בידוד וטיהור של פנילאתנואידים גליקוזידים מ- Cistanche Deserticola על ידי כרומטוגרפיה זרם נגדי במהירות גבוהה

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a, J. Christopher Young b, Honghui Zhu b.

תַקצִיר

חמישה גליקוזידים של פנילאתנואידים (PhGs), echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside ו-20-acetylacteoside, בודדו וטיהרו מCistanche deserticolaבפעם הראשונה על ידי כרומטוגרפיה נגד זרם נגדי במהירות גבוהה (HSCCC) תוך שימוש בשתי מערכות דו-פאזיות, אחת המורכבת מאתיל אצטט-אתנול-מים (5:0.5:4.5, v/v/v) ואחרת של אתיל אצטט-n-בוטנול-אתנול-מים ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v). סה"כ 28.5 מ"ג של אכינאקוסיד, 18.4 מ"ג של ציסטנוסיד A, 14.6 מ"ג של אקטאוזיד, 30.1 מ"ג של איזואקטאוזיד ו-25.2 מ"ג של 20-אצטילקטאוזיד טוהרו מ-1412 מ"ג של תמצית n-debutanolerticola C, כל תמצית n-debutsanolerticola C. בטוהר של מעל 92.5 אחוז כפי שנקבע על ידי HPLC. המבנים זוהו על ידי זמן השמירה שלהם, UV, LC-ESI-MS במצב יונים שליליים, ואושרו על ידי ניסויי NMR. דפוס הפיצול האופייני של LC-ESI-MSn של חמש התרכובות נדון, ונמצא ככלי מאוד ספציפי ושימושי לזיהוי מבני של PhGs מצמח מרפא חשוב זה.

מילות מפתח:Cistanche deserticola; פנילתנואיד; Echinacoside; Cistanoside A; אקטאוזיד; איזואקטאוזיד; 20-אצטילקטאוזיד; HSCCC; LC–ESI-MS; נמ"ר

1. הקדמה

Cistanche deserticola YC Maהיא רפואת צמחי מרפא סינית ידועה ונמצאת בשימוש נרחב בתכשירים מסורתיים הדומים למרכיבי המזון הפונקציונליים של ימינו או לתוספי מזון (Wong, Li, Cheng, & Chen, 2006). המרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים ב-C. deserticola הם פנילתנואידים גליקוזידים (PhGs), כולל echinacoside, acteoside, isoacteoside, 20-acetylacteoside, ו-cistanoside A (Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobayashi et al., 1987). PhG מופצים באופן נרחב בממלכת הצמחים, ונחקרו בהרחבה בשל התפקודים הביולוגיים השונים שלהם, כגון הגנה על הכבד (Xiong et al., 1998), פעילות נוגדת דלקת, אנטי-נוציספטיבית (Schapoval et al., 1998) ופעילות נוגדת חמצון ( Cheng, Wei, Guo, Ni, & Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li, & But, 2000; Li, Wang, & Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu, & Jia, 1993; Wang, Jiang, Wu, & Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani, & Namba, 1996), שיפור התפקוד המיני (Xie & Wu, 1993; Zong, He, Wu, & Chen, 1996), והשפעת הרגעה (Lu, 1998 ).

בשל הפעילות הביולוגית המשמעותית לעיל, יש צורך דחוף בכמויות גדולות של תרכובות טהורות כתקני ייחוס ועבור מחקרים שונים במבחנה וב-in vivo הקשורים לשימוש בתרופות סיניות מסורתיות. לכן, שיטות יעילות לבידוד, טיהור ואפיון מבני של PhGs, הופכות נחוצות. עם זאת, עבודה כזו דורשת בדרך כלל שימוש במספר שלבים כרומטוגרפיים לניקוי ובידוד מדגם (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten, & Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin, & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), מה שבדרך כלל מביא לשיעורי התאוששות נמוכים עקב ספיחה בלתי הפיכה של PhGs על התמיכה המוצקה במהלך ההפרדה (Lei et al., 2001). לעומת זאת, כרומטוגרפיה נגד זרם נגדי במהירות גבוהה (HSCCC) הפכה לחלופה אפקטיבית לטכניקות הכרומטוגרפיות המקובלות להפרדה של כמה PhGs מתמציות צמחים (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). ליי וחב'. הפריד בהצלחה בין אקטאוזיד ו20-אצטילקטאוזידסלסת סיסטאנצ'ס(CA Mey.) G. Beck באמצעות HSCCC (Lei et al., 2001). מחברי מאמר זה דיווחו בעבר על ההפרדה של אקטאוזיד ואיזואקטאוזיד מ-Plantago psyllium L. על ידי HSCCC (Li et al., 2005). עם זאת, לא פורסם דוח על הפרדה וטיהור של PhG מרובים מ-C. deserticola באמצעות HSCCC. בשל היעדר תקנים, שיטות LC-MS פותחו והשתמשו בהן ככלי אנליטי רב עוצמה לאפיון וזיהוי מהירים של כמה PhGs בתמצית צמחים (Li et al., 2005; Wang et al., 2000).

במאמר זה אנו מדווחים על שיטת HSCCC שפותחה להכנת echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside ו-20-acetylacteoside מ-C. deserticola. אפיון וניתוח של חמשת ה-PhGs שהופרדו הושגו על ידי שימוש ב-LC יחד עם ספקטרומטריית מסה ESI בשורה וניסויי NMR. זמן ההחזקה, המשקל המולקולרי ויונים המקטעים האופייניים של חמשת ה-PhGs מוצגים ונדונים במאמר זה. המבנים של חמשת PhGs שזוהו בחקירה זו מוצגים באיור 1.

מרכיבים יעילים של Cistanche deserticola

2. ניסיוני

2.1. כימיקלים וריאגנטים

Acteoside נרכש מסיגמא-אלדריץ' (Oak-Ville, ON), echinacoside נרכש מ- ChromaDex (סנטה אנה, קליפורניה). Isoacteoside בודד מ-P. psyllium L. (Li et al., 2005). C. deserticola נרכשה מחנות המרפא של Beijing TongRenTang (סין). כל הממסים היו בדרגת HPLC ונרכשו ממעבדות Caledon Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. הכנה לדוגמא

C. deserticola (20 גרם) חולץ חמש פעמים בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות כל אחת עם 100 מ"ל של 80 אחוז אתנול מימי. בכל פעם תערובת המיצוי עברה סינון דרך נייר פילטר Whatman No.1 (Whatman International Ltd., Maidstone, אנגליה). הפילטרט המשולב רוכז ל-100 מ"ל בוואקום ב-<40 מעלות.="" התמיסה="" המימית="" שהתקבלה="" הופרה="" פעמיים,="" כל="" אחת="" עם="" 100="" מ"ל="" של="" הקסאן,="" ולאחר="" מכן="" חולצה="" ברציפות="" במשך="" חמש="" פעמים,="" כל="" אחת="" עם="" 100="" מ"ל="" n-בוטנול.="" שכבות="" ה-n-בוטנול="" שולבו="" ורוכזו="" ליובש="" בוואקום=""><40 מעלות,="" מה="" שהניב="" 2.2="" גרם="" של="" תמצית="" n-בוטנול.="" התמצית="" אוחסנה="" ב--20="" מעלות="" לפני="" הפרדת="">

2.3. הליך הפרדת HSCCC

ה-HSCCC ההכנה בוצע בכרומטוגרפיה של דגם CCC{{0}} במהירות גבוהה נגד זרם נגדי (Pharma-Tech Research, בולטימור, מרילנד ארה"ב). למכשיר זה היו שלושה סלילי הכנה, מחוברים בסדרה (נפח כולל, 325 מ"ל). ניתן לווסת את מהירות הסיבוב של המכשיר בין 0 ל-2000 סל"ד. מערכת HSCCC צוידה במשאבת HPLC (Pharma-Tech Research, בולטימור, מרילנד, ארה"ב), גלאי UV דגם 450 (Alltech, ארה"ב), מקליט דגם L 120 E שטוח מיטה (Linseis Inc., Princeton Jct, ארה"ב), אספן שברים (Advantec MFS Inc., ארה"ב) ושסתום הזרקת דגימה עם לולאת דגימה של 10-mL.

תערובת של אתיל אצטט-אתנול-מים (5:0.5:4.5, v/v/v) נערה בחוזקה במשפך הפרדה ונתנה לעמוד ולהיפרד בטמפרטורת החדר. שני השלבים שימשו ב-HSCCC לאחר שהגיעו לשיווי משקל. כל העמוד המפותל התמלא תחילה בשכבה העליונה, המשמשת כשלב נייח. השכבה התחתונה (פאזה ניידת) נשאבה לקצה הראש של העמוד בקצב זרימה של 1.5 מ"ל/דקה. מהירות הסיבוב נקבעה ל-1050 סל"ד. דגימה (כ-230 מ"ג בכל פעם) שהומסה ב-8 מ"ל של תערובת אתיל אצטט-אתנול-מים (5:0.5:4.5, v/v/v) הועמסה לתוך שסתום ההזרקה לאחר שהמערכת הגיעה להידרודינמית שִׁוּוּי מִשׁקָל. מערכת ממס דו-פאזית זו נבחרה על סמך מקדם החלוקה (K), שהיה 0.87, 1.11 ו-1.32 עבור אקטאוזיד, איזואקטאוזיד ו-20 אצטילקטאוזיד, בהתאמה. ערך K היה היחס בין הריכוזים בשכבות העליונות והתחתונות של אותה תרכובת כפי שנקבע על ידי HPLC (איור 2). ההשפך ממוצא העמוד נוטר ברציפות על ידי גלאי UV ב-254 ננומטר ונאסף למבחנות עם אספן חלקים שהוגדר ל-4 דקות עבור כל צינור.

2.4. תנאי LC

דגימה אוטומטית סטטית וגלאי מערך פוטודיודות (DAD) שימשו לניתוח של PhGs בתמצית n-butanol של C. deserticola ושברים שנאספו מהפרדת HSCCC. ההפרדה בוצעה בעמוד Phenomenex ODS-C18 (250 × 4.6 מ"מ, 5 ל"מ) עם עמוד שמירה C18. השלב הנייד הבינארי כלל מאצטוניטריל (ממס A) ומים המכילים 2 אחוז חומצה אצטית (ממס B). כל הממיסים סוננו דרך א

מסנן {{0}}.45 lm לפני השימוש. קצב הזרימה נשמר קבוע ב-1.0 מ"ל/דקה למשך זמן ריצה כולל של 25 דקות. המערכת הופעלה עם תוכנית גרדיאנט: 0–20 דקות: 90 אחוז B עד 60 אחוז B; 20–22 דקות: 60 אחוז B עד 0 אחוז B; ו-22-25 דקות, 0 אחוז B עד 90 אחוז B. נפח הזרקת הדגימה היה 10 ליטר. שיא העניין נוטר ב-320 ננומטר על ידי גלאי DAD.

2.5. ניסויי LC-ESI-MS

ניסויי LC-MS בוצעו באמצעות ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים Finnigan LCQ DECA (Thermo Finnigan, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב) מצויד במקור יינון אלקטרוספריי (ESI). הדגימות נותחו באותו מצב כרומטוגרפי. מודל שלילי שימש לאיסוף נתונים. קצבי זרימת הגז והעזר הוגדרו ל-96 ו-7 (יחידה שרירותית), בהתאמה. המתח הנימים נקבע על 29 וולט והטמפרטורה שלו נשלטה על 350 מעלות. מתח עדשת הכניסה נקבע על 40 וולט ואמפליטודת ה-RF הרב-קוטבית נקבעה על 540 וולט. מתח המחט ESI נשלט על 4.5 קילו וולט. קיזוז עדשת הצינור היה 16 וולט, עדשה רב-קוטבית 1 הייתה 8.20 וולט והקפאת עדשה רב-קוטבית 2 הייתה 10.5 וולט. מתח מכפיל האלקטרונים נקבע על 980 וולט לזיהוי יונים.

2.6. NMR לזיהוי

ספקטרום NMR תועדו בספקטרומטר Bruker Avance-600 (Bruker BioSpin Ltd., Milton, קנדה). רק תרכובות 2 ו-5 (אין תקנים זמינים) עברו ניסויי NMR. דגימות הומסו ב-CD3OD.

מרכיבים פעילים של cistanche: echinacoside ו-acteoside

3. תוצאות ודיון

הפרדת HSCCC מוצלחת תלויה במידה רבה במערכת ממס דו-פאזית מתאימה המספקת מקדם חלוקה אידיאלי (K) סביב 1 עבור התרכובת הרצויה. מערכת דו-פאזית כזו צריכה גם להניב זמן התיישבות קצר למדי (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka, Oka, & Ito, 1991). בניסוי שלנו, בחרנו ארבע סדרות של מערכות ממס על פי המסיסות של תרכובות המטרה ב-C. deserticola. HPLC שימש למדידת הריכוז בכל שלב, שממנו חושבו ערכי K של תרכובות המטרה. שתי מערכות, אתיל אצטט-n-בוטנול-אתנול-מים (4:0.6:0.6:5, v/v/v/v) ואתיל אצטט-מים (1:1, v/v), שימשו בעבר ב- HSCCC כדי להפריד בין אקטאוזיד ו20-אצטילקטאוזיד

סי סלסה, ואקטאוזיד ואיזואקטאוזיד מ-P. Psyllium,

בהתאמה (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). למרות שלמערכת הראשונה היה זמן שקיעה קצר יחסית, היו לה ביצועים גרועים בהפרדת ה-PhGs של C. deserticola, עקב ערכי K הנמוכים עבור תרכובות 1 ו-2, וערכי K גבוהים עבור תרכובות 3-5. ערכי K היו נמוכים מאוד עבור תרכובות 1-4 במערכת השנייה, אך גבוהים מאוד עבור תרכובת 5 (טבלה 1). מערכת שונה המכילה אתיל אצטט-אתנול-מים (5:0.5:4.5, v/v/v), נתנה ערך K אידיאלי עבור תרכובות 3-5 ב-0.87, 1.11 ו-1.32, בהתאמה, והביאה להפרדה טובה. משלושת התרכובות הללו (איור 3A ו-B). מערכת זו, לעומת זאת, ייצרה

ערך K קטן מדי עבור תרכובות 1 ו-2, מה שגורם לשתי התרכובות להיפלט יחד ליד חזית הממס (שבר 1 באיור 3A). שינוי נוסף במערכת (אתיל אצטט-n-בוטנול-אתנול-מים (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) העלו את ערכי K עבור תרכובת 1 ו-2 ל-0.52 ו-0.92, בהתאמה, והובילו להפרדה מלאה (איור 3C). איור 3A מציג את ההפרדה של HSCCC של א. דגימה המכילה 23 0 מ"ג של תמצית n-butanol של C. deserticola באמצעות אתיל אצטט-אתנול-מים (5:0.5:4.5, v/v/v). שברים שאושרו ע"י HPLC כדי להכיל רק תרכובות 3, 4 או 5 שולבו בנפרד, ואלו המכילות תרכובות 3 ו-4 אספו, ייובשו בהקפאה והועברו מחדש ל-HSCCC להפרדה נוספת (איור 3B). שני השלבים הפרדת HSCCC שתוארה לעיל הניבה סך של 14.6 מ"ג, 30.1 מ"ג ו-25.2 מ"ג של תרכובות 3-5 מתמצית n-butanol של 1412 מ"ג. איור 3C מציג את הפרדת HSCCC של דגימה המכילה תרכובות 1 ו-2 (חלק 1 בהפרדה הראשונה) באמצעות אתיל אצטט-n-בוטנול-מים (0.5:0.5:0.1:1, v/v/ v/v). סך הכל 28.5 ו- 1 התקבלו 8.4 מ"ג של תרכובות 1 ו-2. הטהרה הכרומטוגרפית של התרכובות המיובשות בהקפאה 1-5 היו מעל 92.5 אחוזים, ששימשו ישירות לניתוחי LC-ESI-MS ו-NMR.

זיהוי טנטטיבי של תרכובות 1, 3 ו-4 הושג על ידי זמני שמירה ונתונים ספקטרליים UV תואמים לאלו של האכינאקוסיד, האקטאוזיד והאיזואקטאוזיד האותנטיים (איור 2). תרכובות 2 ו-5 לא היו ידועות, עם זאת, ספקטרום ה-UV של כל חמש התרכובות היו דומות מאוד, מה שמצביע על מאפיינים מבניים דומים.

כדי לחקור עוד יותר את המבנים של חמש התרכובות הללו, ניסו ניסויים של LC-ESI-MSn והתוצאות מוצגות באיור 4 ובטבלה 2. תרכובות הקשורות לפסגות (1-5) באיור 2 הציגו יונים מולקולריים עזים מפורקים. [MH]— ב-m/z 785, 799, 623, 623 ו-665, בהתאמה, במצב השלילי. יונים דימריים [2M H]- נצפו גם עבור פסגות 1-4 באיור. נתוני LC–MSN (טבלה 2) סיפקו מידע מבני שימושי ביותר עבור חמשת ה-PhGs, כגון אובדן נייטרלי של הליך ניסיוני: כ-1 מ"ג מכל דגימה נשקל במבחנה של 10 מ"ל שבה 1 מ"ל מכל שלב. נוספה של מערכת הממס הדו-פאזית המאוזנת מראש. המבחנה כוסתה ונערה בחוזקה למשך דקה אחת, והורתה לעמוד עד שהיא נפרדת לחלוטין. מנה של 100 ליטר מכל שכבה הוצאה ואודה בנפרד ליובש בוואקום בשעה<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

ה-LC-ESI-MS של שיא 1 מוצג באיור 4A. היון המולקולרי דה-פרוטונים [MH]- ב-m/z 785 עם שפע גבוה ומולקולרי דה-פרוטונים דימרי.יון [2M H] - ב-m/z 1571 נצפה במצב שלילי, מה שמרמז על משקל מולקולרי של 786, שהיה זהה לזה של echinacoside. חקירה נוספת בניסוי LC-MS2 של יונים m/z 785 הניבה יון בת עיקרי אחד ב-m/z 623 (איור 4B) שהופק ישירות מ-m/z 785 על ידי אובדן של חלק קפיאויל או חלק הקסוז כמו [M] 162 ח]—. הספקטרום של LC-MS3 של m/z 623 הציג שני יונים עיקריים ב-m/z 477 ו-461, ושני יונים מינוריים ב-m/z 315 ו-179 (איור 3C, טבלה 2). הבדלי המסה בין m/z 623 ליונים של fragment m/z 477 ו-461 היו 146 ו-162, בהתאמה, התואמים לאובדן של יחידת רמנוזה וחלק גלוקוז או חלק קפאואיל [M 162 H]-. יוני m/z 623 איבדו גם חלק קפאויל וחלק rhamnose כדי לייצר את יוני m/z 315. היון ב-m/z 179 הופק מביקוע קבוצת הקאפיאויל, כאשר המטען השלילי נותר בחלקה של קבוצת הקאפיאויל. ניסוי LC-ESI-MSN על האכינאקוסיד האותנטי הראה את אותו דפוס פיצול. לפיכך אושרה שיא 1 כאכינאקוסיד.

עבור שיא 2, ה-LC–ESI-MS הראה m/z 799 בתור היון המולקולרי המפורק [MH] - ו-m/z 1599 בתור היון הדימרי שלו, מה שמרמז על מסה מולקולרית של 800. במהלך ניסויי MS2, ה-m/z 799 יונים יצרו שלוש בנות ב-m/z 637, 623 ו-475 (טבלה 1). היון ב-m/z 637 הופק ישירות מהיון האב של m/z 799 שוב עקב אובדן נייטרלי של ה-caffoyl [M-162-H]- או חלק גלוקוז [M-162-H]-. היון ב-m/z 623 נבע מאובדן של רדיקל CH2. היון ב-m/z 475 נוצר מאובדן נייטרלי הן של קבוצת הקאפיאויל [M 162 H] - והן של קבוצת הגלוקוז מיון האב. הניסוי של MS3 ב-m/z 637 יצר שלושה יונים ב-m/z 619, 491 ו-475, התואמים לאובדן של מים אחד, יחידת rhamnose וחלק גלוקוז, בהתאמה. יון הבת m/z 623 ייצר m/z 461 ו-315 במחקר MS3, אשר עקב אחר אותם מסלולי פיצול כמו echinacoside כפי שנדון לעיל. נתוני LC– ESI-MSN תמכו בזיהוי טנטטיבי עבור שיא 2 כ-cistanoside A. שני הפסגות הראו את אותו [MH]- יון ב-m/z 623 ודימר ב-m/z 1247 במצב השלילי (טבלה 1), מה שמצביע על כך. הם אולי איזומרים עם אותו משקל מולקולרי של

624, זהה לאקטאוזיד ואיזואקטאוזיד. הספקטרום של MS2 של יוני [MH]— הראה גם יון בת אחד של m/z 461, מה שהצביע על אובדן קבוצת ה-caffoyl מיון האב m/z 623 (טבלה 1). ספקטרום MS3 דומים התקבלו עבור שתי התרכובות. עבור שיא 3, ספקטרום MS3 של היון ב-m/z 461 יצר שלושה יונים ב-m/z 315, 161 ו-135. ה-m/z 315 נוצר לאחר איבוד rhamnose כפי שנדון קודם לכן. היון m/z 161 הופק מביקוע קבוצת הקאפיאויל, ואחריו איבוד נוסף של מים אחד; המטען נשאר בחלקה של קבוצת הקאפיאויל. היון ב-m/z 135 [agly-cone 18 H]- נוצר מביקוע הקשר הגליקוזידי במיקום C1 עם איבוד נוסף של מים אחד, מה שמותיר את המטען להיות על חלקה של חלק האגליקון. הספקטרום של MS3 של שיא 4 עקב אחר אותו מסלול פיצול כמו שיא 3 למעט היון החסר ב-m/z 135. היון המולקולרי ודפוסי הפיצול של שתי התרכובות הללו תואמים את נתוני הספרות על אקטאוזיד ואיזואקטאוזיד (Wang et al. ., 2000), למרות שנמצא יון נוסף m/z 153 ונתוני פרוטון NMR של cistanoside A ו-20-acetylacteoside הוקצו כ-[aglycone H]— על ידי Wang et al. (Wang et al., 2000). ייתכן שהיון הזה היה לא יציב ואיבד מים כדי לתת m/z 135 בניסוי שלנו. בהתבסס על נתוני טרשת נפוצה וזמני השמירה התואמים של פסגות 3 ו-4 עם הסטנדרטים, לכן הם מזוהים כאקטאוזיד ואיזואקטאוזיד, בהתאמה.

נתוני LC–ESI-MS של שיא 5 מוצגים בטבלה 2. יון מולקולרי מפורק [MH]— (מ/ז 665) היה היון היחיד שנמצא במצב השלילי, מה שמרמז על מסה מולקולרית של 666. שלושה יוני בת נצפו ב-m/z 623, 503 ו-461 בניסוי MS2 (טבלה 2). יוני הבת ב-m/z 623 ו-503 נוצרו ישירות מיון האב על ידי אובדן של קבוצת COCH2 וחלק caffeoyl, בהתאמה. היון ב-m/z 461 הגיע מאובדן הן של caffoyl והן של החלק COCH2 [M 162 42 H] - מהיון האב. בניסוי MS, m/z 623 הפיק m/z 461, ו-m/z 503 הניב שלושה יונים ב-m/z 485, 461 ו-315. ספקטרום MS3 של יון הבת m/z 461 נתן שני יונים ב-443 ו-315. על ידי השוואת דפוס הפיצול של LC–MSN של שיא 5 עם תרכובות אחרות שדווחו במחקר זה ועם אחרות שדווחו (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), הגענו למסקנה שפסגה 5 קשורה מאוד מבחינה מבנית. לאקטאוזיד כשההבדל היחיד הוא יחידת COCH3 במיקום R3. לכן ניתנה זהות טנטטיבית לשיא 5 בתור 20-אצטילקטאוזיד (איור 1).

המבנים של שתי התרכובות שזוהו באופן טנטטיבי, שיא 2 (כציסטנוזיד A) ושיא 5 (כ20-אצטיל-אקטאוזיד) אושרו על המבנים שלהם על ידי NMR 1H. השינויים הכימיים וקבועי הצימוד של כל הפרוטונים בתרכובות 2 ו-5, כפי שמוצג בטבלה 3., תאמו את נתוני ה-NMR המדווחים עבור cistanoside A ו-20-acetylacteoside, בהתאמה (Kobayashi et al., 1984, 1987) . ניסויי NMR 2D (מתאם COSY, ROESY ו-CH לטווח ארוך) נערכו גם הם במחקר הנוכחי והם אישרו עוד יותר את הזיהוי (נתונים לא מוצגים).

אקטאוזיד מ- Cistanche deserticola

4. מסקנות

במאמר הנוכחי, HSCCC שימש בהצלחה לבידוד וטיהור של echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside ו-20-acetylacteoside מתמצית n-butanol של C. deserticola. לכן זהו אמצעי מוכח להפרדה חצי הכנה של ביואקטיבית. בינתיים, המבנים של חמשת ה-PhGs ב-C. deserticola נחקרו באמצעות LC–ESI-MSN; נמצאו כמה מאפיינים אופייניים של PhG, שאפשרו לנו לקבוע את הקבוצות הפונקציונליות במבנים. לפיכך, שיטת LC-ESI-MSN היא כלי רב עוצמה לזיהוי מהיר של פנילאתנואידים והגליקוזידים שלהם בתמציות C. deserticola, במיוחד כאשר הם מוכחים על ידי נתוני NMR.

הכרה

המחברים רוצים להודות ל-Jun Gu מהמרכז לתהודה מגנטית גרעינית, אוניברסיטת גואלף, אונטריו, קנדה על הסיוע שלה בניסויי NMR. פרויקט זה נתמך חלקית במימון ממחוז ג'ילין, סין (מס' 20060904).

הפניות

Chen, LJ, Games, DE, & Jones, J. (2003). בידוד וזיהוי של ארבעה מרכיבי פלבנואידים מהזרעים של Oroxylum Indicum על ידי כרומטוגרפיה זרם נגדי במהירות גבוהה. Journal of Chromatography A, 988, 95–105.

Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., Ni, W., & Liu, CZ (2005). תרביות תליית תאי Cistanche deserticola: ביו-סינתזה של גליקוזידים של פנילתנואידים ופעילות נוגדת חמצון. תהליך ביוכימיה, 40, 3119– 3124.

Foucault, AP, & Chevolot, L. (1998). כרומטוגרפיה זרם נגדי: מכשור, בחירת ממס וכמה יישומים אחרונים לטיהור מוצרים טבעיים. Journal of Chromatography A, 808, 3–22.

Gross, G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R., & Sticher, O. (1988). Teucrioside, גליקוזיד פניל-פרופנואיד מ-Teucrium Chamaedrys. פיטוכימיה, 27, 1459–1463.

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000). פעילות נוגדת חמצון של גליקוזידים פנילתנואידים מ- Brandisia סיכויים. Journal of Ethnopharmacology, 71, 483–486.

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. III. בידוד ומבנים של גליקוזידים פנילפרופנואידים חדשים, Cistanoside A ו-B. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3009–3014.

Kobayashi, H., Oguchi, H., Takizawa, N., Miyase, T., Ueno, A., Usmanghani, K., et al. (1987). פנילאתנואידים גליקוזידים חדשים מבית Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. FI. עלון כימי ותרופות, 35, 3309–3314.

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ, & Ito, Y. (2001). בידוד הכנה וטיהור של אקטאוזיד ו-2'-אצטיל אקטאוזיד מ-Cistanches Salsa (CA Mey) G. Beck על ידי כרומטוגרפיה נגד זרם. כתב עת לכרומטוגרפיה א', 912, 181–185.

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, et al. (2005). בידוד וטיהור של אקטאוזיד ואיזואקטאוזיד מ-Plantago psyllium L. על ידי כרומטוגרפיה של זרם נגדי במהירות גבוהה. Journal of Chromatography A, 1063, 161–169.

Li, LL, Wang, XW, & Wang, XF (1997). חמצון נוגד שומנים ופעולה אנטי רדיקלית של גליקוזידים ב-herba Cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica, 22, 364–367.

Li, J., Wang, PF, Zheng, RL, Liu, ZM, & Jia, ZJ (1993). הגנה על גליקוזידים פניל-פרופנואידים מ-Pedicularis מפני המוליזה חמצונית במבחנה. פלנטה מדיקה, 59, 315–317.

Lu, MC (1998). מחקרים על השפעת ההרגעה של Cistanche deserticola. Journal of Ethnopharmacology, 59, 161–165.

Nishimura, H., Sasaki, H., Inagaki, N., Chin, M., & Mitsuhashi, H. (1991). תשעה גליקוזידים של אלכוהול phenethyl מבית Stachys szeboldzz. פיטוכימיה, 30, 965–969.

Oka, F., Oka, H., & Ito, Y. (1991). חיפוש שיטתי אחר מערכות ממס דו-פאזיות מתאימות לכרומטוגרפיה זרם נגדי במהירות גבוהה. כתב עת לכרומטוגרפיה, 538, 99–108.

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., & Li, X. (1990). תרכובות פנוליות מבית Plantago Asiatica. פיטוכימיה, 29, 3627–3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998). פעילויות אנטי דלקתיות ואנטי-ציספטיביות של תמציות ותרכובות מבודדות מ-Stachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology, 60, 53–59.

Shoyama, Y., Matsumoto, M., & Nishioka, I. (1987). גליקוזידים פנוליים משורשים חולים של Rehmannia glutinosa Var. Purpurea. Phyto Chemistry, 26, 983–986.

Wang, XW, Jiang, XY, Wu, LY, & Wang, XF (2001). השפעת ניקוי של גליקוזידים של Cistanche deserticola על רדיקלים חופשיים והגנתו מפני נזק ל-DNA המושרה על ידי OH במבחנה. Journal of Chinese Pharmacology, 36, 29–31.