גרסאות הקשורות למחלת כליות של אפוליפופרוטאין L1 מציגות רווח בתפקוד בפעילות ערוץ קטיונים

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

ג'ונתן ברונו וג'ון סי אדוארדס

גרסאות ב-Apolipoprotein L1 (ApoL1) ידועות כאחראיות לסיכון מוגבר לכמה פרוגרסיבייםכִּליָהמחלותבקרב אנשים ממוצא אפריקאי. ApoL1 הוא חלבון אמפיטרופי שיכול להחדיר לממברנות פוספוליפידים ולהעניק חדירות סלקטיבית של אניונים או קטונים לממברנות פוספוליפידים בהתאם ל-pH. לא ידוע אם הפעילויות הללו שונות בין הגרסאות או אם הן תורמות לפתוגנזה של המחלה. השתמשנו במבחנים של שטף יונים מונע על ידי מתח משלפוחיות פוספוליפידים ושל אסוציאציה של ממברנה יציבה כדי להעריך הבדלים בין ApoL1isoforms. קיימת עלייה משמעותית (כפולה בערך) בפעילות ה-permease של יונים סלקטיבית של שתי הגרסאות הקשורות למחלת כליות בהשוואה לחלבון הייחוס. לעומת זאת, איננו מוצאים הבדל בפעילות הפרמיאז הסלקטיבית לאניונים ב-pH נמוך בין האיזופורמים. בהשוואה לרצף הייחוס, שני הגרסאות הקשורות למחלה מראים קשר יציב מוגבר עם שלפוחית ​​פוספוליפידים בתנאים התומכים בפעילות הקטיון-פרמיאז, מה שמצביע על כך ש- פעילות מוגברת עשויה להוביל לאסוציאציה ולהחדרה יעילה יותר של הממברנה. אין הבדל באסוציאציה של הממברנה בין איזופורמים בתנאים אופטימליים לפעילות האניון פרמיאז. נתונים אלה תומכים במודל שבו חדירות קטיון מוגברת עשויה לתרום למחלות כליה פרוגרסיביות הקשורות לאללים של ApoL1 בסיכון גבוה.

ידועות כי שתי גרסאות מובחנות בחלבון ApoL1 אחראיות לסיכון המוגבר המוכר לפרוגרסיבי פרוטאינוריכִּליָהמַחֲלָהבאנשים ממוצא אפריקאי, במיוחד עקב גלומרולוסקלרוזיס מגזרת מוקדית, נפרוסתית יתר לחץ דם ונפרופתיה הקשורה ל-HIV (1-3). התפקידים התפקודיים של ApoL1 בתאים אנושיים, ההשפעה של גרסאות הקשורות למחלה על תפקודים אלה, וכיצד כל שינוי כזה חוסר פעילות עשוי להאיץמחלת כליותאינם ברורים (4, 5).

הפעילות הביוכימית היחידה שידוע שיש לחלבון ApoL1 היא לתפקד כתעלת יונים. התחום N טרמינלי של ApoL1 צוין כבעל דמיון מבני לקוליצין A1 חיידקי (6). כמו קוליצין A1, ApoL1 הוא חלבון אמפיטרופי שבנסיבות מסוימות יכול לחדור לממברנה שומנית מתמיסה מימית ואז לתפקד כחלחלת יונים (6-9). ApoL1 רקומביננטי פראי מטוהר יציב בתמיסת דטרגנט ב-pH נייטרלי (8, 9). ב-pH נמוך, ApoL1 יכול לחדור לקרום פוספוליפידים ולהגביר את החדירות הסלקטיבית לאניונים של הממברנות (6, 7, 9). כאשר ה-pH cis מועלה בחזרה לנייטרלי, החדירות הסלקטיבית לאניונים מדוכאת ומופעל ערוץ סלקטיבי של קטונים (8, 9). נתונים אלה תומכים במודל שבו ApoL1, המוצגת לתא חומצי לאורך המסלולים האקסוציטיים או האנדוציטיים, יכולה להחדיר לתוך הממברנה המגבילה של האורגנלה המובילה לחדירת אנוונים מוגברת. סחר לאחר מכן של החלבון לתאי ממברנה אחרים שבהם ה-pH ב-cis יהיה ניטרלי (כגון קרום הפלזמה או ממברנות המיטוכונדריה) ידכא את חדירות האניונים ותפעיל את הקטיונפרמיאז. האם פעילויות חדירת יונים אלו ממלאות תפקיד בפתוגנזה של ApoL1-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמחלותאינו ברור.

השתמשנו בשיטות המבוססות על שלפוחית ​​כדי לבחון הבדלים בפעילויות של חדירת יון וקשירת ממברנה בין רצף ההפרשה (סוג פראי), המסומן G0, לבין הווריאציות הקשורות לשתי מחלות, המכונות G1 ו-G2. אנו מוצאים שבהשוואה ל-G0, האיזופורמים G1 והן G2 מראים פעילות ספציפית מוגברת של פעילות הפרמיאז הקטיונית ב-pH ניטרלי מבלי לשנות את פעילות הפרמיאז הסלקטיבית לאניונים ב-pH נמוך. יתר על כן, האיזופורמים G1 ו-G2 הקשורים למחלה מראים קשר מוגבר של ממברנה יציבה בהשוואה ל-G0 בתנאים התומכים בפעילות הקטיון-פרמיאז אך לא בתנאים התומכים בפעילות ה-theanion permease. איננו מוצאים כל השפעה על דפוס רגישות ה-pH של שלב הקישור או של שלב הפליטה של ​​פעילות ערוץ הקטיונים, ולא מוצאים השפעה על רגישות ה-pH של פעילות ה-permease-סלקטיבית לאניונים. אנו מסיקים כי הווריאציות הקשורות למחלה של ApoL1 משפרות באופן סלקטיבי את פעילות ערוץ הקטיונים של החלבון, ככל הנראה לפחות חלקית על ידי שיפור החדרת הממברנה. אנו מציעים שפעילות ערוץ משופרת זו תורמת לפרוגרסיביתכִּליָהמַחֲלָהבאנשים הנושאים גנוטיפים בסיכון גבוה.

Cistanche יכול לטפלמחלת כליות

תוצאות

איזופורמים רקומביננטיים של ApoL1 עם רצף ה-N-terminalsignal הוסר והוחלף בתג 6His/T7epitope באו לידי ביטוי וטיהרו. כל השלושה הראו תכונות כרומטוגרפיות זהות במהלך הטיהור ולא ניתן היה להבחין בהם על ידי אלקטרופורזה של ג'ל איור 1.

שברי שיא דוללו ל-100 ug/ml ועברו מבחני פליטת שלפוחית ​​ליכולת להעניק חדירות כלוריד ואשלגן. הבדיקה מורכבת משני שלבים נפרדים. בשלב האסוציאציות, ApoL1 מעורבב עם שלפוחיות פוספוליפידים עמוסות KCl ומאפשרים להחדיר לתוך הממברנות. KCl חוץ כלי ומאגר מוסרים לאחר מכן על ידי מעבר דרך עמודת ספין התפלה מאוזנת בסוכרוז איזוטונית, מה שיוצר שיפועים גדולים מבפנים אל חוץ של שני הקנדים. יוני Cl. בשלב ההפלגה, eluate עמודת הספין מדולל לתוך תמיסה איזוטונית סוכרוז מבוצר השומרת על שיפוע KCl ב-pH הרצוי. ריכוז Cl Extravehicular מנוטר עם אלקטרודה סלקטיבית כלוריד. גם אם קיימת חדירות K או Cl סלקטיבית, אף אחד מהם לא יוכל לצאת מהשלפוחיות בגלל היעדר תנועת נגד. זרימת יונים מונעת מתח מתחילה על ידי הוספת ריכוז רוויה של יונופור נגד יון. התוספת של היונופור הסלקטיבי K, valinomycin(Val), תגרום לפוטנציאל פנימי שלילי גדול של קרום, שאם קיימת חדירות Cl, יניע את זרימת KCl שתתגלה על ידי האלקטרודה הסלקטיבית לכלוריד; לפיכך לאחר Val, קצב זרימת Cl משקף את חדירות Cl. לעומת זאת, הוספה של היונופור הסלקטיבי Cl, Chloride Ionophore 1(CI1), תגרום לפוטנציאל פנימי חיובי של קרום שיניע את פליטת KCl אם קיימת חדירות K. לפיכך, לאחר הוספת CI1, קצב פליטת Cl משקף את חדירות K. מבחן זה יכול לשמש כמבחן חדירות Cl או K, תלוי באיזה יונופור נעשה שימוש. הקצב הראשוני של ioneflux לאחר הוספת יונופור נחשב לחדירות הספציפית של השלפוחיות. שימו לב, פליטת Cl לפני הוספת היונופור מעידה על חדירות מסוימת לשני Kand Cl. אפילו בנסיבות אלה, קצב פליטת Cl לאחר הוספת עודף של יונופור נגד יון מייצג את החדירות ליון המעניין - Cl לאחר הוספת Val, ו-K לאחר הוספת CI1.

Cistanche יכול לטפלמחלת כליות

פעילות כלוריד פרמיאז

מחקרים קודמים שלנו הראו שחדירות האניונים היא הגדולה ביותר כאשר הן שלב החיבור של הממברנה והן שלב הפלוג מתבצעים ב-pH 5.0, והתנאים הללו היו בשימוש כדי להשוות את פעילות חדירות ה-Cl של שלושת האיזואפורמים, תוך שימוש ב-Val כדי להתחיל זרימה תלויה בחדירות Cl. דוגמאות לנתונים גולמיים מוצגות באיור 2A, המציגה את הפלט מהאלקטרודה הסלקטיבית Cl במילי-וולט משורטט מול זמן. ההקלטה מתחילה לפני הוספת eluate עמודת הספין המכילה שלפוחיות וחלבון, ערך ה-mV משקף את ריכוז 10 מיקרומטר Cl. עמודת הספין ללא Cl מתווספת בחץ הראשון, ומדללת את Cl, מה שבא לידי ביטוי בהסטה כלפי מעלה של מעקב ה-mV. Val מתווסף בחץ השני, מה שמפעיל זרימת Cl אם קיימת חדירות Cl, מה שבא לידי ביטוי בירידה המתקדמת של inmV. טריטון X-100 מתווסף בחץ השלישי, ומשחרר את כל הכלוריד התוך-וסיקולרי שנותר. לאחר המרה מריכוז mV לריכוז כלוריד באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה עבור האלקטרודה בתנאי הבדיקה, הקצב הראשוני של שחרור Cl לאחר הוספת Val נקבע ונלקח כחדירות הכלוריד. בהשוואה לבקרה ללא חלבון (עקיבה כחולה), הקצב הגבוה של שחרור Cl לאחר הוספת Val מצביע על כך ש-ApoL1 מקנה Clpermeability ניכרת הנראית דומה בין שלושת האיזופורמים (עקבות אדום, ירוק וצהוב). השיעור הנמוך מאוד של הפליחה לפני Val מצביע על כך שחדירות האשלגן נמוכה בהרבה מחדירות Cl. טווח של ריכוזים של האיזופורמים ApoL1 נבדק עבור Cl permeaseactivity (איור 2B). כפי שדווח בעבר עבור G0, אנו מוצאים שפעילות Clpermease קשורה ליניארית למסת החלבון במבחן עבור כל שלושת האיזופורמים. פעילות הפרמיאז בכל ריכוז אינה שונה בין שלושת האיזופורמים. עקומת הריכוז בוצעה פעמיים באמצעות שתי ערכות שונות של תכשירי חלבון, והניבו את אותה תוצאה.

שש הכנות עצמאיות של שלושת החלבונים נבדקו עבור פעילות Cl permease ב-pH 5. 0 כפי שסוכם באיור 2C. באף אחת מקבוצות ההכנות לא מצאנו הבדל משמעותי בפעילות Cl permease בין האיזופורמים (p > 0.05 להשוואה של G0 עם G1 או G2 בכל קבוצה) . שיעורי הפליטה הממוצעים של כל ששת התכשירים (מסומנים ALL באיור 2C) היו 1.21 ± 0.32 אחוזים /שניות עבור רצף ההתייחסות G0, 1.36 ± 0.41 אחוז /שניות עבור G1, ו-1.18 ± 0.34 עבור G2(ממוצע ± SD, n=6 עבור כל אחד; p=0.47 ו-0.94 עבור השוואת G0 עם G1 ו-G2, בהתאמה). כדי לקבוע אם המוטציות הקשורות למחלה משנות את רגישות ה-pH של ה-theanion permease, חדירות Cl הניתנת על ידי כל איזופורם נבדקה באמצעות טווח של ערכי pH, תוך שימוש ב-pH המצוין הן עבור שלבי האסוציאציה והן של הזרימה של הבדיקה (איור 2D). הבדלים משמעותיים בין האיזופורמים. ניסוי זה בוצע פעמיים תוך שימוש בשתי קבוצות שונות של תכשירי חלבון, והניב את אותה תוצאה. לפיכך, פעילות Clpermease אינה שונה באופן משמעותי בין הווריאציות הקשורות לשתי מחלות ורצף ההתייחסות.

פעילות אשלגן פרמיז

מחקרים קודמים שלנו הצביעו על כך שחדירות הקטיונים היא הגדולה ביותר כאשר שלב השיוך של הממברנה מתבצע ב-pH 6.0 ושלב הפליטה מתבצע ב-pH 7.5, והשתמשנו בתנאים אלה אלא אם צוין אחרת. דוגמאות לנתונים גולמיים ממבחן K permease מוצגות באיור 3. כמו במבחני חדירות Cl, eluate עמודת הספין מתווספת בחץ הראשון, היונופור (במקרה זה, Chloride Ionophore1, CI1) מתווסף בחץ השני, ו חומר ניקוי מתווסף בחץ השלישי. שיעורי השטף הראשוניים לאחר הוספת האונופור, המייצגים את חדירות K, מוצגים על ידי הקווים המקווקוים האפורים. המעקב הכחול הוא מהשליטה ללא חלבון, המראה את חדירות הרקע האנדוגנית של השלפוחיות בלבד. המעקב האדום מראה את הפעילות של וריאנט G0(סוג פראי), המדגים בבירור נוכחות של Kpermeability גדולה יותר משלפוחיות הבקרה שהעניקו החלבון כפי שדווח בעבר (9). העקבות הצהובים והירוקים מראים את הפעילות של גרסאות G1 ו-G2, בהתאמה. השיפועים הראשוניים לאחר הוספת היונופור גדולים בבירור עבור G1 ו-G2 מאשר עבור G0, מה שמצביע על כך שהווריאציות הקשורות למחלה תומכות בפעילות פרמיאזית K גדולה יותר מאשר G0.

בניגוד למבחן חדירות Cl, וכפי שדווח בעבר עבור האיזופורם G0 (9), בתנאי מבחן החדירות K, ישנה זרימה מסוימת לפני היונופור בשלפוחיות המכילות כל אחד משלושת האיזופורמים, המיוצגת על ידי השיפוע כלפי מטה. של ההקלטות לאחר הוספת דגימה ולפני הוספת יונופור. בעוד שהשיעור הגבוה של זרימה לאחר הוספת יונופור מעיד על נוכחות של חדירות K משמעותית, זרימה לפני היונופור מצביעה על נוכחות של חדירות Cl כלשהי, מה שמאפשר לשני היונים לדלוף החוצה מהשלפוחיות בהיעדר יונופור. סביר שדליפה זו אחראית הן לעלייה הקהה בפלט האלקטרודה מיד לאחר הוספת עמודת הספין והשיפוע המטה שלאחר מכן לפני CI1 הנראה עם כל ההקלטות המכילות ApoL1. בהנחה שדליפה זו מתחילה כשהדגימה עוברת דרך עמודת הספין, היא גם תביא בחשבון את ההבדלים בריכוז ה-Cl הסופי לאחר הוספת חומר הניקוי, מכיוון שכל איבוד של KCl על עמודת הספין פירושו פחות סך KCl שנוסף למבחן. הפרשנות הכמותית של קצב היונופור אינה פשוטה מלבד שהיא חייבת להיות פונקציה של החדירויות לשני קנד Cl. כמו קודם (9), אנו מייחסים את הפעילות הזו לפעילות השיורית של Cl permease שאנו רואים ב-pH 7.5 כמו באיור 2D (ראה גם Bruno וחב' (9), איור 4D).

מבחני אשלגן פרמיאז בוצעו על פני טווח של ריכוזי חלבון (איור 4A). הפעילות הייתה קשורה באופן ליניארי למסת החלבון במבחן עבור כל איזופורם, אך שני האיזופורמים הקשורים למחלה הראו פעילות זרימה מוגברת משמעותית בהשוואה ל-G0. עקומת ריכוז זו שוכפלה עם שלוש קבוצות נפרדות של הכנת חלבונים שהניבו תוצאות דומות מאוד.

שש תכשירים עצמאיים של שלושת האיזופורמים נבדקו עבור פעילות K efflux באמצעות 2 ug של חלבון בכל בדיקה. בכל אחת מששת הקבוצות, הפעילות עבור האיזופורמים G1 ו-G2 הייתה גדולה משמעותית מזו של G0 (איור 4B). הממוצע של כל ששת מערכי הנתונים הניב שיעורי זרימה של 0.349 ± 0.063 אחוז /שניות עבור G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 אחוז /שניות עבור G1, ו-0.673 ± 0.142 אחוז /שניות עבור G2 (ממוצע ± SD, n=6 עבור כל אחד; p < 0.00001="" להשוואה="" של="" g0="" עם="" g1="" או="" g2).="" הפעילויות="" הספציפיות="" של="" ה-k="" permease="" של="" g1="" ו-g2="" גדולות="" פי="" 2.03-="" ו-1.93-בהתאמה,="" מ-g0="" בבדיקה="">

התלות של פעילות ה-K permease ב-pH של שלב האסוציאציה של הממברנה ובשלב זרימת היונים נותחה בנפרד. למרות שאישרנו שפעילות השטף הכוללת של G1 ו-G2 גדולה מזו של G0 בתנאים "סטנדרטיים" (קשירה ב-pH 6, זרימה ב-pH 7.5), לא מצאנו הבדל משמעותי בצורת העקומה אופקטיביות לעומת pH חיצוני (cis) של שלב האסוציאציה של הממברנה (איור 4C) או שלב זרימת היונים (איור 4D). כמו כן, לא מצאנו הבדלים בין האיזופורמים בתלות הפעילות ב-pH גבוה תוך שלפוחית ​​(טרנס) או בהכרח בנוכחות של קטיון דו ערכי (איור 4E), ובנוסף נציין כי סידן או מגנזיום יעילים באותה מידה במתן הקטיון הדו ערכי הדרוש עבור מלא פעילות. כל אחד מהניסויים הללו בוצע פעמיים באמצעות סטים שונים של חלבון מטוהר, והניב תוצאות זהות.

שיוך ממברנה יציבה

הוכחנו בעבר ש-Recombinant ApoL1 מטוהר נקשר באופן ספונטני לממברנות פוספוליפידים המציגות תלות דומה ב-pH ובקומפוזיציה של פוספוליפידים כמו זו של פעילויות ה-ion permease (9). באמצעות שיטות דומות, השווינו את מאפייני הקישור של שלפוחית ​​השומנים של גרסת הייחוס של ApoL1 עם הווריאציות הקשורות למחלת כליות בתנאים התומכים בפעילות אופטימלית של Cl או K permease (איור 5). עבור תנאי Clpermease, החלבון הודגר עם שלפוחית ​​שומנים ב-pH 5.0 לפני מיצוי כאוטרופי כדי להסיר חלבונים שלא היו קשורים ביציבות עם השלפוחית. חלבון קשור לממברנה בודד על ידי הציפה דרך כרית סוכריות והוערך על ידי סופג מערבי כמותי. התוצאות מוצגות באיור 5A. לא היה הבדל משמעותי בכמות החלבון הקשור לשלפוחיות בין G{{10}} לבין איזופורמים G1 או G2. מתוך 500 ng חלבון בכל תגובה, הכמות הקשורה לשלפוחית ​​הייתה 223 ± 33 ng עבור G0,239 ± 38 ng עבור G1, ו-191 ± 28 ng עבור G2 (ממוצע ± SD ; n=8 עבור כל קבוצה, p=0.35 ו-0.076 להשוואה של G0 עם G1 ו-G2, בהתאמה). כ-40-50 אחוז מהחלבון בבדיקה קשור לממברנות בתנאים אלו. ניסוי זה נעשה פעמיים והניב תוצאות דומות מאוד.

כדי להעריך את הקישור בתנאים האופטימליים לפעילות Kpermease, החלבון הודגר עם שלפוחיות ב-pH6.0, ולאחר מכן הוסט ל-pH 7.5 לפני מיצוי כאוטרופי כדי להסיר חלבון שלא מוכנס באופן יציב. חלבון קשור לממברנה בודד על ידי הציפה של שלפוחית ​​הממברנה דרך כרית אסוקרוז והוערך על ידי סיכה מערבית כמותית. התוצאות מוצגות באיור 5B. הגרסאות הקשורות למחלה מציגות קישור יעיל יותר באופן משמעותי בהשוואה ל-G0. מתוך 500 נג החלבון שנוספו לכל תגובה, הכמות שנקשרה לשלפוחית ​​הייתה 43.5 ± 14.5 ng (n=8) עבור G{{30}} ,73.0 ± 17.7 ng (n=7) עבור G1, ו-69.3 ± 10.3 ng (n=8) עבור G2(ממוצע ± SD; p=0.00076 ו-0.0018 להשוואה של G0 עם G1 ו-G2, בהתאמה). כ-9 אחוזים מהחלבון G0 בתגובה היו קשורים ביציבות עם השלפוחית ​​בהשוואה לכ-14 אחוזים מה-G1 וה-G2 בתנאים אלה. ניסוי זה נעשה פעמיים באמצעות תכשירים עצמאיים שהניבו תוצאות דומות.

דִיוּן

אנו מציגים כאן תוצאות של מחקרים על פעילות חדירת יונים של ApoL1 ושלוכִּליָה-מַחֲלָהגרסאות קשורות שהניבו מספר תוצאות משמעותיות. ראשית, אנו מוצאים שהווריאציות הקשורות למחלה של ApoL1 הגדילו באופן משמעותי את פעילות Kpermease, שהיא בערך כפול מזו של האיזופורם G0 במבחנים שלנו. שנית, בניגוד ל-Kpermease, אין הבדלים משמעותיים בפעילות הספציפית של פעילות ה-Cl permease ב-pH 5.0 בין האיזופורמים. שלישית, אין הבדלים ברגישות ה-pH של פעילות ה-K או Cl permease, או הדרישה ל-pH טרנס גבוה וההכרח של קטיון דו ערכי לפעילות ה-Kpermease בין האיזופורמים. רביעית, בתנאים אופטימליים התומכים ב-K permease, הגרסאות הקשורות למחלה מראים שיוך משופר של ממברנה יציבה בהשוואה ל-G0, אך אין הבדל בשיוך הממברנה בתנאים אופטימליים לפעילות Cl permease.

הממצאים שלנו המדגימים עלייה ב-K permease ללא השפעה על Cl permease הם חזקים מאוד. באמצעות תנאים אופטימליים עבור כל פעילות פרמיאז, מצאנו תוצאות זהות בעצם בין שש קבוצות עצמאיות של תכשירים, כאשר פעילות ה-Kpermease של הווריאציות הקשורות למחלה הייתה גדולה משמעותית מ-G0 בכל אחת מהן. כל סט הוכן ונבדק בו-זמנית באמצעות ריאגנטים נפוצים. תקפות ריכוזי החלבון שנקבעו על ידי מבחן BCA אושרה על ידי העוצמה הדומה של צביעת Coomassie ב-SDS-PAGE. נתונים אלה כוללים את כל הניסיונות המוצלחים של טיהור בו-זמנית - מעולם לא יצרנו בהצלחה נכס מכל שלושת הגרסאות שבהן פעילויות יחסיות אלה לא נצפו.

כמו כן, היעדר הבדלים בפעילות הספציפית לאניון-פרמיאז ב-pH 5 היה עקבי בין כל קבוצות ההכנות. לפיכך המסקנה העיקרית שלנו היא שהגרסאות הקשורות למחלה של ApoL1 מעניקות רווח סלקטיבי של תפקוד בפעילות ה-K permease מבלי להשפיע על פעילות Cl permease, כפי שנבדקה בתנאים אופטימליים עבור כל אחת מהפעילויות הללו. לנוכחותם של הבדלים מהותיים בפעילות ערוץ הקטיונים של גרסאות ApoL1 המתואמות עם היכולת להניע מחלה יש השלכות על מנגנונים פתוגניים אפשריים. האופי הסלקטיבי של חדירות היונים המוגברת מצביע על כך שפעילות מוגברת של חדירות קטיון של הגרסאות הקשורות למחלה עשויה לתרום למחלה, אך לא סביר שפעילות החדירה של אניונים ב-pH נמוך, שאינה שונה בין האיזופורמים, לא תמלא תפקיד קריטי.

החקירות של ההשפעות של הווריאציות על רגישות ה-pH של הפעילויות ועל מידת הקישור לממברנה יציבה על ידי החלבון שופכות אור על המנגנון שבאמצעותו ניתן לשפר את פעילות ה-K permease. ראשית, מלבד אישור הפעילות המוגברת של ה-K permease בתנאים אופטימליים, לא מצאנו הבדלים בצורות העקומות המראות השפעות ה-pH על שלבי חיבור הממברנה והזרימה של פעילות K permease או של השפעת ה-pH על פעילות Cl permease הכוללת. יתרה מכך, לא היו הבדלים בדרישה ל-pH מוגבר של פנים השלפוחיות או בדרישה לנוכחות של קטיון דו ערכי בתגובה לפעילות K permease בין כל האיזופורמים. לפיכך לא מצאנו עדות להבדלים בתכונות הפנימיות של הערוץ עצמו. לעומת זאת, הווריאציות הראו קשר יציב מוגבר באופן מובהק עם שלפוחית ​​פוספוליפידים בתנאים התומכים בפעילות Kpermease, כאשר קנה המידה של אפקט זה הוא בערך אותו טווח כמו חוסר פעילות השינוי. ביחד, הנתונים מצביעים על כך שהבסיס לפעילות המוגברת של K permease הוא פשוט החדרת ממברנה יעילה יותר בתנאים התומכים בפעילות, ללא צורך להפעיל שינוי מהותי בתכונות החלבון המוחדר.

שלושה תחומים זוהו במבנה ApoL1(6). מעריכים שפעילות תעלת היונים נמצאת בתחום "יוצר הנקבוביות" ההומולוגי קוליצין, התופס כ-60 אחוז מהחלבון בקצה ה-N שלו. וריאציות הרצף הקשורות למחלה אינן בתחום יצירת הנקבוביות אלא נמצאות במרחק ממנו בתחום סליל מפותל, המהווה כ-16 אחוז מהחלבון בקצה C. למחיקה של תחום זה אין השפעה על הפעילות הטריפנוליטית, אך היא נשמרת מאוד בקרב איזופורמים של אפול הן בתוך המינים והן בין המינים (10). הוצע כי אזור זה מתפקד כתחום מבוקר (10), והנתונים שלנו מצביעים על כך שמוטנטים גורמי מחלות בתחום זה אכן מגבירים את קשירת הממברנה בתנאים התומכים בפעילות ערוצי קטיון ופעילות מוגברת של ערוץ קטיון. פרשנות אחת היא שהתחום C-terminal משמש לדיכוי החיבור/החדרה של הממברנה הנחוצה לפעילות פרמיאז קטיון, ומוטציה של תחום זה מרגיעה דיכוי זה.

Cistanche יכול לטפלכִּליָהמַחֲלָה

לתצפיות על קשירת ממברנה יש השלכות נוספות ומאירות כמה היבטים של הקשר בין פעילויות חדירה של אניונים וקטונים. אנו מוצאים כאן שהרבה יותר חלבון קשור לממברנות בתנאי פעילות אופטימליים של אניון פרמיאז (pH 5.0) מאשר בתנאי קשירה אופטימליים התומכים בפעילות פרמיאז קטיון (pH 6.0), וזה נכון לגבי כל איזופורמים (איור 5). שים לב להבדל ברגישות ה-pH של פעילות האניון פרמיאז (איור 2D) ובשלב הקישור לממברנה של פעילות הקטיון-פרמיאז (איור 4C): פרמיז האניונים עולה באופן דרמטי מתחת ל-pH 6, בעוד יכולת החלבון המוכנסת לממברנה לתמוך בקטיון. לחלחל פעילות יורדת באופן משמעותי. הנתונים שדווחו בעבר הראו שהקשר הממברנה היציבה של G0 עולה באופן משמעותי ככל שה-pH יורד מאותו טווח pH, וזה הטווח שבו הקרינה הפנימית של חלבון מדוכאת בצורה הדרמטית ביותר (9), מה שמצביע על מעבר משמעותי במבנה החלבון. . בסיכומו של דבר, הנתונים מצביעים על כך שהחדרת ממברנה ב-pH 6.0 שונה מהותית מהחדרת ממברנה ב-pH 5.0. ב-pH 6.0, חלק קטן יותר מהחלבון מתחבר לממברנות, מלווה רק בשינוי מינורי בקרינה מהותית ובפעילות חדירת אניונים מוגבלת, אך עם היכולת לעבור לצורה חדירת קטיון כאשר תא ה-cis עובר טיטרציה ל-pH7 .5. יתר על כן, היעילות של קשירה זו גדולה יותר עבור וריאנטים הקשורים למחלה, במקביל לפעילות המוגברת של קטיונפרמז לאחר שינוי ה-pH. לעומת זאת, ב-pH 5.0 חלק גדול בהרבה מהחלבון קשור לממברנות; קישור זה מלווה בשינוי גדול בפלורסנטיות פנימית ובהופעה של פעילות אניונפרמיאז גדולה בהרבה. לא הקישור לממברנה ולא פעילות האניונפרמיאז שונה בין האיזופורמים. היכולת לחלבון המוכנס הזה לעבור לאישור חדירת קטיון ירדה מאוד. אנו משערים שהשינוי שדווח בעבר בקרינה פנימית כאשר ה-pH יורד מ-6 ל-5, משקף טרנספורמציה מבנית לצורה שאינה מסוגלת לעבור לקונפורמציה של קטיון פרמיזה, ולהבדלים בין האיזופורמים אין השפעה על תכונות חדירת יונים של קונפורמציה זו.

תצפית חדשה נוספת היא שיוני סידן ומגנזיום יעילים באותה מידה בתמיכה בפעילות ערוץ הקטיונים של ApoL1. זה מרמז מאוד על כך שתפקידו של קטיון דו ערכי אינו באמצעות קשירת זיקה גבוהה כלשהי על ידי החלבון, אלא סביר יותר להשפעה פחות ספציפית של גישור מטען המאפשרת לחלבון בעל מטען שלילי לקיים אינטראקציה עם פני השטח הטעונים שלילי של קרומי הפוספוליפידים.

מחקרים אחרים שמעריכים את ההבדלים בפעילות תעלות היונים של איזופורמים ApoL1 פורסמו. תומפסון ופינקלשטיין (8) השתמשו בשיטות אלקטרו-פיזיולוגיות עם טכניקות דו-שכבות שומניות מישוריות כדי להעריך את פעילות הערוץ של ApoL1 רקומביננטי מטוהר, ולא דיווחו על הבדלים במאפייני התעלה בין האיזופורמים. חשוב לציין כי שיטות דו-שכבתיות מישוריות של שומנים ומבחני זרימה מבוססי שלפוחית, בעוד שניהם מבחני ערוצים, מניבים סוגים שונים של מידע וניתן לחשוב עליהם כעל מערכות ניסוי משלימות. שיטות דו-שכבתיות של שומנים הן גישה שאין דומה לה להגדרת מאפיינים חד-ערוציים של חלבון מטוהר, אך הן כלים פחות חזקים לכימות פעילות ספציפית, בעוד מבחני פליטת שלפוחית ​​יכולים לספק נתונים כמותיים על פעילותה של אוכלוסייה, אך מידע מועט על מאפיינים חד-ערוציים. לפיכך, התצפיות של תומפ סון ופינקלשטיין אינן עולות בקנה אחד עם התצפיות שלנו, שגם הן אינן מראות הבדלים ניכרים במאפיינים הפנימיים של הערוץ, אלא רק הבדל בפעילות ספציפית של כפול, סולם של הבדל שיהיה די קשה לביצוע. לזהות במערכות דו-שכבות שומניות.

חקירות תוך שימוש בחלבון וליפידים מטוהרים יש בסגולה לחשוף תכונות הנובעות בבירור מהחלבון עצמו ואינן משתנות על ידי רכיבים אחרים, קינטיקה של ביטוי או סחר בממברנות שפוגעות במערכות מורכבות יותר. עם זאת, הם בהכרח שותקים לגבי ההשפעה הסופית שיש לפעילויות אלו על תאים חיים. דווח על מחקרים המשתמשים במערכות ביטוי מבוססות תאים כדי להתגרות בפעילות תעלת יונים של ApoL1 (נסקרו ב-Friedman and Pollak, 2019 (3)). Olabisi וחב'(11) הביעו איזופורמים ApoL1 בתאי HEK והעריכו ריכוז אשלגן תוך תאי במצב יציב. הם מצאו אשלגן תוך תאי נמוך יותר בתאים המבטאים G1 ו-G2 בהשוואה לתאים המבטאים G0. בעוד שהתצפית הזו יכולה להיות עקבית עם חדירות K מוגברת של פלזמה-ממברנה, ה-K התוך-תאי התחתון יכול להיות גם תוצאה לא ספציפית של ההשפעה הציטוטוקסית הגדולה יותר של הגרסה בכל מנגנון, מה שמוביל לפעילות פחות פעילה של NaK ATPase ו/או פירוק של שלמות הממברנה הפלזמה. אוטול וחב'. (12) כייל בקפידה את רמות הביטוי בתאי HEK והעריך את המראה של פעילות תעלות קטיון של קרום פלזמה, ומצא הבדלים בין האיזופורמים. שאה וחב'. (13) דיווחו על מיקוד של ApoL1 למיטוכונדריה שבה הווריאציות הקשורות למחלה גרמו לפתיחה של נקבובית המעבר לחדירת המיטוכונדריה, בהתאם לראיות עדכניות לציטוטוקסיות של טריפנוזום. לא ברור אם השפעה זו מצריכה פעילות תעלת יונים של ApoL1. עם כל אחד מהמחקרים הללו, בשל המורכבות של מערכות ביטוי מבוססות תאים, לא ניתן להיות בטוח אם הבדלים כלשהם שצוינו נובעים מתכונות פנימיות של החלבון או ממרכיבים אחרים המקיימים אינטראקציה בתאים הנוכחיים.

מוטציות פתוגניות של רווח בתפקוד מראות בדרך כלל דפוס תורשה דומיננטי, בעוד שפנוטיפ של מחלת כליותהקשור לגרסאות ApoL1 הוא רצסיבי. מנגנון אחד שבאמצעותו מוטציית רווח בתפקוד עלולה לשלול הוא אם החלבון מתפקד כהומולטימר, וה-WT יכול להפעיל השפעה דומיננטית-שלילית על המשתנה המופעל. האם ApoL1 מתפקד כערוץ כמונומר מולטימר אינו ידוע כרגע.

הנתונים שלנו מצביעים על כך שחדירות קטיון מוגברת ברמות דומות של ביטוי חלבון עשויה לתרום לטוציטוטוקסיות בפודוציטים או בתאים אחרים. עם זאת, זה עשוי להיראות לא סביר שגידול של פי שניים בלבד בפעילות יכול להפוך מולקולה שפירה לכאורה למחלת נהיגה אחת. אף על פי כן, המחלות הקשורות לגרסאות ApoL1 נוטות להתקדם לאט, ולהבדלים עדינים לאורך זמן ממושך (חודשים עד שנים) עשויות להיות השפעה מצטברת גדולה. מנגנונים פוטנציאליים אחרים של ApoL1action אחראיםכִּליָהפציעההוצעו ונתמכים בראיות (3-5, 11-16), כולל השפעות על אפופטוזיס, אוטופגיה, תפקוד מיטוכונדריאלי, סחר תוך-תאי, והשפעות מתווך של מולקולות איתות חוץ-תאיות, בין היתר. החשיבות היחסית של ההבדלים בפעילות ערוץ ApoL1 המתוארת כאן לעומת מנגנוני פעולה פוטנציאליים אחרים במחלות נהיגה נותרה לא ברורה.

Cistanche יכול לטפלכִּליָהמַחֲלָה

נהלים ניסיוניים

בניית ביטוי

תוארו בעבר (9) בקידוד pET-ApoWT המקודד ל-N-טרמינל 6His ו-T7 עם תגיות אפיטופ ApoL1 (גרסת G0). החלבון המקודד זהה לזה של Genbank accession#BC143038 (הפלוטיפ 150K, 228I, 255K) מחומצת אמינו 28 עד 398, ביטול רצף האותות בחומצות אמינו 1-27 ובתוספת של N-טרמינלי {{ 17}}התגים שלו ו-T7 מקודדים על ידי הפלסמיד pET28a. פלסמידים המקודדים לגרסאות G1 ו-G2 נוצרו מ-pET-ApoWT על ידי החלפה של מקטע ההגבלה AleI ל-XhoI עם פרגמנטים המכילים את רצפי הווריאציות, שסונתזו על ידי Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, וזהות הפלסמידים שנוצרו מאושרת על ידי רצף ישיר. שלושת המבנים היו זהים למעט תחליפי חומצות אמינו S342G ו-I384M באיזופורם G1 ומחיקת N388-Y389 באיזופורם G2. ApoL1isoforms רקומביננטיים באו לידי ביטוי בחיידקים וטיהרו כמתואר(8) למעט שחוצץ העמודה S200 הכיל 0.03 אחוז n dodecyl- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma). עבור כל קבוצות הניסויים שהשוו בין איזופורמים, החומרים הוכנו מראש באותו זמן בתנאים זהים תוך שימוש באותם ריאגנטים. ריכוז החלבון נקבע עם ערכת בדיקת חלבון BCA (Thermo Fisher Scientific) תוך שימוש בתקן bovineserum albumin. עבור חלבון כולל כמו באיור 1, ג'לים נצבעו ב-Instant Blue (Expedeon Inc). חלבון ב-S200buffer הוקפא במהירות בחנקן נוזלי ואוחסן ב-80 C. מנות הופרשו על קרח ודוללו במאגר S200 לפני מבחני.

יונופורים

Valinomycin (Millipore Sigma) הומס ב-50 mM אתנול לא מוחלט ומדולל ל-1 mM באתנול מוחלט מיד לפני השימוש. כלוריד יונופור 1 (MilliporeSigma) הומס ב-100 מ"מ בהקסנול 1- ומדולל ל-0.2 מ"מ באתנול מוחלט מיד לפני השימוש.

שלפוחית ​​ממברנה

אסולקטין (פולי סויה פוספטידילכולין סוג II, סיגמא) מופק באצטון כמתואר (30), מיובש, ולאחר מכן מומס בכלורופורם ומאוחסן ב-20 C. מנה של פוספוליפידים בכלורופורם יובשה תחת זרם חנקן והוחלף. ב-20 מ"ג/מ"ל ב-200 מ"מ KCl, 5 מ"מ HEPES pH8.0 על ידי חמישה מחזורי הקפאה-הפשרה ומערבולת נמרצת. התרחיף הזה אוחסן ב-20 מעלות. כדי ליצור שלפוחיות חד-למליות עמוסות KCl בקוטר של כ-200 ננומטר, השעיית הליפיד הועברה 15 פעמים דרך מסנן קרום פוליקרבונט 200 ננומטר באמצעות תא אקסטרודר (Avanti Polar Lipids) והפרוטוקול שסופק על ידי היצרן (17, 18). שלפוחיות שחולצו נשמרו על קרח והשתמשו בהן תוך 24 שעות.

מבחני פעילות

מבחני פעילות של יון permease באמצעות זרימת KCl מונעת על ידי פוטנציאל ממברנה שזוהה עם אלקטרודה סלקטיבית כלוריד בוצעו כמתואר קודם לכן (9). מוסיפים עשרים מיקרוליטר של ApoL1 במאגר S200 (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8.3, 0.3 אחוז DDM) עד 380 ul תערובת תגובה המורכבת מ-82 mM KCl, 127 mM סוכרוז, 42.1 mM חיץ ב-pH המצוין (MES עבור pH 5-6.5, HEPES עבור pH 7.0-8.0), 2.63 mMCa (gluconate)2 ו-1.84 mg/ml extruded. שלפוחיות. התערובת מודגרת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות לפני מעבר דרך עמודת ספין של 3 מ"ל Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) מאוזנת ב-330 מ"מ סוכרוז. האלואט מתווסף מיידית ל-2 מ"ל של 330 מ"מ סוכרוז, 10-5 M KCl, 2.5 מ"מ Ca(gluconate)2 ו-10 מ"מ חיץ (MES עבור pH 5-6.5; HEPES עבור pH 7-8) כפי שצוין, עם ניטור רציף עם אלקטרודה סלקטיבית כלוריד ותועד כמתואר. לאחר 20 שניות, זרימה מונעת מתח הופעלה על ידי הוספת יונופור (2.5 ul של 1 mM valinomycin או 0.2 mMCloride Ionophore 1 באתנול) והותרה להמשיך במשך 30 שניות ואחריו הוספה של Triton X-100 ל-0.1 אחוז לשחרור כלוריד תוך שלפוחית ​​הנותרים. נתונים גולמיים ב-mV הומרו לריכוז Cl באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה עבור האלקטרודה בתנאי הבדיקה. שיעורי חלקים ראשוניים של שחרור כלוריד נגזרו מ-3 שניות במהלך התגובה המיידית המקסימלית להוספת יונופור.

כל השוואות הפעילות בוצעו באמצעות חומרים מהכנות בו-זמנית של שלושת האיזופורמים שדוללו ל-100 ug/ml חלבון במאגר S200 לפני הבדיקה. כל המבחנים ששימשו להשוואה ישירה בין הגרסאות בוצעו באותו יום תוך שימוש באותם ריאגנטים טריים שהוכנו.

בדיקת שיוך ממברנה

מבחני קשרי ממברנה בוצעו בנפרד בתנאים אופטימליים עבור פעילות Cl permease ועבור פעילות K permease. לתנאים התומכים בפעילות Clpermease, 5 ul של 100 ug/ml חלבון ב-1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0.03 אחוז DDM נוספו ל-95 ul של תערובת תגובה (3.4 מ"ג/מ"ל שלפוחית ​​איזולקטין (עמוסות ב-200 מ"מ KCl, 5 מ"מ HEPES pH 8), 20 מ"מ MES pH 5.0, 2.5 מ"ל Ca(גלוקונט) 2, 100 מ"מ KCl, 100 מ"מ סוכרוז) והודגר בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. היחס בין חלבון לשומנים בניסוי הוא 1:680 מסה/מסה. הדגימה דוללה ללא pHshift על ידי הוספת 200 ul של 60 mM MES pH 5.0, 2.5 mMCa(gluconate)2, 100 mM KCl, 100 mM סוכרוז והודגרה למשך 20 שניות. מאה מיקרוליטר של 8 M אוריאה נוספו, ערבבו, ולאחר מכן הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ריכוז הסוכרוז הובא ל-40 אחוז על ידי הוספת 1.6 מ"ל של 50 אחוז סוכרוז. הדגימה של 2 מ"ל הייתה שכבה מתחת ל-1 mlof 30% סוכרוז ב-8 mM MES pH 5.0, אשר בתורו היה מתחת ל-1.7 ml של 8 mM MES pH 5.0 ללא סוכרוז. השיפועים התלולים עברו צנטריפוגה ב-200,000g ברוטור של Beckman Coulter TLA-110 למשך 90 דקות ב-4 C. השלפוחיות נאספו מהממשק של 0 עד 30 אחוז סוכרוז. חלקים שווים של דגימות דוללו פי 4 ועברו צנטריפוגה ב-100,000g למשך שעה אחת. כדורי הממברנה יובשו, הופרדו על ידי SDS-PAGE, נסגרו לפוליווינילידן פלואוריד קרום, ונבדקו על ידי westernblotting עם נוגדן לאפיטופ T7 (MilliporeSigmaproduct מס' 69522-3) עם זיהוי כימילומינסצנציה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית. דילולים סדרתיים של חלבון מטוהר נכללו על הג'ל כדי ליצור איזוטיפ ועקומה סטנדרטית ספציפית לכל חלבון.

לתנאים התומכים בפעילות K permease, נוספו 5 ul של 100ug/ml חלבון ב-10 mM Tris pH 8.2, 150 mM NaCl, 0.03 אחוז DDM ל-95 ul של תערובת תגובה (3.4 ug/ml isolectinvesicles (טעון ב-200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6.0, 2.5 mM Ca(gluconate)2, 100 mM KCl, 100 mM סוכרוז) והודגר בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה הדגימה דוללה עם שינוי pH ל-7.5 על ידי הוספה של 200 ul של 60 mM HEPES pH 8.0, 2.5 mM Ca(gluconate) 2,100 mM KCl, 100 mM סוכרוז והודגרה למשך 20 שניות. מאה מיקרוליטר של 500 מ"מ של Na2CO3 נוספו והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ריכוז הסוכרוז הועלה ל-40 אחוז על ידי תוספת של 1.6 מ"ל של 50 אחוז סוכרוז. הדגימה של 2 מ"ל הייתה שכבה מתחת ל-1 מ"ל של 30 אחוז סוכרוז ב-8 מ"מ Tris pH 8.3, אשר בתורו היה מתחת ל-1.7 מ"ל של 8 מ"ל Tris ללא סוכרוז pH 8.3. כריות סוכרוז בוצעו בצנטריפוגה ודגימה נאספה ועובדה כאמור לעיל.

סטָטִיסטִיקָה

המשמעות של הבדלים בין זוגות של אמצעים בתוך מערכי נתונים נקבעה באמצעות ניתוח שונות (ANOVA)(19). פרמטרים סטטיסטיים נקבעו באמצעות פונקציה המוטמעת באקסל. ערכי P חושבו באמצעות socscistatistics.com. כל נקודות הנתונים מוצגות כממוצע ± סטיית התקן (SD), שנקבעת עם הפונקציה STDEV.S של Excel עבור כל קבוצת העתקים בודדים.

זמינות נתונים כל הנתונים התומכים במאמר זה ישותפו לפי בקשה לד"ר ג'ון סי אדוארדס, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche יכול לטפלכִּליָהמַחֲלָה

תודות- אנו מודים לחטיבה לנפרולוגיה ולמחלקה לרפואה פנימית של אוניברסיטת סנט לואיס על התמיכה החיונית לביצוע עבודה זו.

תרומות מחבר-JCE הגה ופיקח על המחקר, הבטיח מימון, ביצע את מבחני השטף, פירש נתונים וכתב את המאמר; JB טיהר את החלבונים, ביצע את מבחני חיבור הממברנה, פירש נתונים, הכין את הדמויות וערך את המאמר.

מימון ומידע נוסףהעבודה מומנה על ידי משאבים מוסדיים של אוניברסיטת סנט לואיס ועל ידי NationalInstitutes of Health מענק R01 DK120651 ל-JCE התוכן של מאמר זה הוא באחריות הכותבים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

ניגוד עניינים-הכותבים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים עם התוכן של מאמר זה.

קיצורי מילים-הקיצורים שבהם נעשה שימוש הם: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, יונופור כלוריד 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltoside;PVDF, polyvinylidene fluoride; SD, סטיית תקן; ואל, ולינומיצין.

מ: 'כִּליָה-מַחֲלָה-גרסאות הקשורות של Apolipoprotein L1 מראות עלייה בתפקוד בפעילות ערוץ הקטיונים' על ידיג'ונתן ברונו וג'ון סי אדוארדס

---J. ביול. Chem. (2021) 296 100238

הפניות

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) איגוד של גרסאות טריפנוליטיות ApoL1 עםכִּליָהמַחֲלָהבאפרו אמריקאים. מדע 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) גרסאות סיכון APOL1, גזע והתקדמות של כרוניכִּליָהמַחֲלָה. N. Engl. J. Med. 369, 2183–2196
3. פרידמן, DJ, ו-Pollak, MR (2020) APOL1 וכִּליָהמַחֲלָה: מגנטיקה לביולוגיה. אננו. כומר פיזיול. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF, and Sedor, JR (2017) זיהוי התפקוד התוך תאי של APOL1. ריבה. Soc. נפרול. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H., and Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. דעה. נפרול. יתר לחץ דם. 27, 153–158
6. פרז-מורגה, ד', ואנהולבקה, ב', פאטוריו-הנוק, פ., נולאן, ד"ר, לינס, ל., הומבל, פ., ואנהאם, ל., טבאבי, פ., Pays, א. Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., and Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI מקדם תמוגה של טריפנוזום על ידי יצירת נקבוביות בממברנות ליזוזומליות. מדע 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S., and Hajduk, SL (2009) חדירות ממברנה על ידי גורם ליטי טריפנוזום, ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה של אדם ציטוליטי. ג'יי ביול. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R., ו-Finkelstein, A. (2015) גורם טריפנוליטי אנושי APOL1 יוצר תעלות סלקטיביות של קטונים עם pH-gated ב-pH-gated cation-slectives in bilayers lipid planar: Relevance to lysis trypanosome. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., and Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 מעניק חדירות יונים ניתנים להחלפה של pH לשלפוחית ​​פוספוליפידים. ג'יי ביול. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., and Pays, E. (2006) The function of apolipoproteins L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ, ו-Pollak, MR (2016) APOL1כִּליָהמַחֲלָהגרסאות סיכון גורמות לציטוטוקסיות על ידי דלדול אשלגן תאי והשראת
קינאזות חלבון המופעלות על ידי מתח. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA ו-Sedor, JR (2018) ביטוי יתר של ApoL1 מניע ציטוטוקסיות בלתי תלויה בווריאציות. ריבה. Soc. נפרול. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR, and Friedman, DJ (2019) APOL1כִּליָהגרסאות סיכון מעוררות מוות של תאים באמצעות טרנסלוקציה מיטוכונדריאלית ופתיחת נקבובית המעבר של חדירות המיטוכונדריה. ריבה. Soc. נפרול. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) קומפלקס משולש של גרסאות סיכון suPAR, APOL1 ואינטגרין אלפאבטא3 על פודוציטים מתווך כרוניכִּליָה מַחֲלָה. נאט. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) וריאנטים בסיכון כליות של APOL1 מעוררים תפקוד לקוי של המיטוכונדריה. ריבה. Soc. נפרול. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., and Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, Apolipoprotein L1, a new Bcl-2 domain homology {{4} }}רק חלבון קושר שומנים, גורם למוות של תאים אוטופגי. ג'יי ביול. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G., and Cullis, PR (1985) ייצור שלפוחיות חד-לאמלריות גדולות על ידי הליך שחול מהיר: אפיון חלוקת הגודל, נפח לכוד ויכולת לשמור על פוטנציאל ממברנה. ביוכים. ביופיס. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, and Papahadjopoulos, D. (1979) הכנת ליפוזומים של חלוקת גודל מוגדרת על ידי שחול דרך ממברנות פוליקרבונט. ביוכים. ביופיס. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, אוקספורד, בריטניה