אינטראקציות בין נוגדי חמצון פוליפנוליים קוורצטין ונרינגנין מכתיבות את ההתנהגות הכימית והביולוגית הייחודית של התערובות שלהם חלק 1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

מחקר שבוצע בשני העשורים האחרונים על בסיס מולקולרי של מחלות כרוניות לא זיהומיות כגוןטרשת עורקים, לַחַץ יֶתֶר, סוכרת ובמיוחד סרטן שתפסו עניין רב גילו שלכל המחלות הללו יש גורם סיכון משותף, שהוא הפרעה של הומאוסטזיס חיזור המכונה לעתים קרובות מתח חמצוני12. זה נובע כתוצאה מרמה אנדוגנית מוגברת של מיני חמצן תגובתיים (ROS) עקב מחסום נוגדי החמצון של הגוף שנכשל, ומאמינים שהוא מקדם את התפתחותן של כל המחלות הללו.3. לפיכך, נבעה ההנחה שגורמים אקסוגניים המסוגלים לנטרל ROS, למשל נוגדי חמצון צמחיים, יכולים לנטרל או להאט התפתחות של מחלות כרוניות ולתמוך בטיפול בהן. אימות של השערה זו יזם מחקרים מפורטים על נוגדי חמצון המצויים במזון שעלולים להפגין פוטנציאל מניעה4. ואכן, מספר מחקרים שסוכמו במטה-אנליזה שהשוו בין צריכת מזון ומחלות כרוניות הקשורות לתזונה גילו ירידה בסיכון במקרה של דיאטות עשירות בפירות וירקות, דגנים מלאים וכן משקאות כמו יין, קפה ותה, מכאן מוצרים עשירים בפיטוכימיקלים נוגדי חמצון. באופן לא מפתיע, ההנחה הייתה שפעם אחת מבודדים חומרים אלה ממקורותיהם הטבעיים, מטוהרים ולאחר מכן נצרך בצורה של תוספי תזונה המכילים מינונים גבוהים מאלה שניתן להשיג בתזונה יכולים להפוך לחומרים מונעים כימיים רבי עוצמה. הנחה זו אוששה על ידי גוף רב של עדויות שהגיעו ממחקרים המנצלים מודלים ניסיוניים שונים של מחלות כרוניות ו-in vivo של מחלות כרוניות, כולל סרטן. . לדוגמה, שתי מטא-אנליזות של חקירות עוקבה וביקורת מקרה עם ויטמין E8 או תכשירים מיקרו-נוטריינטים" הגיעו למסקנה שרמות נמוכות של נוגדי חמצון לא השפיעו, בעוד שמינונים גבוהים עלולים להגביר הן את השכיחות והתמותה של סרטן ומחלות לב וכלי דם. עם זאת, כאשר תוספי מזון התבססו על צמחים אמיתיים, כגון תערובת ספציפית של מזונות מרוכזים עשירים בפוליפנולים (רימון, תה ירוק, ברוקולי וכורכום), נצפתה השפעה מגינה משמעותית בגברים עם סרטן הערמונית1.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

ההשפעות המבטיחות של מזונות מלאים בניגוד לתרכובות מבודדות עולות בקנה אחד עם תפיסת סינרגיית המזון, המוגדרת כתוסף או יותר מהשפעה הנוספת של שילוב מרכיבי מזון שונים על בריאות האדם. המחקר הקודם שלנו אימת את הרעיון הזה על ידי השוואת הפעילות הביולוגית של מזונות אמיתיים עם נוגד החמצון העיקרי המבודד שלהם. זה הראה שההשפעות הביולוגיות של תמציות של פירות יער שונות מאוד מאלה שמציגים אנתוציאנין ציאנידין-3-O-glucoside. כמה דיווחים אחרים הצביעו גם על חשיבות האינטראקציות בין תרכובות ביו-אקטיביות שונות ורכיבי מטריצת מזון שהתבררו כגורמים משתפים פעולה, הקובעים את הפעילות הביולוגית הסופית של מזונות3-1. החקירות המכניסטיות האחרונות שלנו הכוללות בנייה מחדש של הרכב הקקאו של ביואקטיבית תמכו גם ברעיון של סינרגיה מזון, אך הוכיחו שההשפעות הביולוגיות של דגימות עם הרכבים מורכבים אינן רק שילוב של הפעילויות שמוצגות על ידי רכיבים בודדים'3. כל התצפיות הללו העלו שכאשר בוחנים פעילויות ביולוגיות הקשורות לחמצון של נוגדי חמצון מבודדים לעומת תערובות שלהם, יש לקחת בחשבון את האינטראקציות בין הרכיבים. המורכבות הגוברת של תערובת שלפיטוכימיקליםנראה ליצור חדשחומר פעיל חיזורבמקום להעשיר את התערובת בפעילויות חדשות האופייניות לתרכובת הנוספת, מה שמסיק ממושג סינרגיית המזון.

Cistanche יכול לשפר את החסינות

במחקר הנוכחי, פישטנו את מערכת הניסוי על ידי הגבלתה לשני מבני ליבה בלבד על מנת להתעמק בפרטים של האינטראקציות ביניהם בהקשר של מבנה כימי, תגובתיות חיזור ופעילויות ביולוגיות הקשורות לחיצור, כדי לאפשר הבנה טובה יותר חיזוי של הפוטנציאל המונע כימי של נוגדי חמצון. הפיטוכימיקלים ששימשו למטרה זו היו נוגדי חמצון נפוצים הקיימים בעשבי תיבול, ירקות ופירות שונים, במיוחד בפירות הדר, כלומר: פלבונולים המיוצגים על ידי קוורצטין (O) וה-Rhamno-side-rutin שלו ( R) ו-flavanones על ידי naringenin (N-) ושלוneohesperidosidenaringin (N plus ) וכן שתי תערובות של תרכובות אלו (QN-, RN plus ). ההרכב הכימי של המחקר כלל קביעות שנותנות תובנות מסוימות לגבי התרמודינמיקה והקינטיקה של תהליכי חמצון, בדיקת ieDPPH, טיטרציה פוטנציומטרית ו-DPV דיפרנציאלי. הבדיקות הביולוגיות בחנו את השפעת הדגימות שנחקרו על צמיחת תאים (מבחן MTT), פעילות נוגדת חמצון תאית (CAA assay), גנוטוקסיות (בדיקת שביט), רמת מתילציה גלובלית של DNA (גרסה אפיגנטית של בדיקת שביט), וביטוי של 84 חיזור גנים קשורים (טכנולוגיות מבוססות מערך PCR בזמן אמת). הניסויים הביולוגיים בוצעו באמצעות קו תאי HT29 המומלץ למחקרים תזונתיים, כמודל של אפיתל המעי שעלול להיחשף לריכוזים גבוהים יחסית של נוגדי חמצון שנבלעים.

תוצאות

החקירות המוקדמות שלנו שהשוו תכונות הקשורות לחמצון של אבקת קקאו ומרכיביה העיקריים הצביעו על החשיבות של אינטראקציות בין רכיבים פוליפנוליים של התערובת על פעילות נוגדת חמצון הכוללת. במחקר הנוכחי, פישטנו את מערכת הניסוי כדי לבחון אינטראקציות כאלה ביתר פירוט עבור זוג פלבנואידים שהם רכיבי מזון נפוצים. נבחרו שני פלבנואידים, שניהם בצורה של אגליקונים וגליקוזידים. הפלבנולים היו מיוצגים על ידי quercetin (Q) ושלוrhamnoside-rutin(ר) ופלבנוניםעל ידי naringenin(N-) וה-neohesperidoside שלו naringin (N plus ). פוליפנולים אלו נבדלים במספר ובמיקום של קבוצות הידרוקסיל פעילות חיזור וכן ביכולת ליצור קשרי H תוך מולקולריים, כלומר שלוש תכונות מבניות שעשויות להפריע להפחתת התכונות של תרכובות נוגדות חמצון. כפי שמוצג באיור 1, רדיקלי הסמיקינון הביניים נוצרו בשלב הראשון של החמצון של חלק קטכול בטבעת B

של Q או R ניתן לייצב בשתי דרכים8,19. הדרך הראשונה היא צימוד הן של מבנה הליבה על טבעות B ו-C והן של היווצרות קשר-H השני עם קבוצת OH סביבתית או תחליפים בטבעת C, במיוחד ב-R. נוכחות של קבוצות הידרוקסיל בתחליף סוכר בעמדה 3 של טבעת C עשויה לשפר עוד יותר את אפקט הייצוב הזה עקב אפשרויות רבות יותר של יצירת קשרי H (ישירות או באמצעות מולקולת מים), לעומת זאת, רדיקל הפנוקסיל הביניים ב-N פלוס או N- אינו מתייצב גם על ידי קשרים כפולים מצומדים הכוללים גם טבעת. קשר C או H עם תחליפים שכנים. יתרה מכך, ב-N פלוס, חלק הסוכר מחובר לטבעת A ולכן היא רחוקה מכדי ליצור קשר H עם הרדיקל בטבעת B. ניתן לצפות שתכונות מבניות אלו ישפיעו על פעילות החיזור של הפלבנואידים שנחקרו.

פעילות נוגדת חמצון על ידי בדיקות כימיות.

קביעת תכונות ההפחתה של הפוליפנולים שנחקרו והתערובות שלהם בוצעה על ידי שני מבחנים כימיים ב-37 מעלות צלזיוס כדי להתאים את התנאים התאיים של תהליכי חיזור. השיטה הראשונה הייתה בדיקת ה-DPPH הספקטרופוטומטרית הנפוצה באצווה; התוצאות עבור פלבנואידים בודדים ותערובות שלהם מוצגות באיור 2A. הם מבוטאים כערכי סטוכיומטריה n כאשר המספר 10 מתייחס למשך התגובה - 10 דקות. על ידי הכנסת פרמטר הזמן למדידות, היבט קינטי השתלב בהערכת פעילות נוגדת החמצון כפי שתואר קודם לכן13. בקביעות אלו, שני האגליקונים הציגו תכונות מפחיתות חזקות יותר מגליקוזידים מקבילים כפי שהוכח בעבר גם בבדיקה זו 2021, בעוד שהפלבנולים היו יותר פעיל מאשר פלבנונים. O הייתה התרכובת היעילה ביותר בניקוי DPPHradical ואחריו R. למרות תגובתיות זניחה כלפי DPPH, שני הפלבנונים, כולל N שכשלעצמו לא הראו תכונות חיזור תוך 10 דקות של התגובה, הגדילו באופן משמעותי את הפעילות נוגדת החמצון הכוללת של תערובות, במקרה של שני האגליקונים ON-וגליקוזידים RN פלוס.

השיטה השנייה כללה טיטרציה פוטנציומטרית (PT) המאפשרת מדידה של פוטנציאל ההפחתה הסטנדרטי (E), ובכך העריכה את היכולת התרמודינמית של תרכובות טהורות לצבור אלקטרונים. הערכים שנקבעו של אישר ש-Q ו-R הם תרכובות מפחיתות חזקות (איור 2B). עם זאת, ב-PT, R קיבל אלקטרונים תורמים ברצון רב יותר מאשר Q. קביעת E עבור N- ו-N פלוס לא הייתה אפשרית עקב העברת אלקטרונים איטית מאוד במהלך תהליך החמצון (איטי יותר עבור N פלוס ). PT מודד את ההבדל בפוטנציאל בין אלקטרודת הייחוס לאלקטרודת המדידה לאחר הוספת כל חלק מהטיטרנט. המשמעות של הפוטנציאל היציב היא שמנת התגובה (Q) בין טיטרנט לאנליט היא יציבה (קבוע Q=). אם קצב העברת המטען במהלך תגובה נמוך (זרמים נמוכים בוולטמטריה), אז לוקח הרבה זמן לייצב את ה-Q ב-PT. כתוצאה מכך, עבור תגובות איטיות מאוד, קשה להשיג את עקומת הטיטרציה הפוטנציומטרית ולכן, הערך המצוי של E" פחות אמין.

פעילות נוגדת חמצון על ידי וולטמטריית דופק דיפרנציאלית,

הבדיקות הכימיות בהן נעשה שימוש העלו כי הבהרת הפעולה נוגדת החמצון של פוליפנולים חייבת לקחת בחשבון היבטים קינטיים, שבהם היציבות של רדיקלי ביניים יכולה לשחק תפקיד. כפי שמודגם באיור 1, רדיקלים של semiquinone הנוצרים בשלב הראשון של חמצון פלבנול מיוצבים הרבה יותר מאשר רדיקלי פנוקסיל הנוצרים עם חמצון פלבנון. קשר זה מודגם באיור 1 ועשוי להשפיע על קצב תהליכי החיזור. לכן, תכונות ההפחתה-חמצון של נוגדי חמצון טהורים שנחקרו והתערובות שלהם נותחו עוד יותר בעזרת וולטמטריית דופק דיפרנציאלית (DPV). מכיוון שהטכניקה הזו מאפשרת ניטור של היבטים תרמודינמיים וקינטיים כאחד של תגובות חמצון, שניהם משולבים לבסוף בפרמטר הנקרא כוח נוגד חמצון (AOP)15.

התצפיות שנעשו עם מדידות DPV (איור 2B-F) סתרו את אלו שנרכשו במבחן DPPH (איור 2A). באופן מפתיע, DPV גילה ש-Q שתואר בספרות כמפחית מצוין, כאשר בוחנים היבטים תרמודינמיים בלבד (פוטנציאל שיא אנודי, E.), הוכיח את נוגד החמצון החלש ביותר (איור 2B, C). מבחינה תרמודינמית, R היה נוגד חמצון מעט חזק יותר. מעניין לציין כי N-ו-N פלוס נחשבים בספרות כנוגדי חמצון חלשים, שהציגו מבחינה תרמודינמית את הערכים הגבוהים ביותר של E כלומר היו חומרים מפחיתים חזקים מאוד. עבור שני מחלקות הפלבנואידים, חלק הגליקוזידים הגביר את הפעילות נוגדת החמצון של אגליקונים. עם זאת, פרמטרים הקשורים לקינטיקה (איור 2E, F), כלומר זרם אנודי (I,.) וצפיפות המטען (Q), גילו שחמצון של N פלוס הוא התהליך האיטי יותר בהשוואה לחמצון של Q ו-R. באופן דומה , זרם אנודי (I) היה נמוך יותר עבור N- מאשר עבור Qand R, אך העברת המטען עבור תרכובת זו הגיעה לערך הגבוה ביותר.

במקרה של תערובות, זוהו שני שיאים אנודיים (1 ו-2) על עקומות וולטמטריות כפי שניתן היה לצפות לתערובת הדו-רכיבית. הערכים שנקבעו של פוטנציאל השיא האנודי (E.) הצביעו על כך שהשיא הראשון שנצפה משקף חמצון של פלבנולים, בעוד ש-2"ד שיא החמצון של פלבנונים (חומרים משלימים-איור S1). ברוב המקרים, נוכחות הרכיב השני ב תערובת השפיעה על התרמו-דינמיקה ו/או הקינטיקה של תהליך החמצון בהשוואה לחמצון של התרכובות הטהורות. לדוגמה, עבור QN-, הערך של E., עבור שיא החמצון הראשון היה שווה לפוטנציאל השיא האנודי של Q. חמצון. עם זאת, שיא האנודי של 2 אינץ' המקביל לחמצון N והפוטנציאל של מעבר זה היה גבוה מהפוטנציאל האנודי של N-טהור (איור 2C). המצב ההפוך נצפה לקינטיקה של תגובה זו. ה-I, וה-Q של שיא האנודי של 1s של QN היו קרובים לפרמטרים קינטיים של חמצון של רכיבים טהורים (איור 2E, F), בעוד שהמטען שהוחלף במהלך השלב השני של חמצון ON היה נמוך בהרבה מזה של חמצון N (איור 2F). השפעות תרמודינמיות וקינטיות משולבות אלו הביאו לשיפור ה-AOP(איור 2D) של תערובת זו, אשר תואם את תוצאות מבחן ה-DPPH.

הערכת ציטוטוקסיות.

ההשפעה של האגליקונים הפלבנואידים שנחקרו (Q, N-), גליקוזידים (R, N פלוס) והתערובות שלהם (QN-, RN פלוס ) על צמיחת תאי המעי הוערכה על ידי מבחן MTT. קו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי HT29 נבחר כמודל של אפיתל דרכי העיכול, כלומר הרקמה במגע ישיר עם מרכיבי מזון שנבלעו כמו פוליפנולים. התאים טופלו בפלבנואידים בודדים ובתערובות שלהם בריכוזים פיזיולוגיים שעלולים להתרחש בדם (0.01-1 uM)22-2 או בריכוזים שניתן להגיע אליהם בדרכי העיכול (10-100 uM) לאחר בליעת מזון25-27. עקומות המינון-תגובה עבור טיפולים של 6,24 ו-72 שעות מוצגות באיור 3.

תרכובות בודדות לא השפיעו באופן משמעותי על צמיחת התאים באף אחד מהריכוזים שנחקרו, לא עבור טיפולים קצרים ולא ממושכים. היוצא מן הכלל היה הריכוז הגבוה ביותר של N-שאחרי 72 שעות עיכב את צמיחת התאים עד ל-75 אחוז בהשוואה לבקרה. לעומת זאת, התערובות שנחקרו (QN-, RN פלוס) עוררו באופן משמעותי את צמיחת התאים באופן תלוי ריכוז עבור כל זמני החשיפה שנבדקו. השפעה זו נצפתה בריכוזים נמוכים (0.01-1 uM) וניתן להגיע אליהם בזרם הדם והייתה חזקה עוד יותר בריכוזים גבוהים יותר (10-100 uM) שאליהם תאי אפיתל של מערכת העיכול עלול להיחשף. רק במקרה של הריכוז הגבוה ביותר של QN-, לאחר טיפול של 72 שעות, הגירוי פסק, כנראה עקב השפעות מעכבות שנצפו בתנאים כאלה עבור N-. פעילות נוגדת חמצון תאית. היעילות של פלבנואידים מטוהרים ותערובותיהם בתמיכה במחסום נוגד החמצון האנדוגני של תאי HT29 אומתה בעזרת בדיקת CAA, שיטה זו מסתמכת על יכולתה של דגימה המכילה תרכובות פעילות חיזור לעכב או לקדם את החמצון של הבדיקה הנספגת. על ידי תאים לצורת הפלורסנט שלו. הנחתה של חמצון הבדיקה, הנצפית ככיבוי הקרינה, היא מדד ליכולת הפחתת של נוגדי חמצון בתאים (ערכי CAA חיוביים), בעוד שהעלייה בחמצון הבדיקה מציינת את הפעילות הפרה-חמצונית שלהם (ערכי CAA שליליים)28 . הקביעות בוצעו עבור אגליקונים וגליקוזידים בריכוזים המשקפים חשיפת מעיים פיזיולוגית-אנדוגנית וגם שמקורה במזון. הדגירה עם פלבנואידים שנבדקו בוצעה לתקופה מומלצת סטנדרטית של 1 h18 עבור אגליקונים וגליקוזידים. הטיפולים הממושכים (3 ו-6 שעות) שמטרתם לנטר את הקינטיקה של תגובת החיזור במודל הסלולרי שיושם שימשו רק במקרה של אגליקונים, בגלל השפעתם הבולטת יותר על פעילות נוגדת החמצון התאית.

הפלבנונים והפלבנולים שנחקרו היו שונים בהשפעתם על מצב החיזור של תאי HT29. במקרה של אגליקונים בודדים, התגובות תלויות הריכוז שהוגדרו נצפו לאחר חשיפה של שעה אחת. עם זאת, פלבונול - פעילות נוגדת החמצון של Q עלתה עם יישום הריכוז, בעוד שבמקרה של פלבנון - N- נצפתה שיפור הדרגתי של האפקט הפרו-חמצוני (איור 4A). התלות במינון של גליקוזידים בודדים הייתה פחות ברורה; רק R בריכוז הגבוה ביותר שלו הגביר באופן משכנע את פעילות נוגדת החמצון התאית (איור 4A). באופן מעניין, שתי התערובות הציגו פעילות נוגדת חמצון משופרת, ככל הנראה לא מושפעת מהאפקט הפרו-חמצוני שנראה עבור תרכובות בודדות.

איור 4B מציג את הקינטיקה של שינויים בערכי CAA שנקבעו לאחר טיפול l,3 ו-6 שעות בתאי HT29 עם אגליקונים. עבור הריכוז הנמוך ביותר (1 מיקרומטר), התואם חשיפות פיזיולוגיות, תלות הזמן לא נצפתה גם עבור אגליקונים בודדים או תערובת שלהם. עם זאת, ההשפעות של ריכוז גבוה יותר על ערכי CAA היו תלויות זמן בבירור. החשיפה הממושכת הפחיתה הן את ההשפעה הפרו-חמצונית של N- וגם את הפעילות נוגדת החמצון של Q ו-QN-.

האגליקונים שנחקרו הציגו פעילות תזונתית שונה, ששונתה בנוסף על ידי הריכוז שהופעל על התאים.

Flavanone N-at l μM הפחית משמעותית את הביטוי של CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

פלבנון זה שהוחל על תאי HT29 ב-10 uM השפיע על הביטוי של 5 גנים, אשר גם הווסטו למטה על ידי המינון הנמוך שלו, כלומר: CCL5, CYGB.MT3(p)<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

הפיכה של רדיקלי סופראוקסיד למי חמצן וחמצן6. העלייה הקלה בביטוי הנגרמת על ידי N-ב-10uM נצפתה רק עבור הגן VIMP (0.05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

מאמר זה מופק מ-www.nature.com/scientificreports