית, זיהינו ש-ICs מבטאים פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) כגון ribonuclease 7 (RNASE7) 8-11. ל-AMPs אלו פעילות ישירה נגד מגוון פתוגנים, כולל חיידקים, בתחילת הדרך ו/או בתגובה לזיהום 8-11. רביעית, אנו ואחרים דיווחנו באופן עצמאי שלעכברים עם התפתחות IC חריגה יש רגישות מוגברת לזיהומים בדרכי השתן (UTIs) ו/או פיאלונפריטיס 12,13. חמישית, ICs גם חשים ומתווכים דלקת 14 . אחרון, הדגמנו ביטוי גנים חיסוני מולד ב-ICs מבודדים של עכברים 15,16
CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות
ההבנה כיצד ICs מגנים על דרכי השתן מפני זיהום חשובה מכיוון שנתקלים בתדירות של UTIs. למעלה מ-50 אחוז מהנשים חוות UTI במהלך חייהן, ו-UTI מהווים 1-6 אחוז מכלל הביקורים הרפואיים 17 . כאשר חיידקים עולים ל-כליותוכתוצאה מכך pyelonephritis, סיבוכים פוטנציאליים כוללים יתר לחץ דם, כרונימחלת כליות, ו urosepsis 18,19 . כ-250,000 מקרים של פיאלונפריטיס מתרחשים מדי שנה בארצות הברית 17 . עמידות לריבוי תרופות מתגלה כאתגר קריטי בכל הנוגע לטיפול ב- UTI וזיהומים אחרים 20 . לכן, המנגנונים שבהם משתמשים IC כדי להתגונן מפני אורפתוגנים עולים עשויים להיות מטרות טיפוליות שניתן לנצל לפיתוחכִּליָה-טיפול ספציפי בפיאלונפריטיס. מכיוון שרוב מחקרי ה-IC כוללים מודלים של בעלי חיים, תידרש הבנה טובה יותר של ICs אנושיים כדי להנחות מחקרים מדעיים בסיסיים לטיפול קליני משופר.
בגלל הכִּליָההוא איבר מורכב, פרופילי mRNA יכולים להיות קשים לפירוש. לדוגמה, לנפרון יש התמחות אזורית עם מקטעים צינוריים ותתי-סוגי תאים ברורים. הכִּליָהמכיל תאי דלקת אנדותל, אפיתל, אינטרסטיציאלי ותאי דלקת מגויסים, כולם בעלי פונקציות ביולוגיות מובחנות ודפוסי ביטוי גנים. ריצוף RNA חד-תא (scRNA-seq) מייצג מתודולוגיה המתקדמת במהירות לזיהוי ופרופיל סוגי תאים שונים בקו הבסיס או בתגובה לגורמי לחץ 21 . כאן, אנו מראים באמצעות טכנולוגיית scRNA-seq את האדם הזהכִּליָהICs מורכבים משש תת-קבוצות שונות הכוללות שלושה A-ICs, IC-PC היברידי אחד, IC אחד nonA-nonB ואחד B-IC. ניתוח מהירות RNA חשף שינוי תעתיק ממחשבי PC לכיוון תת-קבוצות של A-IC לאחר חשיפת UPEC. ניתוח נתיב המצאה חשף הבשלת פגוזומים כמסלול הביולוגי המרכזי בתת-קבוצה של A-IC בחשיפה ל-UPEC. בתוך מסלול זה, V-ATPases הם המרכיבים העיקריים המעורבים. השתמשנו במיקרוסקופיה תוך-חיונית כדי לדמיין ספיגת UPEC in vivo על ידי ICs ואישרנו חומצה של UPEC המופנמת ב-ICs אלה. לבסוף, מודל UTI של עכברים הדגים עלייה בביטוי mRNA של V-ATPase (Atp6v1b1). מחקר זה יספק את הבסיס לחקור ולתפעל טיפולית V-ATPase המבטאים תאי אפיתל כפגוציטים חיידקיים.
תוצאות
ניתן להעשיר ICs אנושיים באמצעות מיון תאים פעילים מגנטיים (MACS) עם חרוזים מגנטיים מצופים תורן/תאי גזע של גורם גדילה (CD117/c-KIT). בן אנושכִּליָהרקמה, בעיקר מהשוליים הרגילים שלכִּליָהכריתה המונית, נותחה לחתיכות של 2–4- מ"מ ולאחר מכן הועברה למעבדה שלנו ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) על קרח על ידי ה-Cooperative Human Tissue Network [https://www.chtn.org]. הערכנו את c-KIT כסמן משטח התא למיון ICs אנושיים מכיוון ש-c-KIT שימש בהצלחה למטרה זו בעכברים 22 . ביטוי c-KIT מקומי ל-ICs אנושי בהתבסס על הממצא ש-c-KIT וסמן ה-IC האנושי V-ATPase, תת-יחידה B1 (גן ATP6V1B1), סימנו יחד את אותם תאים באדםכִּליָהחתך (איור משלים 1) 22,23. בעקבות מיון מגנטי שכלל הסרה של CD45 פלוס תאי חיסון ותאים מתים; ההעשרה של ICs משוערים חיוביים ל-c-KIT הודגמה על ידי ביטוי mRNA של ATP6V1B1 שעלה פי 8-12- ב-c-Kit חיובי בהשוואה לתאים השליליים של c-KIT. הן SLC4A1 והן SLC26A4 הועשרו באופן משתנה ב-ICs המדגימים שהעשרת A-IC ו/או B-IC אפשרית באמצעות מתודולוגיה זו (איור משלים. 2). הרקע של רקמת הכליה המשמשת במחקר זה מוצג בטבלה משלימה 1.
ניתוח אשכולות משולב זיהה שישה תת-סוגי IC.ScRNA-seq הושלם ב-1861 בניתוקכִּליָהתאים שהועשרו עבור ICs כמתואר לעיל. ה-ICs המועשרים התקבלו מהשוליים הרגילים של יחידכִּליָהכריתה המונית. סינון בקרת איכות (QC) הועבר על ידי 859 תאים שנחשפו ל-UPEC במבחנה למשך שעה ו-1002 תאים שנחשפו למלוחים במבחנה למשך שעה. ניתוח פונקציות Seurat זיהה 12 אשכולות בהכנת התא הממוין (איור 1א). תשעת הסמנים השמורים ביותר בתוך כל אשכול מוצגים באיורים משלימים. 3–14. בסך הכל, תתי-סוגי IC היוו 1066 (57 אחוזים) מתוך 1861 התאים. שישה מהאשכולות ייצגו תת-סוגי IC. באופן ספציפי, מצאנו שלושה A-IC, אחד B-IC, אחד nonA–nonB-IC ותת-סוגים היברידיים PC–IC אחד.כִּליָהמינוח תאי אפיתל שהומלץ על ידי צ'ן ועמיתיו, יצרנים משומרים שדווחו בעבר כסמנים מסוג תא או סמנים משומרים המבדילים בין אחד מ-12 האשכולות מאחרים שימשו להקצאת סוג תא לכל אשכול (טבלה משלימה 2 , איור 1b, c, איור 2) 24–28.
תת-סוג A-IC וביטוי חלבון PC-IC היברידי מתאם עם תוצאות scRNA-seq. אימתנו ממצאי מפתח scRNA-seq, במיוחד ש-SLC8A1 (המכונה גם Na plus /Ca plus מחליף 1 (NCX1)) הוא סמן עבור PC-ICs היברידיים וכי חלבון הלם חום A (Hsp70) חבר 1A (HSPA1A) יחד עם תגובת צמיחה מוקדמת 1 (EGR1) הם סמנים שיכולים להבדיל בין תת-סוגי A-IC (איור 3). כי השתמשנו בשוליים הרגילים שלכִּליָהכריתת סרטן, אימתנו את ה-SLC8A1, HSPA1A ו-EGR1 שלנוכִּליָהדפוסי ההבעה היו עקביים לזה שניתן לראות ברגילכִּליָהרקמה מאטלס חלבון אנושי זמין בכתובת http://www.proteinatlas.org (איור משלים. 15) 29
איסוף פרופילי סמן תת-סוג של תאי צינור שהודגמו בעבר בעכברכִּליָהתאים נשארים שלמים במידה רבה באדםכִּליָהתאים. מכיוון שיהיה חשוב להקשר את ממצאי המודל העכברי העתידי לפתופיזיולוגיה אנושית, הערכנו ביטוי IC אנושי של סמני תאי צינור איסוף עכברים שזוהו בעבר במחקרי scRNA-seq שבוצעו על ידי Chen וחב'. 22 ו- Ransick et al. 30 . חלקת נקודה של התוצאות מוצגת באיור 4. סמנים מסוג תא איסוף צינור עכברים נשמרים בעיקר בתאי צינור איסוף אנושיים.
תת-סוג A-IC A עולה באחוז היחסי עם 1 שעה של חשיפה ל-UPEC. אחוזי התאים בתוך אשכולות היו עקביים בין סוג החשיפה למעט תת-סוג A/Cluster 0, שעלה מ-16.2 ל-20.1 אחוזים, ותת-סוג A-IC C/Cluster 5, שירד מ-9.4 ל-6.6 אחוזים, עם חשיפות למלוחים לעומת UPEC, P =0.03 (טבלה 1).
תאי PC-IC היברידיים משנים את מהירות ה-RNA שלהם הרחק ממחשבי PC לכיוון A-ICs בתגובה ל-1 שעה של חשיפה ל-UPEC. ניתן להשתמש בשפע היחסי של טרום-mRNA לא שחומל לאחרונה לעומת mRNA שחבור בוגר כדי לחשב את השינוי בשפע ה-mRNA, הנקרא מהירות mRNA 31. מהירות mRNA חיובית במחקרי תא בודד מצביעה על כך שגנים עוברים ויסות כאשר מהירות mRNA שלילית פירושה שהגנים עוברים ויסות 31 . כיוון מהירות ה-RNA מסיק שלתא יש מסלול ביטוי mRNA לכיוון סוג תא אחר 31,32. מהירות ה-mRNA בתגובה לחשיפה ל-UPEC מוצגת באיור 5. חשיבות רבה, PC-ICs היברידיים משנים את מהירות ה-RNA שלהם הרחק ממחשבי PC ולכיוון ICs בתגובה ל-UPEC. בנוסף, ICs שומרים על פעילות התעתיק שלהם, בעוד שפעילות התמלול הופכת מינימלית באחריםכִּליָהסוגי תאים.
פרופיל החיסון המולד של הכליה מדגים כמה שינויים מוקדמים בביטוי של תא בודד לאחר שעה אחת של חשיפה ל-UPEC.דפוסי ביטוי scRNA-seq של גנים חיסוניים מולדים נבחרים בעקבות חשיפה ל-UPEC לעומת מלוחים למשך שעה מוצגים באיורים משלימים. 16 ו-17. הממצאים העיקריים כוללים ביטוי גבוה של ה-AMP adrenomedullin (ADM) בתתי סוגים A-IC A ו-B, PC-ICs היברידיים ו-B-ICs. מחשבי PC אינם מבטאים אדרנומדולין בקו הבסיס, אך בעלי ביטוי מוגבר באופן משמעותי בתגובה לחשיפה ל-UPEC. ביטוי SH2- המכיל SH2- המכיל ציטוקינים וביטוי מחסום לגורם אוטואינטגרציה 1 (BANF1) מושרה באופן משמעותי ב-IC nonA-nonB בעקבות חשיפה ל-UPEC. זוהו רק אינטרלוקין 18 (IL18), גלקטין 3 (LGALS3), בטא דפנסין 1 (DEFB1) ומתמר אותות CD24 lipocalin 2/נוטרופיל ג'לטינאז (LCN2/NGAL)
ב-PC-ICs היברידיים ורק ביטוי מינימלי של קולטן 4 mRNA היה קיים. לא זיהינו ביטוי של ריבו-נוקלאז 7 (RNASE7) ב-scRNA-seq. הערכנו את ביטוי ה-mRNA של RNASE7 ב-IC ממוין מגנטית ולא-ICכִּליָהתאים. ביטוי mRNA של RNASE7 זוהה ב-ICs מאחד מכל ארבעהכליות(איור משלים. 18).
התהליך הביולוגי של התבגרות הפאגוזום קשור ל-ICs שנחשפו ל-UPEC למשך שעה.עשרת המסלולים הביולוגיים המובילים הקשורים לכל אשכול דורגו לפי ערך p כפי שנקבע על ידי ניתוח נתיב המצאה. לשלושה אשכולות איסוף המוקצים לצינורות A-IC תת-סוג A/אשכול 0, תת-סוג A-IC B/אשכול 3, ותת-סוג A-IC C/cluster 5 היו תהליכי מסלול ביולוגיים דיפרנציאליים בעקבות חשיפת UPEC בהשוואה למלוחים (איור .6א–ג). התבגרות פגוזום הייתה הפונקציה המדורגת במקום הראשון בתאים שנחשפו ל-UPEC ולמי מלח בתת-סוג A-IC/אשכול 5, הועברה ממיקום שני לראשון בתת-סוג A/אשכול A-IC 0 וממקום רביעי לשלישי בגובהו בתת-סוג A-IC B/ אשכול 3. לאף אחד מתת-הסוגים הנותרים של תאי צינור איסוף (איור משלים. 19) לא היו עשרת המסלולים המשויכים המובילים שהיו שונים בעקבות חשיפה ל-UPEC בהשוואה לתמיסת מלח. פרופיל ביטוי הגנים שהביא לדירוג הבשלת הפאגוזום עבור תת-סוג A/Cluster 0 של A-IC מוצג בטבלה משלימה 3.
ביטוי IC Atp6v1b1 mRNA עולה בתגובה לפיילונפריטיס ניסיוני in vivo.מסלול ההתבגרות הפאגוזום של Ingenuity הדגיש את V-ATPase כמעורב ב-ICs (טבלה משלימה 3). כדי לקבוע אם V-ATPase מופעל בחשיפה ל-UPEC, השתמשנו במודל UTI של עכברים. שעה אחת לאחר חיסון UPEC עם מי מלח דרך "IC reporter", אשר להם ביטוי tdTomato (tdT, וריאנט חלבוני פלואורסצנטי אדום) ב-ICs, הורדמו ו-ICs הועשרו מ-Dissociation.תאי כליה. ל-ICs מועשרים היה ביטוי גבוה יותר של mRNA של Atp6v1b1 בעכברים עם חיסון UPEC בהשוואה לבקרת מלוחים (איור 6ד).
ICs phagocytize UPEC in vivo.פיתחנו מתודולוגיה לזלף סינגלכִּליָהtubule עם UPEC בעכבר חי עם שלםכִּליָה.חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המביע UPEC אגרגטים מיקרופלוסיים לתוך לומן של צינורית כליה אחת של עכברי "IC reporter" הוצגו זורמים דרך צינוריות, נצמדים באופן סלקטיבי למשטח הלומינלי ומופנמים על ידי ICs (איור 7) במהלך מיקרוסקופיה תוך-חיונית.
ICs מחמצים UPEC המכילים phagolysosomes in vivo ובַּמַבחֵנָה.כמו כן, זרמנו את הצינוריות עם pHrodo Green E. coli BioParticles שרק עוברים חומצה. קליטה וקרינה של חלקיקים ביולוגיים אלה הוצגה רק במהלך מיקרוסקופיה תוך-חיונית ב-ICs (איור 8). ניתוח פילוח של Imaris הראה כי הקרינה הירוקה גדלה באופן משמעותי עם הזמן ב-tdT פלוס ICs בתוך 2 צינוריות מפוזרות עם pHrodo Green E. coli BioParticles בהשוואה ל-tdT פלוס צינורית ביקורת (איור 9a, ב). כאשר הקרינה הוערכה על בסיס תאי, 12/16 (75 אחוזים) tdT פלוס תאים הדגימו עלייה בקרינה ירוקה לאורך זמן בעקבות זלוף צינורי עם pHrodo Green E. coli BioParticles (איור 9b). תוצאות הרגרסיה הליניארית מכל תא מוצגות בטבלה משלימה 4. ממצאי ההדמיה התוך-חיונית החיים in vivo של phagocytosis והחמצה של PHrodo Green E. coli BioParticles על ידי ICs אושרו באמצעות בדיקת ציטומטריית זרימה חוץ גופית. Murineתא כליההשעיה מעכברי "IC reporter" שבהם ICs (CD45 - tdT plus) מביאים tdT באופן אנדוגני נחשף ל-pHrodo Green E. coli BioParticles לעומת תאים עם מדיה בלבד. תאי חיסון תושבי CD45 פלוס בהשעיית תאים הוגדרו כביקורת חיובית ותאי CD45 - tdT - (לא ICs) הוגדרו כביקורת שלילית. השוואת מדיה לבד ל
החשיפה לחלקיקים ביולוגיים, הקרינה הירוקה המעידה על רכישה והחמצה של חלקיקים ביולוגיים עלתה מ-{{0}}.7 ל-62.8 אחוז מתאי CD45 פלוס. ממצא זה מדגים את ספיגת החיידקים הצפויה על ידי פגוציטים מקצועיים כגון נויטרופילים. מעניין לציין ש-22.2 אחוזים מה-ICs ספגו חלקיקים ביולוגיים ירוקים בהשוואה ל-5.6 אחוזים שאינם ICs (איור משלים. 20), בקרת מדיה נקלטה ב-0.7 אחוז מה-ICs ו-0 אחוזים שאינם ICs.
דִיוּן
ICs קשה ללמוד, במיוחד בבני אדם, כי הם מהווים רק 7 אחוזיםכִּליָהתאים, מורכבים ממגוון של תת-סוגים, ואינם שומרים על הפנוטיפ שלהם בתרבות 33. חן וחב'. 22 דיווחו על ניתוח תא בודד על עכברכִּליָהתאים ו- Lake et al. דיווח על צינור רצף RNA חד-גרעיני בבני אדםכִּליָהתאים 34,35 . מחקרים אלו זיהו שני תת-סוגים של A-ICs. כאן, פיתחנו מתודולוגיה לביצוע רצף תא בודד על ICs אנושיים מועשרים ברי קיימא. העשרה עבור ICs בר קיימא במקום רצף את כולםכִּליָהתאים כדי לאפשר התמקדות מוגברת בסוג תא זה. הממצאים העיקריים שלנו היו (א) זיהוי שמחשבי PC היברידיים-IC יכולים לשנות את כיוון מהירות ה-RNA שלהם הרחק ממחשבי PC ולכיוון A-ICs בתגובה לחשיפה ל-UPEC, (ב) קיימים לפחות שלושה תת-סוגים של A-ICs והיחסים שלהם התדרים יכולים להשתנות בתגובה לחשיפה ל-UPEC, (ג) הבשלת פגוזומים היא מסלול ביולוגי מוביל בתתי-סוגי A-IC מרובים ויכולה לעלות במשמעות יחסית עם חשיפה ל-UPEC, ו-(ד) ICs פגוציט ומחמצנים את UPEC in vivo במהלך הדמיה של חיים עכברים.
ICs מבדילים בתגובה לחמצת על ידי היפוך הקוטביות שלהם 36,37. דווח כי ICs נובעים מתאי המבטאים AQP2- 38 . בשנת 2017, חן ועמיתיו זיהו תאים חיוביים כפולים המבטאים Aqp2 יחד עם Slc4a1 או Slc26a4 על ידי פרופיל של תאים בודדים של עכברים. ממצאים אלה אושרו על ידי פארק ועמיתיו בשנה שלאחר מכן 22,35. בשנת 2019, הוכחנו על ידי סימון אימונולי של חלבון ו-mRNA שקיימים PC-IC היברידיים 15 . באופן ספציפי, 9 אחוזים מה-ICs של עכברים שהוגדרו על ידי V-ATPase B1 תיוג אימונוולורסצנטי ניאון ביטאו גם Aqp2 mRNA שהוגדר על ידי הכלאה ניאון באתרו 15. המחקר הנוכחי הגדיר אוכלוסייה של בני אדםכִּליָה-איסוף תאי צינור המבטאים AQP2, ATP6V1G3 ו-SLC4A1 בהתאמה עם PC-ICs היברידיים. בחלקות tSNE ו-UMAP, תאים היברידיים אלה התקבצו הכי קרוב למחשבים, אבל היו שונים ממחשבים מסורתיים המבוססים על ביטוי סמן IC. ביטוי SLC8A1 היה נבדל לסוג תא זה. מעניין ש- SLC8A1 מעורב מאוד במעבר אפיתל-למזנכימלי. באופן ספציפי, היעדר SLC8A1 הופך פנוטיפים של תאי אפיתל באמצעות ערעור יציבות בתיווך-catenin של E-cadherin 39. כאן, אנו מדגימים כי ICs מתבדלים בתגובה לחשיפה לאורופתוגן. תאי PC-IC היברידיים משנים את מהירות ה-RNA שלהם, נגזרת הזמן של ביטוי ה-mRNA, הרחק ממחשבי PC לכיוון A-ICs בתגובה ל-UPEC. בעכברים, Ransick et al. 30 זיהו ביטוי Slc8a1 בעיקר בצינורית המפותלת הדיסטלית ובתאים הדומים למחשבי PC בצינורית המחברת. על תמונות מיקרוקופי קונפוקאליות שלנו להעריךכִּליָהביטוי SLC8A1, מצאנו תאים מבודדים המבטאים SLC8A1 בצינוריות AQP 2-חיוביות (למשל, צינורות איסוף או צינורות מקשרים). זיהינו גם צינוריות שליליות של AQP2- שבהן רוב התאים הביעו SLC8A1, שעשוי להיות תואם לביטוי Slc8a1 של צינורית מפותלת דיסטלית בעכברים. לחלק מתתי-סוגי A-IC יש מסלולים ביולוגיים מובילים דיפרנציאליים בעקבות חשיפת UPEC ותת-סוג A-IC A גדל בתדירות היחסית בתגובה ל-UPEC. ממצאים אלה מצביעים על כך שתת-סוג A-IC עשוי לייצג וריאנט חיסוני מולד. תפקידו של SLC8A1 בהבחנה בין IC מחייב חקירה במחקרים עתידיים.
CISTANCHE ישפר אי ספיקת כליות/כליות
ביצענו scRNA-seq על 1861 אדםכִּליָהתאים מתוכם 1066 ICs. כדי להקשר מודלים ניסיוניים של עכברים לפתופיזיולוגיה אנושית, יהיה חשוב להשוות בין ICs של בני אדם ועכברים. חן ועמיתיו העשירו עבור ICs של עכברים עם c-KIT וביצעו scRNA-seq 22. הם סיווגו 74 תאים כ-PC, 87 כ-A-ICs ו-23 תאים כ-B-ICs 22. רנסיק וחב'. 30 ביצעו scRNA-seq על 688 ICs. הם לא העשירו עבור ICs אלא חילקו אתכִּליָהלתוך הקורטקס, המדולה הפנימית והמדולה החיצונית כדי להעריך הבדלים אזוריים 30 . הראינו שנראה כי ביטוי סמן מסוג תא איסוף צינור עכברים נשמר במידה רבה בתאי צינור איסוף אנושיים. אם לעכברים יש תת-סוגים דומים לבני אדם, ככל הנראה תדרוש הערכה של תא בודד ממוקד של מספר גדול יותר של ICs של עכברים.
זיהינו ביטוי scRNA-seq IC של חלבונים חיסוניים מולדים כגון המתווך החיסוני והדלקתי galectin 3 (LGALS3) וה-ADM שעליו דיווחנו בעבר ב-ICs של מכרסמים 15,40-42. עם זאת, חלק מחלבוני החיסון המולדים שדווחו בעבר ב-ICs, כגון Lipocalin 2 (LCN2/NGAL), RNASE7 ו-Toll-like receptor 4 (TLR4) היו בעלי ביטוי מינימלי או שלא נראו ב-ICs אנושיים ברמת תא בודד ב הניתוח שלנו 6,9. מיעוט הביטוי של LCN2/NGAL ו-TLR4 ב-ICs תואם את מה שדווח ב-ICs של עכברים על ידי קבוצת המחקר שלנו יחד עם Ransick וחב'. 30כִּליָהcellexplorer/] 15 . חן וחב'. 22 אכן דיווחו על ביטויי TLR4 ו-NGAL mRNA ב-ICs, אך פי כמה פחות מאשר במחשבים. הערכנו ICs אנושיים מאוחדים לביטוי RNASE7 וזיהינו אותו בICs מ-1 מתוך 4כליות(איור משלים 18), המצביע על כך שהביטוי שלו עשוי להיות לסירוגין בהתאם לאזור, נקודת זמן ותנאים פיזיולוגיים. ביטוי CISH, המושרה ב-nonA nonB ICs בתגובה ל-UPEC, הוכח כמווסת את התגובה החיסונית המולדת ל-Mycobacterium tuberculosis בריאות ובטחול 43 . ICs הפגוציטו חיידקים במשך מספר דקות, והתאים שלנו עבור scRNA-seq נחשפו ל-UPEC למשך נקודת זמן קצרה יחסית של שעה. יש צורך במחקרים עתידיים כדי לקבוע אם מסלולי IC אחרים, כגון ביטוי AMP או ויסות של מוות תאי, הופכים בולטים יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר בעקבות חשיפת UPEC.
Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 מיקרומטר על ידי מעטפת ממברנת הפלזמה 44 . "פגוציטים מקצועיים", תאי חיסון שמקורם במיאלואידים, כולל מקרופאגים, נויטרופילים ואוסטאוקלסטים מבדילים בין חיידקים פולשים למיקרוביוטה ולתאים בריאים, בולעים את המטרה לפאגוזום, מייצרים מיני חמצן תגובתיים (ROS), מפרישים AMPs ומציגים אנטיגנים תאים אחרים 45-49. חשוב, החמצה חזקה על ידי V-ATPase של phagolysosomes יצירת מיקרו-סביבה חומצית מספיקה להרוג את רוב החיידקים היא סימן היכר המאפיין phagocytes מקצועי 48,50. לדוגמה, עיכוב V-ATPase עם bafilomycin A1 מדכא פעילות חיידקית מקרופאג 51. תאי אפיתל מסוימים פגוציטים חיידקים אך הם פחות יעילים בהרג חיידקים מאשר פגוציטים מקצועיים ותוארו כפגוציטים לא מקצועיים 52 . ICs מייצגים שושלת אפיתל בעלת יכולות פגוציטוזיס והצגת אנטיגן (איורים 6-9) יחד עם ביטוי AMP חזק ומיטוכונדריה נדיבה ליצירת ROS; לפיכך, נראה כי ל-ICs יש פוטנציאל להרוג חיידקים דומה יותר למקרופאגים מאשר לפגוציטים הלא מקצועיים שהוזכרו לעיל 8,53-55. A-ICs הוכחו בעבר כמסוגלים לשיעורים גבוהים של אנדוציטוזיס אפיקלי של דקסטרן לתוך שלפוחיות ציטופלזמיות 56. אנו משערים כי IC phagocytosis של UPEC היא הרחבה של מאפיינים משותפים עם מקרופאגים, כולל ביטוי V-ATPase, פוטנציאל חיזור, הפרשת AMP ויכולות אנדוציטוזיס 8,16,49,57,58. יש לקבוע אם ICs יכולים לפגוציט פסולת תאים וחיידקים שאינם UPEC באופן דומה לפגוציטים מקצועיים.
הדמיה קונפוקלית של יחידכִּליָהאבובות מפוזרות in vivo עם חיידקים מתרחבים בטכניקות קודמות במבחנה כמו תרבית תאים וזלוף של אבובות מנותחות. כאן, פיתחנו מתודולוגיה כדי לבדוק ישירות בעכברים חיים אם פגוציטוזיס היא פונקציית IC. מיקרוסקופיה תוך-ויטלי מאפשרת מחקר מורכב של תהליכים תאיים דינמיים בתוך עכבר מתפקדכליות59 . אסטרטגיות קודמות לניצול מיקרוסקופיה תוך-חיונית כללו הזרקה מערכתית של צבעים או סמנים תוך-וויטליים לעכברים כדי לחקור אנדוציטוזיס של אבוביות פרוקסימליות,כִּליָהדינמיקה של זרימת דם וחדירת כלי דם או גלומרולרית 60 . כאשר מיקרוסקופיה תוך-חייתית משולבת עם טכניקות כירורגיות מתוחכמות, ניתן ללמוד נקודות זמן מוקדמות שקשה להעריך של תהליכים זיהומיים 61 . בעבר, חיידקים עברו microperfused בצינוריות פרוקסימליות של חולדה כדי להעריך את זרימת הדם, גיוס נויטרופילים וחסימת שתן 62,63. הרוב המכריע של UTIs נובעים מפתוגנים עולים ויתקלו בתחילה בצינור האיסוף 64,65. לפיכך, אנו מציעים שצינור האיסוף הוא אזור צינורי קריטי להערכת אינטראקציות מארח-פתוגן. מערכת המודל התוך-חיונית שלנו משחזרת למעשה קלאסיקה
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
מחקר זלוף אבובת איסוף יחיד, אבל בעכבר חי עם שלםכִּליָה,אספקת דם, לימפה ונוירונים יחד עם יכולת נשמרת לקיים אינטראקציה עם תאי חיסון. לפתופיזיולוגיה של פיילונפריטיס יש הבדלים בין גברים לנקבה. לדוגמה, אצל בני אדם, נקבות נוטות פי חמישה לפתח פיאלונפריטיס חריפה, אך לעכברים זכרים יש חומרה מוגברת של פיאלונפריטיס בתיווך אנדרוגן 66,67. Ransick ועמיתיו הדגימו הבדלים בין גברים ונשים בתאי אבובות פרוקסימליים, במיוחד בטרנספורטרים של אניונים אורגניים 30 . ICs גברים הוערכו הן ברצף תא בודד והן במחקרים תוך-חיוניים. בגלל תפקידם של ICs בהגנה החיידקית שלכִּליָהואיזון אלקטרוליטים, מגוון הקשור למין בתפקודי IC, כגון phagocytosis וביטוי גנים של תא בודד, יהיו תחומי מפתח למחקרים עתידיים. למחקר הזה יש מגבלות. החשיפה של UPEC ל-ICs אנושיים ב-scRNA-seq שלנו הייתה במבחנה ליחידכִּליָהועשויים להיות הבדלים בהשוואה לחשיפה ל-UPEC in vivo. בנוסף, הממצאים שלנו ייצגו את האזור האנטומי של האדםכִּליָהמחקרים שנדגמו ועתידיים עם מיקומים שונים עשויים להיות בעלי גיוון אזורי כפי שהדגימו על ידי Ransick et al. 30 . ICs היוו 57 אחוז מהתאים ב-scRNA-seq שלנו, מועשרים מהרכב ה-IC של ~7 אחוז בכליותבקו הבסיס 33. הדגימה שלנו אמנם הכילה כמה סוגי תאי אפיתל ואנדותל אחרים, אבל הייתה שלילית עבור תאי CD45 פלוס חיסון שמוינו לפני העשרה של ICs (איור 1, איור משלים 1). עם scRNA-seq, ניתן היה לזהות ולהעריך את ICs היעד בנפרד. תאי גזע המטופואטיים מבטאים c-KIT, אך סביר להניח שהם לא מייצגים אתכִּליָהאוכלוסיות תאי מיאלואיד תושב 68. לא זיהינו תאים אחרים המבטאים c-KIT הנמצאים באדם בריאכליות, כגון תאי סטרומה/טלוציטים 69 . בעבר דווח על לולאה מבודדת של חיוביות של Henle ושל tubule proximal c-KITכִּליָהאימונוהיסטוכימיה תואמת לתוצאות ה-scRNA-seq שלנו 70