קמפפרול מגן מפני קרדיומיופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין בחולדות על ידי השפעה היפוגליקמית וסילוף SIRT1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

מחקר זה בדק אם קאמפרול יכול להחליש אתחמצוני, נזק דלקתי ופיברוטי של החדרים השמאליים (LVs) בחולדות סטרפטוזוטוצין (STZ) סוכרתיות על ידי אפנון איתות של מידע מסוג הזדווגות שקט 2 homolog 1 (SIRT1). חולדות זכרים בוגרים חולקו ל-5 קבוצות (n=12/כל אחת) כביקורת, בקרה פלוס קאמפרול, סוכרת הנגרמת על ידי STZ (STZ-DM), STZ-DM בתוספת קמפפרול ו-STZ-DM בתוספת קמפפרול פלוס EX -527, מעכב sirtuin 1 (SIRT1). מתן קאמפרול לחולדות סוכרתיות שימר באופן משמעותי את התפקודים הסיסטוליים והדיאסטוליים של ה-LVs שהיו קשורים להפחתה משמעותית בתצהיר קולגן בחדר, חדירתתאים דלקתיים, וביטוי חלבון של חלבון X הקשור ל-Bcl2-(Bax), קספאז מפוצל-3 וציטוכרום-C. הן בחולדות הביקורת והן בחולדות הסוכרתיות, קאמפרול הפחית את הירידה במשקל הגוף, והפחית את הצוםרמות הגלוקוז, ועלייה ברמות האינסולין בצום ו-HOMA-b. חוץ מזה, קאמפרול הוריד את הרמות של מיני חמצן תגובתיים (ROS),מלונדאלדהיד(MDA), גורם נמק הגידול-a (TNF-a) ואינטרלוקין-6 (IL-6), הורידו את גורם הגדילה המשתנה-b1 (TGF-b1), והפחיתו את הרמות הגרעיניות של NF-kB p65. במקביל, קאמפרול העלה את רמות ה-LV של מנגן סופראוקסיד דיסמוטאז (MnSOD) וגלוטתיון (GSH) ועורר את רמות החלבון הכוללות של Bcl2, הפעילות הגרעינית של SIRT1 ורמות גרעיניות של גורם גרעיני אריתרואיד 2-קשור לגורם 2 (Nrf2). אירועים אלו היו קשורים עם פעילות מוגברת של deacetylase ורמות כוללות של SIRT1 וירידה מקבילה באצטילציה של Nrf2, NF-kB, smad2 ו-FOXO1. לסיכום: קאמפרול מחליש קרדיומיופתיה סוכרתית בחולדות שטופלו ב-STZ באמצעות השפעותיו ההיפוגליקמיות ושחרור האינסולין, כמו גם מנגנון לבבי בלתי תלוי הכולל הפעלה של SIRT1.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

קרדיומיופתיה סוכרתית (DC), המזוהה על ידי חריגות במבנה ותפקוד הלב בהיעדר גורמי סיכון או הפרעות אחרות, היא הגורם העיקרי לאי ספיקת לב (HF) ולתמותה מוגברת בקרב חולי סוכרת (1). שיעורי השכיחות האחרונים של DC מדאיגים ונעים בין 19 ל-26 אחוזים ברחבי העולם (2). עם זאת, הביטוי הקליני העיקרי של DC באנשים הפגועים כולל היפרטרופיה לקויה של חדר שמאל (LV), שיפוץ לרעה ופגיעה בתפקודים דיאסטוליים וסיסטוליים מאוחרים (2). היפרגליקמיה נותרה הגורם העיקרי האחראי להתפתחות DC באמצעות הפעלת מספר מסלולים מחוברים הגורמים ללחץ חמצוני,

דלקת, פיברוזיס, ואפופטוזיס, סימני ההיכר העיקריים של המחלה (2-4). מסלולים אלה כוללים פגיעה בזרחן החמצוני המיטוכונדריאלי ובטיפול ב-Ca2 פלוס, הפעלה של מערכת הרנין-אנגיוטנסין המקומית, חילוף חומרים ומסלולי איתות לבביים, ייצור יתר של ROS, נוגדי חמצון מופחתים בצורה חריגה ושינוי בפעילות של מספר גורמי שעתוק ({{3} }). נכון לעכשיו, ידוע היטב שהפעלה של מספר מסלולי יצירת ROS, דיכוי של גורם גרעיני אריתרואיד 2-קשור לגורם 2 (Nrf2), גורם שעתוק נוגד חמצון ראשי, הפעלה של הגורם הגרעיני kappaB (NF-kB) , ושיפור של גורמי הגדילה המשתנים-b1 (TGF-b1)/smad2/3), כמו גם הפעלת אפופטוזיס התא הפנימי (מתווכת מיטוכונדריה) הם מנגנונים מולקולריים הקשורים עיקריים האחראים ל-DC המושרה על ידי היפרגליקמיה בבעלי חיים וגם בני אדם (2, 7-11).

לכן, שליטה בהיפרגליקמיה ו/או דיכוי המסלולים המזיקים הללו נותרה האסטרטגיה המקובלת ביותר למנוע/להקל על DC. Sirtuins, משפחה של חלבוני איתות תאיים, הוכרו כמווסת חשוב של הומאוסטזיס תאי בתגובה לגירויים מלחיצים (12). בין כל האיזופורמים, SIRT1 (Silent Mating Information Regulation 2 homolog 1), דיאצטילאז תלוי ניקוטינמיד אדנין (NAD plus )- תלוי מאוד בלב היונקים וממלא תפקיד מכריע בהתפתחות הלב והגנה עליו (13). התפקיד המגן של SIRT1 הוכח במבחנה וב-in vivo, במספר מודלים של בעלי חיים כגון איסכמיה, איסכמיה/פרפוזיה חוזרת (I/R), אוטם שריר הלב ו-HF (12-15). SIRT1 גם הגן מפני התפתחות והתקדמות של DC ו-HF שלאחר מכן, כאשר רמות הלב שלו דווחו כחסרות משמעותית במצבים אלה (16-20). בהתאם לכך, מספר מחקרים הראו שהפעלה מהונדסת או תרופתית של SIRT1 לא רק שימרה את תפקוד הלב, אלא גם מנעה מתח חמצוני לבבי שנגרם על ידי היפרגליקמיה, דלקת, אפופטוזיס ופיברוזיס בלב סוכרת (17, 20, 21). בסך הכל, מחקרים אלו הגיעו למסקנה כי ההשפעה המגנה של SIRT1 מיוחסת ליכולתו לדה-אצטילציה של מספר מתווכים וגורמי שעתוק, כולל Nrf2, Sch66, NF-kB RelA/p65, FOXO3, p53, PGC-1a, ו smad2/3 (12, 17, 18, 20, 22-26). נכון לעכשיו, הפוטנציאל להגן על הלב של כמה טבעיפלבנואידיםהמתווך על ידי upregulation/הפעלה של SIRT1 הוכח בספרות וקיבל תשומת לב רבה (17, 21, 27). Kaempferol, הוא פלבנואיד עיקרי שנמצא בשפע בירקות ובעל פוטנציאל טיפולי קליני מאושר רבים נגד הפרעות דלקתיות, כבד, כליות וקרדיווסקולריות (21). הפוטנציאלים הטיפוליים שמעניק קאמפרול מגוונים וכוללים השפעות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות, אנטי פיברוטיות ואנטי אפופטוטיות (21). במסגרת ראייה זו, מספר מחברים הראו יכולת חזקה של קאמפרול להפחית ROS וציטוקינים דלקתיים, לעכב NF-kB ו-TGF-b1 ולעורר את ציר Nrf-2/נוגד חמצון בתנאים שונים (25, {{15 }}). לצד המיטה, קאמפרול תואר כתרופה אנטי-סוכרתית שיכולה להחליש אנטי-היפרגליקמיה ולעורר הפרשת אינסולין (32-34). בנוגע להגנת הלב שלו, קאמפרול שימר את תפקוד הלב ושלמות המיטוכונדריה ודיכא דלקת, פיברוזיס ואפופטוזיס במגוון מודלים של בעלי חיים של נזק לבבי כולל פגיעת I/R, HF המושרה דוקסורוביצין (DOX)/ANG II ו-DC (29 , 35-37). במחקר אלגנטי מאוד שנערך לאחרונה, קאמפרול מנע מוות פנימי של תאים המושרה על ידי גלוקוז גבוה (HG)/היפרגליקמיה בתאי H9c2 ובלבם של חולדות שטופלו בסטרפטוזוטוצין (STZ) על ידי דיכוי ייצור הציטוקינים הדלקתי והפעלה של NF-kB ו-TGF -b1, כמו גם גירוי Nrf2 (31). במחקר האחרון שלנו, הראינו את יכולתו של קאמפרול להגן מפני נפרופתיה הנגרמת על ידי STZ על ידי ניקוי ROS, וויסות עלייה של נוגדי חמצון, הפעלת Nrf2 ודיכוי NF-kB (36). עם זאת, למרות השפעותיו נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות המדווחות היטב, המנגנון המולקולרי המדויק מאחורי ההשפעה המגנה על הלב של קאמפרול בחולדות סוכרתיות נותר לא ברור. מעניין, קאמפרול החליש אנוקסיה/נזק קרדיומיוציטים שנגרם כתוצאה מחמצן מחדש; I/R- הנזק עצבי וריאות, קדמיום כלוריד (CdCl2) - הנזק בהיפוקמפוס המושרה, ומי חמצן (H2O2) - הנגרם נזק לרשתית על ידי הפעלה של SIRT1 (36, 38-42). לכן, במחקר זה, ובהינתן עדויות אלה, שיערנו שמתן כרוני של קמפפרול שימר את תפקוד הלב ומעכב עקה חמצונית, דלקת, פיברוזיס ואפופטוזיס במודל חולדה של DC המושרה על ידי STZ על ידי הפעלה של SIRT1. חוץ מזה, בדקנו השערה זו על ידי ניהול משותף של EX527, מעכב SIRT1 סלקטיבי.

חומרים ושיטות

הצהרה אתית כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה האתית לבעלי חיים ב-KKU העוקבת אחר התקנות וההנחיות שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. בעלי חיים סך של 60 חולדות Wistar זכרים בוגרים (150 ± 5 גרם/7 שבועות) סופקו מבית החיות במכללה למדעים באוניברסיטת King Khalid (KKU), Abha, ערב הסעודית, ונשמר שם במהלך הליך הניסוי. כל החולדות שוכנו בכלובי פלסטיק כ-4 חולדות/כלוב ותמיד הייתה לה גישה חופשית למזון ולמי השתייה הרגילים שלהם. תנאי החיים היו 21 ± 1 מעלות, 60 אחוזי לחות ומחזור חושך/אור של 12/12 שעות. אינדוקציה של סוכרת (DM) DM הושרה בחולדות שנבחרו כפי שתוארו על ידי אחרים (43, 44). בקצרה, כל חולדה צמה במשך 12 שעות ולאחר מכן הוזרק ל-IP עם STZ (Ab142155, Abcam, בריטניה, קיימברידג') שהוכן ב-0.1 M חיץ ציטראט (65 מ"ג/ק"ג/ pH 4.5). במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר הטיפול ב-STZ, כל החולדות קיבלו תמיסה של 5 אחוז גלוקוז כדי למנוע היפוגליקמיה פתאומית. ביום 3, רמות הגלוקוז בדם נמדדו באמצעות הערכה שסופקה (Cat. No. 10009582, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, ארה"ב) ואותן חולדות עם גלוקוז בדם גבוה מ-300 מ"ג/ק"ג נכללו במחקר ונחשבו לסוכרתיים . תכנון ניסוי חולדות חולקו ל-5 קבוצות (n=12/כל אחת) בתור 1) קבוצת ביקורת: חולדות לא סוכרתיות וקיבלו רק 0.1 אחוז תמיסת DMSO, דרך הפה, ככלייל; 2) קבוצה שטופלה בביקורת פלוס קאמפרול: היו חולדות ללא סוכרת וקיבלו מנה יומית פומית של קמפפרול (הוכן ב-0.1 אחוז DMSO) (קטגוריה מס' K0133, Sigma Aldrich, St Louis, MO, ארה"ב) (50 מ"ג) /ק"ג); 3) קבוצת מודל סוכרת הנגרמת על ידי STZ (STZ-DM): היו חולדות סוכרתיות שקיבלו רק מינון יומי פומי של 0.1 אחוז DMSO; 4) STZ-DM בתוספת קאמפרול: היו חולדות סוכרתיות שקיבלו מינון פומי יומי של תמיסת קאמפרול (50 מ"ג/ק"ג), ו-5) קבוצה שטופלה ב-STZ-DM בתוספת קמפרול פלוס-527-EX: שטופלו EX{ {48}}, מעכב SIRT1 סלקטיבי במינון סופי של 5 מ"ג/ק"ג (ip פעמיים בשבוע). כל הטיפולים נערכו במשך 8 שבועות, תקופה שהוכחה כמעוררת DC במכרסמים (31). המינון של קאמפרול נבחר על סמך המחקרים הקודמים שהראו מספר השפעות הגנה בריכוז והשפעה מעוררת על SIRT1 (38, 40). המינון in vivo של EX-527 נבחר למחקר של Eid et al. (45) שהראו שריכוז כזה יכול לעכב את SIRT1 לבבי בצורה מקסימלית ללא כל השפעות שליליות (45). מדידת המודינמיקה הלבבית מדידות הפרמטרים ההמודינמיים נערכו במשך שלושה ימים לאחר הטיפול האחרון. בקצרה, כל החולדות צמו במשך 12 שעות והורדמו עמוק עם תמיסה של 80/12 מ"ג/ק"ג קטמין הידרוכלוריד/קסילזין הידרוכלוריד (מספר קטגוריה K-113, Sigma Aldrich, St Louis, MO, ארה"ב). לאחר אישור ההרדמה, כל חולדה הונחה על שולחן חימום בשכיבה. הטמפרטורה נוטרה באמצעות בדיקה אנאלית. לאחר מכן, עור הצוואר נפתח ועורק הצוואר השמאלי הוקצה והשתחרר מהעצבים והרקמות שמסביב. צנתר מילאר מכויל לחץ (דגם מס' SPR 320) המחובר למערכת 16 ערוצים לאיסוף נתונים של Power Lab (דגם מס' 16/35, ADInstruments Pty Ltd., Bella Vista, NSW, אוסטרליה) הוחדר דרך עורק הצוואר לתוך עורק הצוואר. ה-LV של הלב. אות הלחץ LV נרשם במשך 20 דקות ונשמר. האות המאוחסן נותח לאחר מכן באמצעות תוכנת LabChart (גרסה 8, ADInstruments, Pty Ltd., Bella Vista, NSW, אוסטרליה) ונגזרו הפרמטרים הבאים: LVSP (לחץ סיסטולי LV) ו-LVEDP (לחץ קצה דיאסטולי LV). במהלך הניתוח, 5 הדקות הראשונות של ההקלטה לא נכללו ונחשבו לשלב ייצוב.

Cistanche לשיפור הזיכרון

מיד לאחר מדידת הפרמטרים ההמודינמיים, בית החזה נפתח ודגימות דם נאספו ישירות מהלב לתוך צינורות פשוטים אשר עברו צנטריפוגה ב-1200×g לאיסוף סרום. כל דגימות הסרום אוחסנו ב-20 מעלות לניתוח ביוכימי נוסף. לאחר מכן, הלבבות חולצו במהירות, נשקלו והונחו על קרח. ה-LV של כל לב הוסר ונחתך לחתיכות קטנות יותר. חלק מהחלקים הונחו בתמיסת פורמלין מאוחסנת של 10 אחוזים למשך 24 שעות ונשלחו לעיבוד היסטולוגי. רקמות אחרות של כל LV הוקפאו במהירות ואוחסנו ב-80 מעלות ושימשו מאוחר יותר לניתוח ביוכימי ומולקולרי. הכנת הומוגניות של רקמות ותמציות גרעיניות חלקים של LV קפוא הומוגגו ב-9 נפחים של מי מלח חיץ פוספט (PBS/pH=7.4) או 1X חיץ RIPA (Cat. No. 156034, Abcam, Cambridge, UK) בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל מעכב פרוטאז (קטגוריה מס' 78429, ThermoFisher Sci, Waltham, MA, ארה"ב). ההומוגנטים עברו צנטריפוגה ב-11000 × גרם (4 מעלות) כדי לאסוף את הסופרנטנטים אשר אוחסנו ב-80 מעלות ושימשו מאוחר יותר עבור הספיגה הביוכימית והמערבית, בהתאמה. כמו כן, חלקים מה-LVs הקפואים שימשו להכנת התמציות הגרעיניות והציטופלזמיות באמצעות ערכה זמינה מסחרית (Cat. No. 113474, Abcam, Cambridge, UK) לפי הוראות היצרן. הטוהר של החלקים הגרעיניים והציטופלסמיים נבדק על ידי סופג מערבי באמצעות VDAC ו-a-tubulin ונוגדנים, בהתאמה. רמות החלבון של כל חלקי התאים נמדדו באמצעות ערכת קביעת חלבון מבוססת ברדפורד (Cat. No. 23200; Thermo-Fisher Sci., Waltham, MA, USA). לפי הוראות היצרן. מדידה ביוכימית בסרום רמות גלוקוז בצום נמדדה באמצעות ערכת בדיקה (Cat No. 10009582 Cayman Chemicals Co., Ann Arbor, MI, ארה"ב). רמות האינסולין בסרום בצום נמדדו באמצעות ערכת ELISA (מספר קטגוריה ELR-Insulin-1; RayBiotech Inc., Peachtree Corners, GA, ארה"ב). תפקודם של תאי b-הלבלב האנדוקריניים נמדד על ידי אינדקס HOMA-b כפי שחושב על ידי הנוסחה הבאה: [אינסולין בצום (ng/mL) × 20]/[גלוקוז בצום (mg/dL) – 3.5] (46) . רמות הסרום של קריאטינין קינאז-MB (CKMB) נמדדו על ידי ערכות ELISA (מספר קטגוריה MBS2515061 ומספר קטגוריה, MyBioSource, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב, בהתאמה). רמות הטרופונין-I בסרום נמדדו על ידי ELISA (Ab246529, Abcam, Cambridge UK). מדידה ביוכימית בהומוגניות של חדרים שמאליים רמות כוללות של גלוטתיון מופחת (GSH) ומנגן סופראוקסיד דיסמוטאז (MnSOD) בהומוגניות של LVs נמדדו על ידי ערכות ELISA (מספר חתולים MBS046356 ומספר חתולים.

תוצאות

רמות הגלוקוז בסרום בצום עלו משמעותית, בעוד שרמות האינסולין בצום בסרום, רמות אינדקס HOMA-b ומשקל הגוף הסופי של חולדה ירדו באופן משמעותי בחולדות הסוכרתיות הנגרמות על ידי STZ בהשוואה לחולדות הביקורת (איור 1A{{3} }ד). מצד שני, רמות הסרום של גלוקוז בצום ירדו באופן משמעותי, אך משקל הגוף הסופי של החולדות ורמות האינסולין בצום ו-HOMA-b עלו באופן משמעותי הן בחולדות הביקורת פלוס קאמפרול והן בחולדות שטופלו ב-STZ פלוס קאמפרול בהשוואה. לחולדות הביקורת או ה-STZ שטופלו בהתאמה (איור 1A-1D). להיפך, רמות הגלוקוז בצום נותרו גבוהות משמעותית ורמות האינסולין וה-HOMA-b, כמו גם משקל הגוף הסופי של חולדה נותרו נמוך משמעותית ב-STZ בתוספת קאמפרול בהשוואה לחולדות הביקורת (איור 1A-1 ד). חוץ מזה, לא הייתה הבדלים משמעותיים ברמות הגלוקוז והאינסולין בצום, כמו גם ברמות של HOMA-b ומשקל הגוף הסופי של חולדה כאשר נערכה השוואה בין STZ פלוס קאמפרול לעומת STZ פלוס קאמפרול פלוס EX{{ 13}} (מעכב SIRT1) (איור 1A-1D). Kaempferol שומר על מבנה החדרים השמאלי ותפקוד המודינמי בלבבות של חולדות סטרפטוזוטוצין סוכרתיות באופן תלוי SIRT מבנה LVs נורמלי עם מבנה המיופיברילים שלם שנראה בדרך כלל סידור אופקי עם גרעינים שלמים במיקום מרכזי ותאי אנדותל היקפיים. נצפתה בחולדות הביקורת בתוספת קאמפרול בהשוואה לחולדות הביקורת (איור 2A ו-2B). חוץ מזה, חולדות מטופלות בשליטה פלוס קאמפרול הראו עלייה משמעותית ב-LVSP אך ללא שינוי ברמות ה-LVEDP והסרום של CK-MB וטרופונין-I בהשוואה לחולדות ביקורת (איור 3A-3D). עם זאת, מיופיברילים בעלי אוריינטציה לא תקינה עם נזק מוגבר ל-Myofibril, קרדיומיוציטים היפרטרופיים, גרעינים קריוליטיים וחדירה של מקרופאגים נצפו ב-LV של חולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי STZ בהשוואה לחולדות בקרה (איור 2C ו-2D). חוץ מזה, לחולדות STZ-סוכרתיות היו גם ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי של LVSP ורמות סרום של CK-MB וטרופונין-I עם ירידה משמעותית במקביל בערכי LVSP (איור 3A-3D). מבנה קרדיומיוציטים כמעט תקין עם ירידה משמעותית בערכי LVEDP ורמות הסרום של CM-MB וטרופונין-I ועלייה משמעותית בערכי LVSP נצפו בחולדות שטופלו ב-STZ פלוס קאמפרול בהשוואה לחולדות הביקורת ( איורים 2E ו-3A-2D). עם זאת, ההטבה בכל הסמנים הללו בחולדות שטופלו ב-STZ בתוספת קמפפרול נותרה שונה משמעותית בין החולדות שטופלו ב-STZ בתוספת קאמפרול. עם זאת, שינויים מבניים בתמונת מראה כמו אלה שנמצאו ב-LV של חולדות עם סוכרת STZ נראו גם בחייהם של חולדות שטופלו ב-STZ פלוס קאמפרול פלוס EX-527- (איור 2F). חוץ מזה, לא נצפו שינויים משמעותיים ברמות של LVSP ו-LVEDP, כמו גם רמות בסרום של CK-MB וטרופונין-I כאשר חולדות עם סוכרת STZ הושוו לחולדות שטופלו ב-STZ פלוס קאמפרול פלוס-527- (איור .3א-3ד). נתונים אלו מצביעים על כך שהשיפור במבנה ותפקוד הלב לאחר קמפפרול תלוי ב-SIRT.1- Kaempferol משרה דיכוי SIRT1-תלוי של פיברוזיס בחדר שמאל על ידי הורדת ויסות גורם גדילה מתמר-b1 רמות נורמליות מעטות של סיבי קולגן נצפו ב-LVs של החולדות הביקורת והביקורת פלוס קאמפרול שטופלו בחולדות (איור 4A, 4B ו-4G ). שקיעת קולגן מוגברת נצפתה ב-LVs של חולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי STZ בהשוואה לחולדות בקרה או בקרה פלוס קאמפרול שטופלו בחולדות (איור 3C ו-3G). עם זאת, נצפתה ירידה ברורה בתצהיר הקולגן ב-LVs של STZ בתוספת kaempferol ובהשוואה לחולדות שטופלו ב-STZ (איור 4D ו-4E). מצד שני, שקיעת קולגן מוגברת נצפתה גם ב-LVs של STZ פלוס kaemferol פלוס EX-527 בהשוואה ל-STZ plus kaempferol (איור 4F ו-4G). במקביל, רמות חלבון מוגברות של TGF-b1 נצפו ב-LVs של חולדות STZ-סוכרתיות בהשוואה לחולדות ביקורת (איור 4H). עם זאת, רמות החלבון של TGF-b1 ירדו באופן משמעותי ב-LVs של הביקורת פלוס קאמפרול וגם של STZ פלוס קאמפרול בהשוואה לחולדות בקרה או STZ-סוכרתיות, בהתאמה (איור 4H). יש לציין, לא נצפתה הבדלים משמעותיים ברמות החלבון של TGF-b1 כאשר חולדות STZ-סוכרתיות הושוו עם STZ פלוס קאמפרול פלוס EX-527 (איור 4H). Kaempferol מעכב מתח חמצוני ודלקת של חדרים שמאליים על ידי SIRT1-הוספה תלויה של Nrf2 ודיכוי NF-kB p65 רמות כוללות של ROS, MDA, IL-6 ו-TNF-a, כמו גם הגרעין רמות של NF-kB p65, עלו באופן משמעותי, אך הרמות הכוללות של GSH ו-SOD, כמו גם הרמות הגרעיניות של Nrf2, הודחקו באופן משמעותי ב-LVs של חולדות הנגרמות על ידי STZ בהשוואה לחולדות ביקורת (איורים 5A{ {94}}D ו-6A-6D). עם זאת, הפחתה משמעותית ברמות הכוללות של ROS, MDA, IL-6 ו-TNF-a, וברמות הגרעיניות של NF-kB p65 עם עלייה נלווית ברמות SOD, GSH וגרעינים רמות של Nrf2 נצפו ב-LVs של הביקורת פלוס קאמפרול וגם של STZ פלוס קאמפרול בהשוואה לחולדות בקרה או STZ-סוכרתיות, בהתאמה (איורים 5A-5D ו-6A- 6D). אף על פי כן, לא נצפתה הבדלים משמעותיים ברמות של כל הפרמטרים הללו בין חולדות שטופלו ב-STZ פלוס קאמפרול ו-STZ פלוס קמפפרול פלוס EX-527-, דבר המצביע על כך שההשפעות נוגדות החמצון והאנטי-דלקתיות של קאמפרול הן שתיהן SIRT{{109} }תלוי (איורים 5A-5D ו-6A-6D). Kaempferol מעכב מוות פנימי של תאי קרדיומיוציטים במנגנון תלוי SIRT1- ללא שינויים ברמות החלבון הציטופלזמי של ציטוכרום-C וגם לא ברמות החלבון הכוללות של Bax ו-Caspase מפוצל, רמות החלבון הכוללות של Bcl2 בעלות משמעותית .

STZ פלוס קאמפרול בהשוואה לחולדות סוכרתיות בשליטה או STZ הנגרמות על ידי STZ, בהתאמה (איורים 8A, 8B ו-9A-9C). מתן EX-527, מעכב SIRT1 סלקטיבי הוריד משמעותית את הפעילות הגרעינית ואת הלוקליזציה של SIRT1 בהשוואה לכל הקבוצות האחרות (איורים 8A, 8B ו-9A- 9D). חוץ מזה, רמות האצטיל של NF-kB p65 נשארו גבוהות יותר באופן משמעותי, אבל רמות החלבון של אצטיל Nrf2 ו-FOXO1 לא היו שונות באופן משמעותי בין חולדות STZ סוכרתיות ו-STZ פלוס קאמפרול פלוס EX-527 (איור 9A-9C ).

דִיוּן

הנתונים של מחקר זה אישרו את המחקר שפורסם בעבר של Chen et al. (29) ותומכים בממצאים, המצביעים על כך שהאפקט המגן על הלב של קאמפרול כנגד DC המושרה על ידי STZ בחולדות מתווך על ידי השפעות היפוגליקמיות, נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות, אנטי פיברוטיות ואנטי אפופטוטיות. עם זאת, הממצא החדש של מחקר זה הוא שאנו מראים, בפעם הראשונה, שכל מנגנוני ההגנה הלבביים הללו שמעניק קאמפרול תלויים ב-SIRT1-במקום שבו חסימת SIRT1 על ידי המעכב הסלקטיבי, EX-527 ביטל את כל ההשפעות הלבביות המועילות של קאמפרול. סיכום של מנגנוני ההגנה שמעניק קאמפרול כנגד DC המושרה על ידי STZ מוצג באיור 10. היפרגליקמיה עקב הרס מוגבר של תאי b היא הגורם העיקרי להתפתחות ולהתקדמות של DC בבני אדם וחיות ניסוי (2, 4, 47). STZ, אנלוגי גלוקוז ציטוטוקסי, היא התרופה הנפוצה ביותר שמובילה להרס חמצוני של תאי b ונמצאת בשימוש נרחב לביסוס DM במכרסמים וכפי שהוצג במחקר זה (48). עם זאת, מתן קאמפרול הן לחולדות הביקורת והן לחולדות הסוכרתיות הוריד משמעותית את רמות הגלוקוז והאינסולין בסרום בצום והעלה משמעותית את ערכי HOMA-b, מדד עיקרי לתפקוד תאי B בלבלב, ובכך התאים להיפוגליקמיה החזקה שלו ולאינסולין. -משחרר אפקטים. חוץ מזה, זה העלה את משקל הגוף הסופי של החולדות, מה שמצביע על שיפור בפעולה היקפית של אינסולין והחלשת השרירים שנגרמו כתוצאה ממחסור באינסולין ובזבוז רקמות שומן. עם זאת, המנגנון המדויק שבו קאמפרול מוריד את רמות הגלוקוז בדם וממריץ את רמות הדם של אינסולין לא נחקר במחקר זה וניתן להתערב בו ממחקרים קודמים דומים. בהקשר זה, קאמפרול הגן על נזק חמצוני של תאי הלבלב המושרה על ידי STZ עקב

תכונותיו נוגדות החמצון (32, 33). עם זאת, אם זה נכון, הנתונים שלנו מצביעים על כך שמנגנון הגנה נוגד חמצון כזה של תאי B בלבלב אינו תלוי בוויסות רמות SIRT1 של הלבלב ופעילות, שכן נצפו פרמטרים מטבוליים תקינים בחולדות סוכרתיות שטופלו בקאמפרול ובמעכב SIRT1 (EX{ {5}}). מצד שני, מחקרים אחרים הראו כי ההשפעה ההיפוגליקמית של קאמפרול מתווכת על ידי שיפור הרגישות ההיקפית לאינסולין, גירוי ביטוי GLUT-4, הגברת ספיגת הגלוקוז ההיקפית ודיכוי הגלוקוניאוגנזה בכבד (31, 33). חוץ מזה, ייתכן שההשפעות ההיפוגליקמיות ושחרור האינסולין של קאמפרול מתווכות על ידי גירוי שחרור האינסולין מתאי ה-b השורדים באמצעות מווסת דה-פולריזציה של הממברנה התאית (כלומר גירוי תעלות K פלוס רגישות ל-ATP), השפעה דומה. לתרופות סולפונילאוריאה (49, 50). מצד שני, ייצור יתר של ROS הוא סימן היכר עיקרי במהלך התפתחות של DC וסיבוכים אחרים הנגרמות על ידי DM והוא המנגנון הפתופיזיולוגי העיקרי העומד בבסיס כל ההשפעות השליליות האחרות כולל דלקת, פיברוזיס ואפופטוזיס (10, 51). אכן, חסימת הייצור,

של ROS על ידי ביטוי יתר או הפעלה תרופתית של Nrf2 ונוגדי חמצון אחרים (כלומר N-אצטילציסטאין (NAC), קטלאז ו-SOD) החלישו את רוב הסיבוכים הסוכרתיים ועיכבו את המסלולים הדלקתיים והאפופטוטיים ברקמות הסרווליות כולל הלב (10, {{3} }). באופן כללי, היפרגליקמיה משרה ROS לבבי על ידי הגברת אוקסידציה מעוררת, חמצון שומנים ומסלולים אחרים המייצרים ROS כגון אנגיוטנסין II/NDAPH אוקסידאז, תחמוצת חנקן סינתאז (NOS), ליפוקסיגנאז (LOX), חומצות שומן חופשיות/נזק למיטוכונדריה וחלבון. קינאז C (PKC), תוצרי קצה של גליקציה מתקדמים (AGEs), מסלולי הקסאמין ופוליאול (4, 5, 11, 51, 55, 56). לרעה, ROS המושרה על ידי היפרגליקמיה יכול לעורר דלקת לבבית על ידי הגברת הביטוי של מספר ציטוקינים דלקתיים ומולקולות הידבקות, חדירת מונוציטים/נויטרופילים והפעלת NF-kB/NRLP3 inflammasome (2, 7, 8, 56-58). חוץ מזה, ROS וציטוקינים דלקתיים יכולים לעורר מוות תאים פנימי וחיצוני ופיברוזיס בלב על ידי גירוי ביטוי Bax, הורדת ויסות Bcl2 והפעלת מסלול האותות TGF-b/Samd2/3 (2, 9, 59, 60). יתר על כן, היפרגליקמיה מעכבת את פירוק הקולגן על ידי הגברת הגלוקוזילציה שלו על ידי אינטראקציה עם AGEs, מה שמעודד עוד יותר נוקשות לב.

(61). עם זאת, בעוד שהיפרגליקמיה מוקדמת מגרה את הטרנסאקטיבציה של Nrf2, היפרגליקמיה ממושכת הכריעה נוגדי חמצון ומדכאת את ההפעלה של גורמי שעתוק אלה (39, 62). בעקבות מחקרים אלה, התפקיד של ROS, עקה חמצונית, דלקת, פיברוזיס ואפופטוזיס בפיתוח והתקדמות DC במודל החיות שלנו אושר גם על ידי הנזק הברור ב-LVs של החולדות, בתצהיר קולגן, עלייה בסמנים של תאים פנימיים. מוות (כלומר Bax גבוה יותר, caspase שסוע -3, וציטוכרום-C, והורדת Bcl2) והפחתה בתפקוד LV. ממצאים אלו נלוו גם לעלייה משמעותית ברמות הלב של ROS, שומנים פרוקסידים וציטוקינים דלקתיים, והפעלה של NF-kB p65 ו-TGF-b1. חוץ מזה, טיפול ב-STZ הפחית את הרמות הגרעיניות של Nrf2, כמו גם את הרמות הכוללות של GSH ו-SOD. להיפך, קאמפרול הצליח לשמר את תפקוד ה-LV, להפחית את שקיעת הקולגן, לדכא פיברוזיס לבבי, ולהפוך את השינויים בכל האירועים הביוכימיים הללו, ובכך להצביע על השפעות נוגדות חמצון חזקות, אנטי דלקתיות, אנטי פיברוטיות ואנטי אפופטוטיות. תצפית חשובה במחקר זה היא שקאמפרול הצליח גם להפחית את רמות ה-MDA וה-ROS, לדכא את הלוקליזציה הגרעינית של NF-kB p65, ולעורר את הרמות הגרעיניות של Nrf2 והרמות הכוללות של GSH ו-SOD, ללא שינוי ב- ביטוי של סמנים אפופטוטיים/אנטי אפופטוטיים וגם לא של TGF-b1 בלבם של חולדות הביקורת. בהתבסס על נתונים אלה, אנו יכולים לטעון בתוקף שהאפקט המגן על הלב של קאמפרול נגד DC במודל חיה זה מתווכת על ידי פוטנציאלים נוגדי חמצון ואנטי דלקתיים המתווכים, בעיקר על ידי הפעלה/עלייה בוויסות Nrf2 ודיכוי NF-kB p65. כמו כן, נתונים אלה עשויים להצביע על כך שהפוטנציאל האנטי-פיברוטי והאנטי-אפופטוטי הנצפה של קאמפרול בלבבות סוכרתיים עשוי להיות משני להשפעותיו נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות. נתונים אלה נתמכים על ידי המחקר האחרון של Chen et al. (31) אשר גם הראו שקאמפרול מעכב עקה חמצונית, דלקת, פיברוזיס ואפופטוזיס פנימי של תאים בתאי H9c2 החשופים לגלוקוז גבוה, כמו גם בלב חולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי STZ, בעיקר על ידי העלאת ויסות של Nrf2 ועיכוב NF- kB. באותו אופן, ההשפעה המגנה של קאמפרול מפני נזק לבבי, כלייתי ועצבי במודלים אחרים של בעלי חיים יוחסה בעיקר ליכולתו לסלק ROS ודיכוי דלקת המתווכת על ידי הפעלה של Nrf2 ודיכוי NF-kB (29, { {38}}, 40).

הפוטנציאלים של קאמפרול והגנת הלב שלו בלב סוכרתיים מעולם לא נבדקו קודם לכן. מסיבה זו, זה היה מעניין אותנו לחקור את ההשפעה של קאמפרול על הביטוי של SIRT1, חלבון עיקרי הממלא תפקיד משמעותי במהלך תגובת לחץ תאית. השערה זו התבססה על השפעות רחבות, נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות, אנטי פיברוטיות ואנטי אפופטוטיות של SIRT1 (12). חוץ מזה, הרמות והפעילות של SIRT1 מתרוקנים באופן משמעותי בלב במהלך DM מאוחר ובלבבות הכושלים, בעוד שהפעלת SIRT1 שימרה את תפקוד הלב וביטלה לחלוטין את הלחץ החמצוני הלבבי, הדלקת והאפופטוזיס הקשורים אליו (20, 21, 26). כמו כן, אי הפעלה של SIRT1 בקרדיומיוציטים הובילה לתסמינים קליניים שנראים דומים מאוד ל-DC, ואילו רסברטרול, מפעיל SIRT1 הפך את זה. כמו כן, kaempferol יכול להפעיל SIRT1 במוח, ריאות, רשתית וקרדיומיוציטים, במבחנה, או in vivo במודלים אחרים של בעלי חיים (36, 40-42). עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי תפקיד המגן המערכתי של SIRT1 מבוססת כיום היטב ומיוחסת לפעילות ה-deacetylase שלו (12). בהתאם לכך, SIRT1 יכול deacetylate p53 ב-Lys373/Lys382 ולפגוע ב-53-upregulation-induced Bax והפעלה שלאחר מכן של אפופטוזיס פנימי של תאים והזדקנות מוקדמת (12, 69). כמו כן, SIRT1 מעכב p300/CBP-associated factor (PCAF) אשר מייצב את p53 (70). חוץ מזה, ההשפעה האנטי-דלקתית של SIRT1 מתווכת על ידי דה-אצטילציה של תת-היחידה RelA/p65 ב-Lys310 ב-NF-kB ואיבוד שלאחר מכן של פעילות התעתיק של NF-kB (71-73). עם זאת, ויסות מצב החמצון ופוטנציאל נוגדי החמצון של SIRT1 מתווכים על ידי דה-אצטילציה של גורמי תעתוק שרתיים, כולל FOXO-3a ו-Nrf2, שניהם מעוררים את הסינתזה של מספר נוגדי חמצון כגון אנזימים נוגדי חמצון (כלומר קטלאז, גלוטתיון פרוקסידאז ; SOD) ו-GSH (20, 21, 25, 74). ואכן, למרות שכמה מחקרים הראו שאצטילציה של Nrf2 נדרשת להפעלתו (75). העדויות הזמינות האחרות הראו ש-SIRT1-מושרה דה-אצטילציה של Nrf2 מגבירה את השעתוק של Nrf2 ואת הלוקליזציה והיציבות הגרעינית שלו (76). יתר על כן, SIRT1 יכול גם לווסת את מבנה הלב והתכווצות על ידי שימור ביטוי SERCA2 ומעכב את היצירה של ROS על ידי הורדת וויסות ועיכוב psch66 ו-FOXO3/PGC-a ביוגנזה מיטוכונדריאלית (17, 77). כמו כן, SIRT1 יכול לחסום ישירות פיברוזיס רקמות על ידי דה-אצטילציה של Smad2/3 (44, 78). בדומה לראיות שהוזכרו לעיל, נראה שההפחתה המשמעותית בפעילות וביטוי הגרעיני של SIRT1 בלב הסוכרתיים משתתפת באופן משמעותי בהשפעות המזיקות הלבביות שנצפו 90 יום לאחר השראת DM. הפחתה כזו ברמת/פעילות SIRT1 הובילה לעלייה ברורה משמעותית ברמות האצטילציה של smad2, NF-kB, FOXO3 ו-Nrf2, ובכך העצימה את ייצור ROS, הפחתה ברמות נוגדי החמצון, דלקת ומוות תאי פנימי. עם זאת, ממצא חדש במחקר זה הוא שקאמפרול הצליח להגביר ולהפעיל את SIRT1 ו-deacetylate, כל גורמי השעתוק הללו בלבם של חולדות הביקורת וה-STZ-DM, ובכך מאשש את העדויות שהוזכרו קודם לכן שקאמפרול הוא מפעיל חזק של SIRT1. כדי לבדוק אם מנגנוני ההגנה מושרים בצורה הוגנת על ידי SIRT1, ניתנו יחד EX-527, מעכב SIRT1 סלקטיבי יחד עם קאמפרול בחולדות סוכרתיות. כצפוי, מתן EX-527 ביטל לחלוטין את כל היתרונות הלבביים והביוכימיים שמעניק קמפפרול. נתונים אלה מצביעים על כך שהשפעות נוגדות החמצון האפקטיביות והאנטי דלקתיות והאנטי-פיברוטיות שנצפו והשפעות האנטי-אפופטוטיות הבאות שלהן של קאמפרול תלויות ב-SIRT1-.

הפניות
1. Gilbert RE, Krum H. אי ספיקת לב בסוכרת: השפעות של טיפול תרופתי אנטי-היפרגליקמי. Lancet 2015; 385: 2107- 2017.
2. Jia G, Hill MA, Sowers JR. קרדיומיופתיה סוכרתית: עדכון של מנגנונים התורמים לישות קלינית זו. Circ Res 2018; 122: 624-638.
3. Jia G, DeMarco VG, Sowers JR. עמידות לאינסולין והיפראינסולינמיה בקרדיומיופתיה סוכרתית. Nat Rev Endocrinol 2016; 12: 144-153.
4. Nunes S, Rolo AP, Palmeira CM, et al. קרדיומיופתיה סוכרתית: התמקדות בלחץ חמצוני, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ודלקת. בתוך: Cardiomyopathies-Types and Treatments, K. Kiraly (עורך) Intech 2017: 235-257.
5. Wilson AJ, Gill EK, Abudalo RA, Edgar KS, Watson CJ, Grieve DJ. איתותים של מיני חמצן תגובתיים בלב הסוכרתי: סיכוי מתעורר למיקוד טיפולי. לב 2018; 104: 293-299.
6. Ritchie RH, Abel ED. מנגנונים בסיסיים של מחלת לב סוכרתית. Circ Res 2020; 126: 1501-1525.
7. לורנצו O, Picatoste B, Ares-Carrasco S, Ramirez E, Egido J, Tunon J. תפקיד פוטנציאלי של גורם גרעיני kB בקרדיומיופתיה סוכרתית. Mediaators Inflamm 2011; 2011: 652097. DOI: 10.1155/2011/652097.
8. Fuentes-Antras J, Ioan AM, Tunon J, Egido J, Lorenzo O. הפעלה של קולטנים דמויי אגרה וקומפלקסים דלקתיים בדלקת הקשורה לקרדיומיופתיה סוכרתית. Int J Endocrinol 2014; 2014: 847827. DOI: 10.1155/2014/847827
9. רוסו הראשון, פרנגוגיאניס NG. פיברוזיס לבבי הקשור לסוכרת: אפקטורים תאיים, מנגנונים מולקולריים והזדמנויות טיפוליות. J Mol Cell Cardiol 2016; 90: 84-93.
10. Ge ZD, Lian Q, Mao X, Xia Z. מצב נוכחי ואתגרים של Nrf2 כיעד טיפולי פוטנציאלי לקרדיומיופתיה סוכרתית. Int Heart J 2019; 60: 512-520.
11. Jubaidi FF, Zainalabidin S, Mariappan V, Budin SB. תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי בקרדיומיופתיה סוכרתית: התפקידים הטיפוליים האפשריים של חומצות פנוליות. Int J Mol Sci 2020; 21: 6043. DOI: 10.3390/ijms21176043 12. D'Onofrio N, Servillo L, Balestrieri ML. מסלולי איתות SIRT1 ו-SIRT6 בהגנה על מחלות לב וכלי דם. Antioxid Redox Signal 2018; 28: 711-732.