מעכב JAK חוסם איתות JAK-STAT-APOL1 המושרה על ידי-19-ציטוקינים בתאים גלומרולריים ופודוציטופתיה באורגנואידים של כליה אנושית Ⅱ

התוצאות שלנו משנות את הפרדיגמה הנוכחית של אינטרפרוןAPOL1-נפרופתיה. מספר דוגמאות באילו מצבי אינטרפרון גבוהים גרמו לגלומרולופתיה מתמוטטת אצל נשאים בסיכון גבוהAPOL1גנוטיפהובילה לפרדיגמה לפיה אינטרפרונים מיוחסים בתור הטריגרים העיקריים של פגיעה שנייה של APOL1-תיווכוגלומרולופתיה (31, 36, 37). פרדיגמה זו קיבלה חיזוק נוסף על ידי העובדה שאינטרפרון אלפא, בטא,והשראת גמאAPOL1ביטוי בפודוציטים ותאים אנדותל מתורבתים (22). למרות זאת,ארכיטיפ זה מאותגר על ידי התצפית שאינטרפרונים לא תמיד מוגברים בסרום שלחולים עםזיהום ב-COVID-19ו-COVAN, בעוד ציטוקינים אחרים כולל IL-6, IL-1 , ו-IL-18מוגדלים (4, 17, 18). במחקר הנוכחי, הוכחנו שגם בהיעדר אינטרפרונים,ציטוקינים שאינם אינטרפרונים אלה גרמו לחסונים בנפרד וביחדAPOL1ביטוי באדםפודוציטים ו-GECs תוך הדגשת סינרגיזם שלא היה מוערך בעבר. על ידי הדגמהכי איתות JAK-STAT הוא המתווך המרכזי של השפעות הציטוקינים המשולבות הללו, התוצאות שלנו מספקותהסבר הגיוני לאופן שבו סופת הציטוקינים COVID-19 מונעתAPOL1הבעה והגבוההשכיחות של גלומרולופתיה מתמוטטת אצל חולים עם וריאנט סיכוןAPOL1וCOVID-19הַדבָּקָה. לממצאים אלה עשויות להיות השלכות על אחריםAPOL1-תיווכו בנפרופתיה.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

למידע נוסף אנא פנה אלינו בכתובת:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

טל/וואטסאפ: +86 15292862950

בעוד התוצאות שלנו מראות את זהציטוקינים שהשרירו-19- COVIDמספיקים כדי לעוררAPOL1ביטויולגרום לאובדן שלפודוציטים מיקרו-אורגנואידים בכליות, הם אינם שוללים את האפשרות ש-SARs-CoV-2 עשוי גם להדביק ישירות תאי כליה כפי שדווח לאחרונה (38, 39). עם זאת, SARs-CoV-2ברקמת כליה אנושית הוכחה רק בדגימות נתיחה שבהן הבלבוללא ניתן היה לשלול תרומה של אוטוליזה של רקמות (3, 4, 15, 16). רוב הדיווחים מביופסיות כליותמהחולים עם COVAN לא הצליחו לזהות את וירוס SARs-CoV-2 למרות שימוש בשיטות רגישות (3, 4),כולל שניים מתוך תשעת המקרים במחקר הנוכחי שנבדקו על ידי אימונוהיסטוכימיה ובהכלאה באתר.

על ידי הדגמת פודוציטופתיה הנגרמת על ידי ציטוקינים, המודל המיקרו-אורגנואידי של הכליות שלנו התרחק מה-פורסם לאחרונהאורגנואיד של הכליהמודל של מחלת כליות 1-מתווכת על ידי Liu et al whoנוצרו אורגנואידים בכליות מ-iPSCs בעריכת CRISPR של תורם לא אפריקאי שבו G0APOL1אללים נערכו לאללים G1 אך על רקע גנטי G0. בעוד אינטרפרון גמא מושרהAPOL1ביטוי באורגנואידים שלהם, זה לא גרם לציטוטוקסיות (40). היעדר ציטוטוקסיות אצלםאורגנואיד של הכליההמודל יכול להסביר את הרקע הגנטי הפחות רעיל שעליו מוטציות G1הונפו מעל. ידוע כי הציטוטוקסיות שלAPOL1ההפלוטיפ מושפע מהגנטיקה שלורקע (41). המיקרו-אורגנואיד של הכליותבמחקר הנוכחי נוצר מ-iPSC לא ערוךשל נשא אפרו-אמריקאי של הגנוטיפ G1G2. שימור ההפלוטיפ הגנטי המקומי עשויתרמו לציטוטוקסיות הקשורה ל-APOL1- שנראתה אצלנומיקרו-אורגנואידים בכליות.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

יתר על כן, בניגוד לביטוי החלבון המווסת APOL1 שאנו מדווחים כאן, מחקר שנערך לאחרונהלא מצא הבדל בAPOL1רמת mRNA בביופסיה של הכליה של חולה אחד עם COVAN בהשוואה לבקרות בריאות (26). אי הסכמה זו בתוצאות שלנו עשויה להיות מוסברת על ידי האופי החולף שלAPOL1mRNA ביחס לחלבון, במיוחד כאשר הביופסיות התקבלו מספר שבועות לאחר ההתחלהאבחון של זיהום COVID-19 כאשר ההשפעות האקוטיות של COVID-19-גרמו לסערת ציטוקיניםייתכן שפרופיל ביטוי mRNA התואם התפוגג. מתקבל על הדעת שככל שהוא רחוק יותרמסערת הציטוקינים הנגרמת-19-בנגיף הקורונה, ככל שהמגיבים בשלב החריף במורד הזרם חלשים יותרקולטן ציטוקינים הופכים, כולל חלבוני STAT מזורחים וAPOL1mRNA. התוצאות שלנומציעים שחלבון APOL1 המושרה נמשך מעבר לכךAPOL1mRNA ו-STATs מפוספסים.

למחקר זה שלוש השלכות קליניות עיקריות. האחד, הם מדגישים את הצורך לגנוטייפ שחור אואנשים היספנים שנמצאו עם גלומרולופתיה מתמוטטת בהקשר של COVID פעיל או לאחרונה-19הַדבָּקָה. לעומת זאת, אםביופסיה של כליהאינו בר ביצוע או אפשרי,APOL1גנוטיפ של שחור אואנשים שנדבקו ב-COVID-19-היספניים עם פרוטאינוריה חדשה או מחמירה ו-AKI צפויים גם הםתשואה גבוהה. שנית, מכיוון שמספר ציטוקינים-19-מושרה על ידי COVID מפעילים באופן מיותר את ה-JAK-STATמסלול לעוררAPOL1ביטוי, אסטרטגיה טיפולית המבוססת על הסרה סלקטיבית אואין סיכוי שעיכוב של ציטוקין אחד יהיה יעיל במניעה או בטיפול ב-COVAN. כַּיוֹם,baricitinib מורשה לשימוש רק תחת אישור שימוש חירום לטיפול ב-COVID-19דורש תוספת חמצן. לכן, הפוטנציאל שלו כטיפול ב-COVAN דורש רצינישיקול, במיוחד עבור נשאים שחורים והיספנים בעלי סיכון גבוהAPOL1גנוטיפים שיש להםזיהום ב-COVID-19. לבסוף, בהתבסס על העדויות כי מחסור באינטרפרון קשור לחמורזיהום ב-COVID-19, הוצע כי אינטרפרון יינתן כטיפול ב-COVID-19. בבזמן כתיבת שורות אלה, על פי ClinicalTrials.gov, שלושים ושישה ניסויים קליניים של אינטרפרון כטיפול בנגיף הקורונה-19 מתמשך או הושלמו. בניגוד לרציונל מאחורי הניסויים הקליניים הללו, שלנותוצאות זהירות מפני מתן אינטרפרונים כטיפול לזיהום ב-COVID-19 בנשאים שלסיכון גבוהAPOL1גנוטיפ מכיוון שאינטרפרונים יכולים להגביר את הביטוי של פתוגניAPOL1בהכליות ומשקע COVAN.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

למחקר שלנו יש כמה מגבלות. סדרת מקרי COVAN שלנו של תשעה קריסות שהוכחו ביופסיותמקרי גלומרולופתיה הם גודל מדגם קטן יחסית וייתכן שחסר הערכת הקשרבין גנוטיפ בסיכון גבוה לבין COVAN או היה נתון להטיית דגימה. האתגר הלוגיסטי שלהשגת ביופסיות כליות מחולים עם זיהום פעיל ב-COVID-19 בטיפול אקוטי מגבילה אתתדירות שלביופסיות של כליותבאוכלוסייה זו. אותו גורם כנראה אחראי לכךרוב הביופסיות במחקר זה בוצעו מספר שבועות עד חודשים לאחר האבחנה הראשונית שלזיהום ב-COVID-19. ניתוח של ביופסיות כליות שהושגו קרוב יותר לטריגר הזיהומי עשוי לספקתובנות נוספות לגבי פנוטיפים תאיים מוקדמים. בנוסף, המחקר הנוכחי אינו מזהה מיומתי לטפל ב-COVAN עם מעכבי JAK. תשובות לשאלות אלו וקביעת ההיעילות של עיכוב JAK כטיפול ב-COVAN תהיה המוקד של חקירות עתידיות.עבודה זו מדגישה את הקשר של סיכון גבוהAPOL1גנוטיפ ותפקיד JAK-STAT-APOL1איתות בפיתוח COVAN. ככל שההבנה שלנו לגבי מגיפת הקורונה-19 מתפתחת,יש צורך דחוף להגביר את המודעות לרופאים ולבריאות הציבור לגבי סיבוכי הכליותשל COVID-19. יש גם צורך דחוף בטיפול COVAN. המחקר שלנו מציע נתונים חדשים על JAKמעכבים כמועמדים טיפוליים חזקים ל-COVAN המשויך ל-APOL{{0}.

שיטות

נוגדנים וריאגנטים.

נעשה שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד החלבונים הבאים: ארנב APOL1אנטי-אנושי [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (ריכוז סופי 0.05 ug/mL);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (ריכוז סופי 0.95 ug/mL) לפי דוח אחרון (42)];עכבר APOL1 אנטי אנושי [Genentech, 4.17A5; אימונופלואורסצנטי [IF] 1:2000 (ריכוז סופי2.13 ug/mL)]; עכבר GAPDH אנטי-אנושי (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); וינקוליןעכבר אנטי-אנושי (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); עכבר NEPH1 אנטי אנושי (סנטה קרוזביוטכנולוגיה, sc373787; WB 1:300); ארנב WT1 אנטי-אנושי (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1עכבר אנטי-אנושי (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); ארנב STAT2 אנטי אנושי(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 עכבר אנטי-אנושי (CST, 9139; WB 1:1000); מזרחןSTAT1 (Y701) ארנב אנטי-אנושי (CST, 9167; WB 1:1000); פוספורילated-STAT2 (Y690) נגד ארנבאנושי (CST, 88410; WB 1:1000); פוספורילated-STAT3 (Y705) ארנב אנטי-אנושי (CST, 9145; WB1:2000); PODXL עז אנטי-אנושי (מו"פ, AF1658; IF 1:500), ארנב E-Cadherin אנטי-אנושי (תא)איתות, 3195S; IF 1:200), עכבר NEPH1 אנטי-אנושי (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). מִשׁנִיהנוגדנים כללו IgG עז נגד ארנבת, נוגדן מקושר HRP (CST, 7074s; WB 1:1000); אנטי סוסיםIgG עכבר, נוגדן מקושר HRP (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 Conjugated Donkey Antiעכבר (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 conjugated donkey antiעז (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000), וחמור מצומד Alexa Fluor 405אנטי ארנב (Thermo Scientific, A48258; 1:000). עבור qRT-PCR, מבחני ביטוי גנים של TaqManכלל APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) ו-PECAM-1 (Hs00169777_m1).צביעת אימונוהיסטוכימיה של הכליות עבור APOL1, synaptopodin ו-CD31. החל מפורמלין קבועשקופיות ביופסיה של כליות משובצות בפרפין, שליפת אנטיגן בוצעה עם (תמיסת EDTA ב-pH 8.0)למשך 56 דקות ב-100 מעלות. נוגדנים ראשוניים ל-APOL1 (5.17D12, Genentech), סינפטופודין (ProgenBiotechnik, 61094), ו-CD31 (Cell Signaling, 3528s) יושמו ב-1:4000 (ריכוז סופי 0.95ug/mL), 1:100 ו-1:1600, בהתאמה למשך 60 דקות ב-36 מעלות. מוכן לשימוש HQ-מצומדמולטימרים משניים נגד ארנב (760-4815) הודגרו במשך 12 דקות ב-36 מעלות. זה היה בעקבותעל ידי הוספת anti-HQ HRP למשך 12 דקות. DAB (760-159) הודגרה למשך 5 דקות בחדרטֶמפֶּרָטוּרָה. קטע הרקמה נצבע נגדי בהמטוקסילין (760-2021) למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.ריאגנט הכחול (760-2037) נוסף במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

טיפול בציטוקינים בתאים מתורבתים.

תאי אנדותל גלומרולרי אנושיים ראשוניים, פודוציטים ראשונייםתורם משנה מכליה תורמת אנושית, ופודוציטים שמקורם באורגנואידים טופלו ב-50ng/mL,ריכוז של 20ng/mL, או 10ng/mL של הציטוקינים הבאים: Recombinant Human CXCL9(Biolegend, 578102); Recombinant Human CXCL10 (Biolegend, 573502); אדם רקומביננטיCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01ב); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); אינטרפרון (IFN) אלפא 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNבטא (Peprotech, 300-02BC); IFN gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Pprotech, 200-06); TNF-alpha(Peprotech, 300-01א); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alpha (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). ריכוז ציטוקינים מתוקנן של 50ng/mL נקבע מראש על סמך תקדים מטיפולים בתאים אנושיים המעריכים תסמונות הלם ציטוקינים בזיהום COVID-19 (17). מעקבבניסויים נעשה שימוש בריכוזים של 20ng/mL ו-10ng/mL. טיפולים הבאים, כולל אורגנואידוניסויי פודוציטים שמקורם באורגנואידים, בוצעו באמצעות 10ng/mL. מעכב JAK 1/2,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), שימש בריכוז סופי של 10uM בסך הכלניסויים.

תרבית תאי אנדותל גלומרולרי אנושי ראשוני. הקפואמלאי של אדם עיקרי בסיכון נמוך (G0G0).תאי אנדותל גלומרולרי נרכשו מ-Celprogen (36066-05), הופשרו והורבתו בבני אדםתרבית תאי אנדותל ראשוני גלומרולרי מדיה מלאה עם סרום, ללא אנטיביוטיקה (Celprogen,M36066-05SA) על לוחות מצופים במטריצה חוץ-תאית קניינית (Celprogen, E36066-05-PD10 וה36066-05-12ובכן) בסביבה הלחות ב-37 מעלות ו-5% CO2. תאים הועברו באמצעות 1Xטריפסין EDTA (Celprogen, T1509-014). תאים שימשו לניסויים בין מעברים 2 עד 4.תאים אומתו על ידי qRT-PCR המראה העשרה בביטוי הגנים PECAM1 (תא אנדותלסמן, הידוע גם בשם CD31).

בידוד גלומרולרי מתת-תרבות הכליה האנושית והפודוציטים התורמים.כליה תורמת אנושית הייתהנרכש באמצעות ה-National Disease Research Interchange (NDRI). הגנוטיפ התורם APOL1 היהG0G1. בידוד גלומרולרי בוצע בשיטת המסננת המותאמת מפרסום קודם (43,44). בקצרה, בעבודה על קרח במכסה מנוע סטרילי, הכליה נותקה תחילה ונכרתה לחצי באמצע סגיטלית. המדולה נותחה, והותירה את הקורטקס. לאחר מכן הקורטקס נטחןוהועבר ברצף דרך מסננות רשת נירוסטה (בגדלים 425 מיקרומטר, 250 מיקרון) ונאסף עלהחלק העליון של מסננת שלישית (150 מיקרומטר) תוך כביסה תכופה עם מי מלח מבוצר פוספט מקורר מראש (PBS)עם 1% BSA (ללא סידן ומגנזיום) (Endecotts, Sieves 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). גלומרולי נאספו, עברו צנטריפוגה והוצעו מחדש ב-5 מ"ל PBS. 10µL מהדגימהנצבעו עם NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) והוצגו במיקרוסקופ אור. לאחר מכן הודגרו גלומרולי במאגר עיכול[DMEM/F12, 1mg/mL כל אחד (קולגןאז I, IV ו-V), DNAse I (50 U/mL או 50 מיקרוגרם/mL)] ב-37 מעלות עבורשעה אחת להשגת תרחיף תא בודד (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415מ 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 עם 10%FBS (מערכות מו"פ,S10350H) נוספה כדי לעצור את העיכול והדגימה בוצעה בצנטריפוגה של 450 גרם דקות ב-4 מעלות.פודוציטים מבודדים טופלו משנה ב- RPMI מתקדם (Fischer Scientific, MT10040CV) עם 10% FBSו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Thermo Fisher Scientific, 15070063) על לוחות מצופות ויטרונקטין(StemCell Technologies, 07004) ב-37 מעלות ו-5% CO2. תאים מתרבות משנה נראו לאחר ~ 5 ימים וטופלו לאחר שבועיים בתרבית.

מיצוי חלבון ו-Western blotting.כל צלחות התרבות והדגימות נשמרו ב-4 מעלות. חד-שכבתישל תאים עבר lysed ונקטף עם Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, 9803) עם מלאמיני מעכבי פרוטאז ומעכבי פוספטאז (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

דגימות עברו צלילים ברמה 4 למשך 10 שניות כל אחת, צנטריפוגה ב-12000rpm x5 דקות, הסופרנטנטנאסף בצינור אפנדורף חדש, וריכוז החלבון נקבע על ידי בדיקת חלבון BCA(פירס, 23225). ליזטים של חלבון דוללו עם 4x חיץ מדגם LaemmLi 2-מרקפטואתנול(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) ומחומם ב-95-100 מעלות למשך 5 דקות. ליזטים של חלבוןלאחר מכן הופרדו באמצעות ג'לים נטולי כתמים של Criterion TGX (4-20%) והועברו באמצעות Bio-Rad Transמערכת העברת Blot Turbo. הממברנות שהועברו נחסמו למשך שעה אחת בחלב 3% ללא שומן ב-Tris-bufferedמלוחים ומודגרים עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים למשך הלילה ב-4 מעלות. היום שלאחר מכןכביסה רגילה, ממברנות הודגרו עם חזרת פרוקסידאז מצומדת משניתנוגדן למשך שעה לפחות בטמפ' החדר לפני ההדמיה עם מערכת הדמיה Bio-Rad ChemiDoc MPלפי הוראות היצרן.

מיצוי RNA ו-qRT-PCR.RNA בודד משכבת חד-שכבה של תאים באמצעות חיץ תמוגה RLT וQiagen RNEasy Mini Kit (74106) לפי הוראות היצרן. RNA הועתק ל-cDNA באמצעותריאגנטים ופרוטוקול של Invitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher, 18091050).תגובות qRT-PCR בוצעו עם Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) ומבחני ביטוי גנים באמצעות QuantStudio 6 Flex System(Thermo Fisher Scientific) באמצעות ∆∆Ct שיטה עם GAPDH כגן התייחסות.

גנוטיפ.DNA הופץ מגושי רקמות FFPE באמצעות ערכת רקמות QIAamp DNA FFPE(Qiagen, 56404) לפי פרוטוקול היצרן. הגנוטייפ בוצע באמצעות Applied Biosystemsמבחני אבחנה אללים של טקמן עבור G1 SNP (p.Ser342Gly) ופולימורפיזם G2(p.Asn388_Tyr389del) באמצעות QuantStudio 6 Flex System. לבדיקה זו יש 100% ספציפיות אנליטית ורגישות אנליטית (מגבלה של זיהוי) של 1.0ng DNA לזיהוי שלAPOL1גרסאות סיכון ב-DNAמופק ממונוציטים בדם היקפי. מבחני אומתו בעבר על ידי השוואת תוצאות לרצף ישיר (סנג'ר רצף). אמצעי בקרת איכות של גנוטייפ כללו את השימוש בשכפולים טכניים, התאמה של 100% של בקרות חיוביות של כל גנוטיפ ובקרות שליליות.

גזירה של מיקרו-אורגנואיד כליות של חולה G1G2 iPSC.מיקרו-אורגנואידים בכליות נגזרו לפיפרוטוקול שפורסם (27), עם כמה שינויים. בקצרה, תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים המושרים (iPSC)נותקו לתאים בודדים באמצעות TrypLE Select ונזרעו על גבי לוחות מצופות ויטרונקטין בStemFlex media (Thermo Fisher Scientific, A3349401) עם מעכב 10uM Rho kinase (TocrisBioscience, 1254) בצפיפות של 11,000-14,000 תאים/ס"מ2 ומתורבת בסביבה לחה ב37 מעלות ו-5% CO2. לאחר מכן התאים הועברו למדיה TeSR-E6 (Stemcell Technologies, 05946) עם8 מיקרומטר CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) למשך 4 ימים. מיום 5 עד יום 7, טופלו בתאים200 ng/mL FGF9, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-1 מיקרומטר CHIR99021. ביום 7, תאים נשטפו עם PBS והתנתק עם TrypLE. תאים מנותקים נשטפו לאחר מכן עם DMEM רגיל וצנטריפוגה בשעה300xg למשך 5 דקות. גלולת תאים הושעתה מחדש במדיה Stage1 [TeSR-E6 המכילה 200 ng/mLFGF9, 1 µg/mL הפרין, 1 µM CHIR99021, 0.1% PVA, 10 µM Rho kinase inhibitor (Tocris Bioscience)]והועבר לצלחת 24-well AggreWell 400 (Stemcell, 34411) בכ-1.2 מיליוןתאים/באר. לאחר מכן הצלחת עברה צנטריפוגה ב-100xg למשך 3 דקות והודגרה למשך 48 שעות ב-37 מעלות5% CO2 באינקובטור סטנדרטי של תרבית תאים. לאחר 48 שעות (יום7+2), אורגנואידים מה- AggreWell היוהועבר לצלחת חיבור 6-בכל רמה נמוכה עם מדיית Stage2 [TeSR-E6 המכילה 200 ng/mL FGF9, 1µg/mL הפרין, 1 µM CHIR99021, 0.1% PVA] על שייקר אורביטלי בתוך חממת תאים למשך 72 נוספיםשעה (ות. מהיום 7+5 ואילך, כל האורגנואידים עברו רענון עם מדיית שלב 3 [TeSR-E6 המכיל0.1% PVA] בימים חלופיים עד לשימוש לניסויים.

בידוד פודוציטים ממיקרו-אורגנואיד.בידוד גלומרולי מאורגנואידים בכליות הותאם מאפרוטוקול שתואר בעבר (45). בקצרה, קבוצות של אורגנואידים בכליות שמקורם ב-iPSC עם ראשי תיבותמספר תא התחלתי של 1.2x106 iPSCs נותקו על ידי דגירה עם TrypLE select (Thermoפישר) למשך 5 דקות ב-37 מעלות. ערבוב עדין באמצעות פיפטה של 1 מ"ל בוצע כל 2-3 דקות כדי לסייעדיסוציאציה. לכל קבוצה, מסננת יחידה של 70 מיקרומטר (PluriSelect) הונחה על צינור של 50 מ"ל (Falcon)והרשת הולחמה עם PBS. תמיסת התא נוספה לפיפטה של 1 מ"ל, המאפשרת זרימהשל הפתרון על ידי כוח הכבידה. באמצעות הבוכנה ממזרק סטרילי 1 מ"ל, התא הנותרהפתרון שנלכד על המסננת נדחף בעדינות דרך הרשת. המסננת נשטפה עםPBS והושלך, שמירה על זרימת התא דרכו. זרימת התא הועברה לאחר מכן לפיפטה על גבי טרום-hydratedמסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר (Pluriselect) ומונחת על צינור טרי של 50 מ"ל (Falcon) המאפשרת תאים בודדיםלזרום באמצעות כוח הכבידה ושטיפת המסננת בהרחבה עם PBS כדי להסיר כל יחיד שנותרתאים. לאחר מכן נאספו הגלומרולים הגדולים ביותר ממסננת התאים בגודל 40 מיקרון על ידי הפיכת המסננת אלצינור טרי של 50 מ"ל ונשטף באמצעות PBS כדי לשטוף את הגלומרולי שנלכדו. התהליך הזה היהחוזר על עצמו באמצעות זרימה מתהליך של 40 מיקרומטר באמצעות מסננת התא הסופית של 30 מיקרומטר (PluriSelect) כדילאסוף את הגלומרולי הקטנים יותר. גלומרולי מבודדים מאורגנואידים בכליות שמקורם ב-IPSC תורבו עלצלחות מצופות ויטרונקטין עם RPMI 1640 מתקדם המכילות 10% FBS בתרבית תאים סטנדרטיתאינקובטור ב-37 מעלות בתוספת 5% CO2. המדיה זוכה לרענון כל יומיים עד שנעשה שימוש בתאיםניסויים.

צביעה אימונופלואורסצנטית, מיקרו-אורגנואיד.מיקרו-אורגנואידים בכליות נשטפו עם PBS וקבוע ב-4% PFA ב-PBS למשך 30-45 דקות על קרח. לאחר מכן נשטפו אורגנואידים קבועים שלוש פעמים עם PBS,והודגר ב-30% סוכרוז ב-PBS למשך הלילה ב-4 מעלות. אורגנואידים הוטמעו ב-OCT ונתון לחיתוך קריו של 10 מיקרומטר עם קריוסטט Laica. חתכים קריאואידיים נשטפו שלושהפעמים עם PBS ולאחר מכן נחסם עם חיץ חוסם 1 (1% ג'לטין דגים, 2% סרום חמור, 0.3% טריטוןX-100 ב-PBS) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הודגרו חתכים קרים עם ראשונינוגדנים בחסימת חיץ 1 למשך הלילה ב-4 מעלות. חתכי קריוס נשטפו שלוש פעמים עם PBS. לאחרכביסה, חתכים בהקפאה הודגרו עם נוגדנים משניים במאגר חוסם 1 למשך שעתיים בחדרטֶמפֶּרָטוּרָה. לאחר חמש כביסות עם PBS, החתכים הצומחים הותקנו עם זכוכית ממושכת נגד דהייהפתרון הרכבה (Thermo Scientific, P36980). תמונות פלורסנט נוצרו באמצעות ECHOמִיקרוֹסקוֹפּ.

צביעה אימונופלואורסצנטית, פודוציט.תרביות פודוציטים נשטפו עם PBS וקובעו ב-4%PFA ב-PBS למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBSוחסום במאגר חוסם 2 (1% ג'לטין פישר, 2% סרום חמור, 0.1% ספונין ב-PBS) עבור 30-60דקה תאים הודגרו עם נוגדנים ראשוניים במאגר חוסם 2 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר(או לילה ב-4 מעלות). תאים נשטפו שלוש פעמים עם חיץ חוסם 2, והודגרו עםנוגדנים משניים במאגר חוסם 2 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש כביסות עםחסימת חיץ 2 ושטיפה אחת אחרונה עם PBS, התאים הורכבו עם Drop-n-Stain EverBriteמדיום הרכבה (Biotium, 23008). תמונות פלורסנט נלכדו באמצעות מיקרוסקופ ECHO.

בדיקת כדאיות. לצורך מדידות תאים ו-ATP, פודוציטים שמקורם באורגנואידים צויפועל גבי לוח 96-באר מצופה ויטרונקטין במדיה של 100uL (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) ותורבת ב-RPMI מתקדם+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) בסביבה לחה ב-37 מעלות ו-5% CO2. נגזר אורגניפודוציטים צופו בו זמנית על 6-צלחת באר כדי לשמש למיצוי RNA עבור qPCR ועל צלחת 24-באר כדי לשמש לאימונוהיסטוכימיה (IHC). תאים טופלו ב-~80% מפגשעם שישה תנאים [שליטה, IFNG (10ng/mL), IFNG (10ng/mL) + baricitinib (ריכוז סופי 10uM),כל הציטוקינים (10ng/mL), וכל הציטוקינים (10ng/mL) + baricitinib (ריכוז סופי 10uM)]. כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶתהוחלף בשעה 48 שעות והתאים הוערכו לאחר 96 שעות. 96-צלחת הבאר עברה עיבוד באמצעות פרומגהמבחני כדאיות תאים ו-ATP כפי שהוזכר בהמשך; צלחת הבאר 6-עובדה עבור RNAמיצוי, סינתזת cDNA ו-qRT-PCR; וצלחת הבאר 24- תוקנה ב-4% PFA עבור IHC. CellTiterפלוּאוֹרִידTMAssay Cell Viability (Promega, G6080) ו- CellTiter-Glo® 2.0 Assay (Promega, G9241) היומבוצע באמצעות הוראות פרוטוקול סטנדרטיות שסופקו על ידי היצרן. המבחנים היו מרוביםלפי פרוטוקול. פלואורסצנטיות (בדיקת פרוטאז לא ליטי) וזוהר (בדיקת ATP ליטי) היונמדד באמצעות פלואורומטר SpectramaxM3. ההבדל במדדים נקבע על ידי הסטודנטיםמבחן t לא מזווג.

סטָטִיסטִיקָה.כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. תוכנת GraphPad Prism 8.3.1 שימשה עבור נתוניםanalysis. Cytokine conditions inducing >פי 1.5APOL1תמלול בהשוואה לבקרה שטופלה במדיהנותחו עבור מובהקות באמצעות מבחן t לא מזווג עם תיקון Holm-Sidak עבור ריבויהשוואות. ערכי ה-P המדווחים הם ערכי ה-p המתואמים. המשמעות נקבעה בעמוד<0.05.

אישור לימודים. מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת דיוק,צפון קרוליינה. הסכמה מדעת של המטופל לא נדרשה על ידי ה-IRB כי החלק המקרה של זההמחקר היה סקירה רטרוספקטיבית של חומר פתולוגי קליני וארכיון בלבד. כליה אנושית עבורבידוד גלומרולרי ותת-תרבות פודוציטים נרכשו באמצעות המחקר הלאומי למחלותמחלף (NDRI); מחקר רקמות אנושיות זה אושר מראש גם באמצעות IRB של דיוק. NDRIדורש מכל אתרי מקור הרקמה לקבל הסכמה מדעת מתורם הרקמה או הפונדקאית.

תרומות מחבריםSEN, GL, SD, KS ו-DS ביצעו ניסויים וערכו כתבי יד. AW ו-DT ביצעו ופירש היסטופתולוגיה, ו-IHC, וערך את כתב היד. GH תרם ריאגנטים חיוניים וערך אתכְּתַב יָד. SEN ו-OAO תכננו את המחקר, ניתחו ופירשו נתונים, עיצבו דמויות וכתב וערך את כתב היד.

תודותעבודה זו נתמכה על ידי 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 ו-Whitehead Scholar Award(OAO); SEN נתמך על ידי Duke Nephrology T32 Training Grant (5T32DK007731-24). אנחנו מודיםSuzie Scales (Genentech) עבור המתנה הנדיבה של נוגדנים ספציפיים ל-APOL1-. אנו מודים למחקרמעבדת היסטולוגיה ב-Duke BRPC ו-Steven R. Colon ב-PhotoPath, Duke Department of Pathology.

הפניות

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, et al. AKI בחולים מאושפזים עם נגיף הקורונה-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, et al. פגיעה חריפה בכליות בחוליםמאושפז עם COVID-19.כליות אינט.2020;98(1):209-18.

3. מאי RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, et al. קבוצה רטרוספקטיבית רב-מרכזיתהמחקר מגדיר את הספקטרום של פתולוגיית כליות במחלת הקורונה 2019 (COVID-19).כליות אינט.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, et al. AKI ו-Clapsingגלומרולופתיה הקשורה ל-COVID-19 ולגנוטיפ APOL 1 בסיכון גבוה.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95.

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. איגוד שלגרסאות ApoL1 טריפנוליטיות עם מחלת כליות באפרו-אמריקאים.מַדָע.2010;329(5993):841-5.

6. פרידמן דיג'יי, ופולק MR. נפרופתיה APOL1: מגנטיקה ליישומים קליניים.Clin J Am Socנפרול.2020.

7. פרידמן דיג'יי, ופולק MR. APOL1 ומחלת כליות: מגנטיקה לביולוגיה.עננו ר' פיזיול.2020;82:323-42. 8. צור S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. מוטציות Missense ב-APOL1הגנים קשורים מאוד לסיכון למחלת כליות בשלב סופי שיוחס בעבר לגן MYH9.המהם ג'נט.2010;128(3):345-50.