איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang והאנג-Ching Lin.

תַקצִיר

Cistanche tubulosa תמצית מימית(CTE) כבר משמשת כתרופת מרשם בוטנית לטיפול בדמנציה בסין. המחקרים הקודמים שלנו דיווחו כי פנילתנואידים גליקוזידים של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית) בעלי פעילות נוגדת מחלת אלצהיימר (AD) על ידי עיכוב הצטברות ושקיעת עמילואיד פפטיד (A ). עם זאת, מחקרים עדכניים סברו שגליקוזידים פנילתנואידים עשויים לעבור חילוף חומרים על ידי חיידקי מעיים מכיוון שכל תוצאות הניתוח הראו שהזמינות הביולוגית של גליקוזידים פנילתנואידים נמוכה ביותר. במחקר זה, אנו מדגימים כיצד קלציית ברזל משחקת תפקיד מכריע במנגנון עיכוב צבירה ותצהיר A שלפנילתנואידים גליקוזידיםשל CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית). בנוסף, הוכחנו עוד יותר שגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) יכולים להגיע למוח. CTE פעיל(Cistanche tubulosa תמצית מימית)אישור רכיבים ומנגנון פעולה יהיה לעזר רב לבקרת איכות המוצר ולמחקרי זמינות ביולוגית בעתיד. במקביל, אנו מספקים שיטת ניתוח חדשה שימושית בקביעת גליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) בצמחים, מזונות, דם ורקמות עבור טביעות אצבע כימיות ומחקר פרמקוקינטי.

מילות מפתח: Cistanche tubulosa; phenylethanoid גליקוזידים; מחלת אלצהיימר; קלציית ברזל

Cistanche tubulosa

1. הקדמה

דמנציה היא אחת ממחלות ההזדקנות הכרוניות הנפוצות ביותר. בשנת 2015 דו"ח האלצהיימר העולמי העריך כי כ-46.8 מיליון אנשים סבלו מדמנציה, והמספר צפוי להיות 74.7 מיליון בשנת 2030 ו-131.5 מיליון בשנת 2050 [1]. אוכלוסיית הדמנציה העולמית תגדל משנה לשנה ותצא מכלל שליטה בעתיד. הוצאות הבריאות העולמיות לטיפול בדמנציה היו כמעט 604 מיליארד דולר ב-2010 והסכום צפוי להיות 1000 מיליארד ב-2030 [2]. לחולי דמנציה יש סיכון גבוה יותר למוות בשוגג [3] ולכן הם זקוקים לטיפול רפואי רב יותר. זהו נטל כבד על המטפלים המשפחתיים של חולי דמנציה. ההשפעה של דמנציה על המטפלים, המשפחה והחברה יכולה לייצר מתח פיזי, פסיכולוגי, חיים וכלכלי גדול. קיימות שתי צורות עיקריות של דמנציה, מחלת אלצהיימר (AD) ודמנציה וסקולרית [4,5]. AD היא הדמנציה השכיחה ביותר והיא הפרעה נוירודגנרטיבית בלתי הפיכה ומתקדמת [4-6]. AD הייתה גורם המוות השישי בשכיחותו בארצות הברית בשנת 2015 [6].

מחקרים אחרונים תומכים כי רעילות הנוירונים המושרה על ידי צבירה של פפטיד עמילואיד (A) (פלאקים) וחלבון טאו (סבכים) קשורה קשר הדוק לפתוגנזה של AD. הצטברות של A וחלבון טאו במוח עלולה להוביל לנזק לנוירונים ולאובדן זיכרון [7]. אוליגומרים A בלתי מסיסים מתקבצים בפלאקים חוץ-תאיים ודווחו כמובילים לחוסר תפקוד סינפטי, רעילות נוירונים ומוות תאי [8]. למרבה הצער, אין טיפול יעיל זמין עד כה כדי לנקות את A וחלבון טאו, או לעכב היווצרות או אוליגומריזציה של A, ולהשהות או לרפא את הנזק הבלתי הפיך לנוירונים. הסוכנים הטיפוליים הנוכחיים, כגון גלנטמין ודונפזיל, שהם מעכבי אצטילכולין אסטראז, יכולים רק לשפר באופן זמני את אובדן הזיכרון על ידי העלאת רמת הנוירוטרנסמיטר. בשנת 2012, אף תרופה מועמדת לא הצליחה להפחית את השפעת A במחקרים קליניים גדולים של חולי AD [9]. לכן, יש צורך במחקר עבור טיפול חדשני לדיכוי שכיחות מחלת האלצהיימר. יוני מתכת נחשבו לאחרונה לגורם מפתח הקשור קשר הדוק לצבירה A [10]. קלאטורי מתכות הנחשבים כתרכובות עופרת פוטנציאליות מספקות אסטרטגיה חדשה לגמרי לגישה נגד AD [9,11-15].

הגבעול המיובש של Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, נקטף באופן נרחב במדבר שינג'יאנג, סין. זוהי רפואה סינית מסורתית חשובה השייכת לרפואה סינית טוניק המופיעה ב-China Pharmacopeia ומשמשת במשך אלפי שנים לטיפול בחולשה גופנית, מחסור בכליות, אי פוריות, שכחה, ​​אימפוטנציה ועצירות סניליות [16,17].תמצית מימית Cistanche tubulosaקפסולות (CTE) אושרו כתרופה בוטנית לדמנציה וסקולרית בסין. על פי ניסוי קליני של 18 חולים שאובחנו עם AD קל עד בינוני, CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)קפסולות העניקו למטופלים מצב זיכרון יציב יותר בהשוואה למעכבי אצטילכולין אסטראז [18]. במחקר הקודם שלנו, ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)הפחתת שקיעת פפטיד עמילואיד (A) ואיבוד זיכרון משופר בחולדות דמויות מחלת אלצהיימר [19]. פנילתנואידים גליקוזידים, אכינאקוסיד (1), אקטאוזיד (2) ואיזו-אקטאוזיד (3) נחשבים למרכיבים העיקריים של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)[20]. לתרכובת 1 פעילות עצבית נגד הרעילות של 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP) [21], 1-מתיל -4-יון פניל ​​פירידיניום (MPP plus ) [22], ו-6-Hydroxydopamine (6-OHDA) [23]. הדו"ח הקודם שלנו הראה ש-1 דיכא אוליגומריזציה ורעילות של A במחקר חוץ-גופני, ועיכב שקיעת A, שיפור בזיכרון לקוי ותפקוד קוגניטיבי בחולדות המושרות על-ידי A [24]. תרכובות 2 ו-3 הגבירו פירוק A והפחיתו אוליגומריזציה במבחנה [25]. תרכובת 3 הפחיתה את שקיעת A בחולדות המושרות על ידי A [25]. בהתבסס על מחקרים אלו, C. tubulosa כבר הוכיחה שיש לה פוטנציאל לטיפול ב-AD. CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)קשור קשר הדוק לצבירה ותצהיר נגד A [24,25]. כדי להבין טוב יותר את ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מנגנון, אנחנו צריכים שתהיה לנו שיטה נוחה ויעילה לזהות את הרכיב הפעיל, כמו גם את התוכן בדגימות רקמת המוח. רוב המחקרים נועדו לקביעה כמותית של אכינאקוסיד, אקטאוזיד ואיזו-אקטאוזיד בצמחי מרפא או במזונות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) [26-28], אך רק שני מחקרים נועדו לקביעה בסרום או ברקמות [29, 30]. עם זאת, אין דיווח על ניתוח סימולטני של 1-3 ברקמות המוח לאחר CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מתן דרך הפה. בנוסף, עדיין לא ברור ממחקרים אחרונים אם ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)רכיבים פעילים או מטבוליטים שלהם עברו בהצלחה דרך מחסום הדם-מוח ופעלו על נוירונים במוח. לכן, מחקר זה מספק שיטה מתקדמת ורגישה עם ראיות משכנעות הממחישות בבירור את המנגנון הבסיסי של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)נגד צבירה ותצהיר A.

Cistanche tubulosa תמצית מימית

2. תוצאות

2.1. בידוד וזיהוי של שלוש תרכובות עיקריות (1-3)

גבעולים מיובשים של C. tubulosa חולצו עם 75 אחוז EtOH בטמפרטורת החדר. תמצית ה-EtOH המעובה של 75 אחוז נערכה לכרומטוגרפיה של שרף ועמודה C18 כדי לספק שלוש תרכובות עיקריות, אכינאקוסיד (1), אקטאוזיד (2) ואיזו-אקטאוזיד (3). המבנים שלהם הובהרו על ידי ניתוח של ספקטרוסקופיה NMR (תהודה מגנטית גרעינית) ו- ESI-MS (מסת יינון אלקטרוספריי) ועל ידי השוואה עם נתוני ספרות [31-33] (איור 1, חומרים משלימים איורים S3-S11).

2.2. בדיקת התוכן של פנילתנואידים גליקוזידים (1-3) מ-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)

שיטת הבדיקה אומתה לניתוח פנילתנואידים גליקוזידים. תרכובות 1-3 (5.0 מ"ג) נשקלו במדויק ועורבבו עם 50 אחוז מתנול (40 מ"ל). התערובות עברו צלילים למשך 5 דקות. שלושה תמיסת סטנדרטית של פנילתנואידים (1-3) עורבבו כתמיסת המניות הסטנדרטית (100 מיקרוגרם/מ"ל). תמיסת המניות הסטנדרטית שימשה להכנת חמישה ריכוזים שונים (5,10, 25, 50 ו-100 מיקרוגרם/מ"ל) של התמיסות המצוינות, בהתאמה, על ידי דילול בנפחים סדרתיים של 50 אחוז מתנול. עקומות הגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) נקבעו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית (UPLC) מ-5-100 מיקרוגרם/מ"ל והיו ליניאריות בהתאמה (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). הדיוק התוך-יומי והבין-יומי [אחוז RSD (סטיית תקן יחסית) היה מ-0.1 ל-1.8 אחוז] והדיוק (95.6-104.2 אחוז) היה מקובל על-ידי UPLC עבור 1-3. UPLC כימתה את ה-1, 2 ו-3 של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)התכולה תהיה 254, 38 ו-41 מ"ג/ג', בהתאמה (איור S2)

2.3. אימות UPLC/MS/MS

הגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) עורבבו והוסרו עם הומוגנית של רקמת מוח של חולדה ונותחו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם ספקטרומטר (UPLC/MS/MS) עם מיצוי פאזה מוצקה. הגבול התחתון של זיהוי (LLOQ) של 1-3 היה 0.2 ng/mL. התאוששות הגליקוזידים של פנילתנואידים ספגה בהומוגנית של רקמת המוח (10 ננוגרם/מ"ל) ב-91.39 אחוז עבור 1, 89.54 אחוז עבור 2 ו-96.81 אחוז עבור 3, בהתאמה (איור 2).

2.4. ניתוח רקמות מוח של חולדה דמויי AD

לאחר 14 יום של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מתן אוראלי (200 מ"ג/ק"ג/יום), רקמות מוח של חולדה דמויות AD נאספו וחולקו לשני חלקים, היפוקמפוס וסטריאטום, ושניהם הומוגגו [19]. מכיוון שההומוגנטים של ההיפוקמפוס והסטריאטום מכל חולדה היו מועטים מכדי להיטען לחילוץ מוצק וכדי למנוע טעויות ניסוייות מוגזמות, ההומוגנטים של ההיפוקמפוס והסטריאטום מארבע חולדות בודדות עורבבו לדגימה מנותחת עבור UPLC/MS/MS באמצעות שיטת מיצוי שלב מוצק (איור 3A, B). הגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) נצפו בהיפוקמפוס (איור 3A) ובסטריאטום (איור 3B). לא היה שיא משמעותי ברקמות מוח ריקות (איור 3C). בהיפוקמפוס תכולת האכינאקוסיד הייתה 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, תוכן אקטאוזיד היה 1.25 ± 0.16 ng/mL, ותכולת איזואקטאוזיד הייתה 1.38 ± 0.08 ng/ מ"ל. בסטריאטום תכולת האכינאקוסיד הייתה 22.60 ± 1.69 ng/mL, תכולת האקטאוזידים הייתה 2.03 ± 0.61 ng/mL, ותכולת האיזואקטאוזידים הייתה 4.90 ± 0.64 ng/mL. כפי שמוצג באיור 4, ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)יעבור דרך מחסום הדם-מוח לפי הכמויות המשמעותיות שניתן לזהות של 1-3 בהיפוקמפוס ובסטריאטום. התוכן של 1 גבוה בהרבה מ-2 ו-3 ב-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)על ידי ניתוח UPLC (איור S2). לכן, סביר לראות ש-1 הוא הגבוה ביותר ברקמת המוח לאחר CTE אוראלי(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מִנהָל. מולקולות 2019, 24, x לסקירת עמיתים 4 מתוך 12 2.4. ניתוח של רקמות מוח של חולדה דמויי AD לאחר 14 ימים של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מתן אוראלי (200 מ"ג/ק"ג/יום), רקמות מוח של חולדה דמויות AD נאספו וחולקו לשני חלקים, היפוקמפוס וסטריאטום, ושניהם הומוגגו [19]. מכיוון שההומוגנטים של ההיפוקמפוס והסטריאטום מכל חולדה היו מועטים מכדי להיטען לחילוץ מוצק וכדי למנוע טעויות ניסוייות מוגזמות, ההומוגנטים של ההיפוקמפוס והסטריאטום מארבע חולדות בודדות עורבבו לדגימה מנותחת עבור UPLC/MS/MS באמצעות שיטת מיצוי שלב מוצק (איור 3A, B). הגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) נצפו בהיפוקמפוס (איור 3A) ובסטריאטום (איור 3B). לא היה שיא משמעותי ברקמות מוח ריקות (איור 3C). בהיפוקמפוס תכולת האכינאקוסיד הייתה 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, תוכן אקטאוזיד היה 1.25 ± 0.16 ng/mL, ותכולת איזואקטאוזיד הייתה 1.38 ± 0.08 ng/ מ"ל. בסטריאטום תכולת האכינאקוסיד הייתה 22.60 ± 1.69 ng/mL, תכולת האקטאוזידים הייתה 2.03 ± 0.61 ng/mL, ותכולת האיזואקטאוזידים הייתה 4.90 ± 0.64 ng/mL. כפי שמוצג באיור 4, ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)יעבור דרך מחסום הדם-מוח לפי הכמויות המשמעותיות שניתן לזהות של 1-3 בהיפוקמפוס ובסטריאטום. התוכן של 1 גבוה בהרבה מ-2 ו-3 ב-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)על ידי ניתוח UPLC. לכן, סביר לראות ש-1 הוא הגבוה ביותר ברקמת המוח לאחר CTE אוראלי(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מנהל.

2.5. פעילות הגליקוזידים של פנילתנואידים (1-3) מתכת צ'לאטית

בספרות, קביעת התרכובות החופשיות וקומפלקס המתכת שלהן בוצעה באמצעות HPLC [34,35]. המדד של פעילות הקלציה נותח על ידי UPLC במחקר זה. התמיסות של 50 מיקרוגרם/מ"ל של כל גליקוזיד פנילאתנואיד (1-3) נוספו לתמיסת 10 מיקרוגרם/מ"ל של נחושת (Cu), סידן (Ca), מגנזיום (Mg), אבץ (Zn), ברזל (Fe) או סרום עכברים בהתאמה. כל תרכובת עם כל תמיסת מתכת או סרום נותחה על ידי UPLC. הגליקוזידים של פנילאתנואידים (1-3) הפגינו פעילות קלצית מתכת עם ברזל וסרום (איור 5, חומרים משלימים איור S1). מולקולות 2019, 24, x לסקירת עמיתים 5 מתוך 12 דגימות מחולדות דמויות AD לאחר CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מתן אוראלי (200 מ"ג/ק"ג, po) [1 (tR= 4.19 דקות), 2 (tR= 5.13 דקות) ו-3 (tR= 5.68 דקות)] . (ג) רקמת מוח ריקה. איור 4. גליקוזידים phenylethanoid (1-3) היו ניתנים לזיהוי ברקמות מוח של חולדה [19] באמצעות UPLC/MS/MS. הנתונים מיוצגים ממוצע ± SD, n=3 עבור כל קבוצה. 2.5. פעילות ה-Penylethanoid Glycosides (1-3) מתכת Chelating. בספרות, קביעת התרכובות החופשיות וקומפלקס המתכת שלהן בוצעה באמצעות HPLC [34,35]. המדד של פעילות הקלציה נותח על ידי UPLC במחקר זה. התמיסות של 50 ug/mL של כל פנילאתנואיד גליקוזיד (1-3) נוספו לתמיסת 10 ug/mL של נחושת (Cu), סידן (Ca), מגנזיום (Mg), אבץ (Zn), ברזל (Fe) או סרום עכברים בהתאמה. כל תרכובת עם כל תמיסת מתכת או סרום נותחה על ידי UPLC. הגליקוזידים של פנילתנואידים (1-3)

2.6. ניתוח של Echinacoside (1) בסרום עכברוש ב-Vivo

על מנת להבין את התפלגות אכינאקוסיד בסרום חולדות, הסרום נאסף מהזמן הראשוני ועד 720 דקות לאחר מתן אכינאקוסיד (1) דרך הפה (100 מ"ג/ק"ג) והסרום נאסף מהזמן הראשוני ועד 720 דקות לאחר אכינאקוסיד. (1) מתן אוראלי (100 מ"ג/ק"ג) ונותח על ידי UPLC. איור 6 הראה את פרופילי הריכוז לעומת הזמן של echinacoside בסרום של חולדה.

3. דיון

דמנציה, במיוחד AD, היא הזדקנות בלתי הפיכה ומחלה כרונית שמובילה לקשר גורדי של שאלות. מחלה בלתי עבירה זו מובילה לבעיות כלכליות חמורות עם נטל כלכלי עצום והולך וגובר. ברחבי העולם, חוקרי AD משקיעים מאמצים רבים כדי לחקור תרופות חדשות נגד AD, אך נכשלו במספר ניסויים קליניים גדולים המכוונים ל-A בשנת 2012 [9]. מלבד מיקוד ישיר ל-A, הומאוסטזיס של יוני מתכת במוח נחשב לסיבה העיקרית הקשורה לצבירה ותצהיר A שמובילים להיווצרות AD [9,10]. לכן, יוני מתכת ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה של AD, והשערת קלציית המתכת הפכה לכיוון מחקר חשוב [9,13-15].

על פי המחקרים הקודמים שלנו [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)הראה פעילות פוטנציאלית נגד דמנציה. אפילו במחקרים קליניים בבני אדם, לאחר שנה של טיפול ב-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)כמוסות לחולי אלצהיימר בינוני, ציון הסולם-קוגניטיבי של מחלת אלצהיימר (ADAS-cog) לא יראה הידרדרות משמעותית בהשוואה לפני הטיפול [18]. CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)שמר על יציבות ציון ADAS-cog של חולי AD, אך תרופות מרשם אחרות לא. הבחירה היחידה של תרופות מרשם המורשות לטיפול ב-AD היא מעכבי אצטילכולין אסטראז (AChEIs) כגון דונפזיל וגלנתמין המשפרים את תסמיני ה-AD בטווח הקצר, אך הידרדרות מתרחשת לאחר שנה של טיפול [36]. מבוסס על מחקרים קליניים, CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)יש הזדמנות להיות טיפול פוטנציאלי לפיתוח תרופות נגד AD. בהתבסס על הדיווחים הקודמים שלנו [24,25], אכינאקוסיד (1), אקטאוזיד (2) ואיזו-אקטאוזיד (3) יגנו על נוירונים מנזק על ידי A, יפחיתו אוליגומריזציה של A במבחנה וישפרו באופן משמעותי חוסר תפקוד קוגניטיבי שנגרם על ידי A in vivo. המחקר במבחנה הראה שהמינונים הפעילים של 1-3 היו עד 50 ug/mL [24,25]. אבל מחקרים קודמים סברו שהזמינות הביולוגית דרך הפה של 1 ו-2 הייתה נמוכה מאוד (0.83 אחוז עבור 1 ו-0.12 אחוז עבור 2) בחולדות [29,30]. אפילו לא ניתן היה לזהות תרכובת 1 בסרום אנושי לאחר מתן טבליות אכינצאה דרך הפה [37]. מחקרים עדכניים מראים של-1-3 היו חדירות וספיגה לקויה של הממברנה בתאי המעי [38] ורוב ה-1 יעבור מטבוליזם בצינורות העיכול [39]. תכולת תרכובת 2 בסרום חולדות הייתה רק כ-4.5 ug/mL לאחר 15 דקות של הזרקה תוך ורידית עם מינון של 10 מ"ג/ק"ג של אקטאוזיד [30]. עם זאת, מחקר זה מראה כי 1-3 יתגלו בהיפוקמפוס ובסטריאטום של רקמות מוח של חולדה לאחר CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)מתן דרך הפה (איורים 3 ו-4). בנוסף, איור 6 הראה שתכולת תרכובת 1 בסרום חולדות עלתה בערך פי 5 מ-15 דקות ל-720 דקות לאחר מתן אוראלי של תרכובת 1 (100 מ"ג/ק"ג). שקלנו phenylethanoid גליקוזידים של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)יעבור דרך מחסום הדם-מוח ותהיה פעולת קלציה בין CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)והמתכת. קלציה היא תגובה כימית הפיכה. ברזל הוא המרכיב החיוני בסרום ובמוח [10,40]. איור 5 מראה שלשלושה גליקוזידים של פנילאתנואידים תהיה פעילות קלצית מתכת עם ברזל וסרום. ברור שברזל וסרום משנים את אזור זמן השיא של שלושה פנילתנואידים גליקוזידים. קלציית ברזל עשויה להיות הסיבה המכרעת המובילה לזיהוי שגוי של הזמינות הביולוגית הנמוכה מאוד של גליקוזידים של פנילאתנואידים. לפיכך, יש לשקול את פעילות קלציית המתכת בניתוח סרום הדם והמוח של שלושת ה-CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית)phenylethanoid גליקוזידים כדי לשחזר את הזמינות הביולוגית האמיתית ואת הפרמקוקינטיקה. בנוסף, התוצאות הצביעו על שלושה פנילתנואידים גליקוזידים (1-3) יעברו דרך מחסום הדם-מוח ויגיעו לרקמות המוח דרך מחזור הגוף. מחקר זה פיתח שיטה מהירה ורגישה ביותר לניתוח 1-3 באמצעות UPLC/MS/MS וסיפק ראיות חזקות להוכחה שגליקוזידים פנילתנואידים (1-3) הם המרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים של CTE(Cistanche tubulosa תמצית מימית).

תמצית Cistanche tubulosa

4. חומרים ושיטות

4.1. חומר צמחי

גבעולים של C. tubulosa נאספו במאי 2016 מהאנגג'ואו, סין. הצמח זוהה על ידי ד"ר לין HC דגימות שובר (מס' 20016CT) הופקדו ב-Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, סין.

4.2. בידוד וטיהור

גבעול C. tubulosa המיובש נטחן לאבקה, ולאחר מכן חולץ חמש פעמים עם 75 אחוז EtOH. לאחר אידוי ממס בלחץ מופחת, התמצית הגולמית עברה כרומטוגרפיה של עמודה Macroporousresin AB-8 עם מערכות ממס שיפוע H2O/EtOH מ-20 אחוז EtOH עד 100 אחוז EtOH. על פי כרומטוגרפיית השכבה הדקה, נאספו ארבעה חלקים (Fr.1~Fr.4) להפרדה נוספת. Fr. 2 עבר כרומטוגרפיה נוזלית הכנה (HPLC) על עמודת COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 מ"מ × 20 מ"מ id, 5 מיקרומטר) תוך שימוש באצטוניטריל של 18 אחוז כמערכת הפאזה הניידת. קצב העמית היה 15 מ"ל/דקה. שלושה שיאי עניין עיקריים נאספו באופן סלקטיבי. החלקים המכילים את התרכובות הממוקדות עובו עוד יותר ליובש וייצרו 1, 2 ו-3, בהתאמה.

4.3. ניתוח ניסוי

ספקטרום NMR של 1H ו-13C התקבלו באמצעות ספקטרומטרים Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, ארה"ב) עם טטרמתילסילאן (TMS) כסטנדרט הפנימי. HPLC הכנה בוצע באמצעות עמודת פאזה הפוכה (עמודה Cosmosil C18-AR-II, 250 מ"מ × 20 מ"מ id; NacalaiTesque, Inc., קיוטו, יפן) על סדרת Shimadzu LC-6AD מכשיר עם Prominence HPLC UV-Visdetectors (קיוטו, יפן).

Echinacoside (1):אבקה לבנה; ESI−MS m/z: 785 [M - H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz):δ 1.07 (1H, d, J=6.2 הרץ, Rha-H{{10} }), 2.79 (2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3.56 (1H, m, Ha{{20}}), 3.79 (1H, m, H-30 ),3.91 (1H, m, Hb-8), 4.29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4.38 (1H, d, J=7.9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40), 5.17(1H, d, J=1.5 Hz, Rha-H-1), 6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-800), 6.58 (1H, dd, J=8.1,2.0 Hz,H-6), 6.67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6.70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H{ {86}} ), 6.94 (1H,dd, J=8.3, 2.0 Hz, H-600 ), 7.05 (1H, d, J=2.0 Hz, H{ {100}} ), δ 7.59 (1H, d, J=15.9 Hz, H-700 ); 13C-NMR(CD3OD, 125 מגה-הרץ): δ 18.5 (Rha-C-6), 36.6 (C-7), 62.6 (Glc-C-6), 69.4 (C{{ 124}}), 70.5 (C-40), 70.6 (Rha-C-5),71.5 (Glc-C-4), 72.0 (Rha-C-3) , 72.3 (C-8), 72.4 (Rha-C-2), 73.8 (Rha-C-4), 74.7 (C-50), 75.1 (Glc-C -2),76.1 (C-20), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30) , 103.1 (Rha-C-1), 104.2 (C-10), 104.7 (Glc-C-1),114.7 (C-200), 115.3 (C{{{) 188}}), 116.3 (C-500), 116.5 (C-2), 117.1 (C-5), 121.3 (C-6), 123.3 (C{{ 203}}), 127.6 (C-100), 131.5 (C-1), 144.7 (C-3), 146.1 (C-4), 146.9 (C{{ 218}}), 148.2 (C-700), 149.8 (C-300), 168.5 (C-900) (איור S3–S5)

אקטאוזיד (2):אבקה לבנה; ESI−MS m/z: 623 [M - H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94(3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}} ), 2.68 (2H, m, H-7), 4.33 (1H, d, J=7.8 Hz, H{{20}} ), 4.70 (1H, t, J=9.0 Hz, H-400 ),5.01 (1H, s, H-1000), 6.18 (1H, d, J=15 .9 הרץ, H-80), 6.48 (1H, dd, J=7.9, 1.4 הרץ, H-6), 6.62 (1H, d, J=7 .1Hz, H-5), 6.73 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.75 (1H, d, J=7.9 Hz , H-50 ), 6.97 (1H, d, J=8.1 Hz, H-60 ),7.01 (1H, s, H-20 ), 7.44 (1H , d, J=15.8 הרץ, H-70); NMR 13C: (DMSO-d6, 125 מגה-הרץ): δ 18.2 (C-6000), 35.1(C-7), 60.8 (C-600), 68.8 (C{{94} } ), 69.2 (C-400), 70.3 (C-3000), 70.3 (C-8), 70.4 (C-2000), 70.6 (C{{109} }), 71.7 (C-500), 74.5 (C-200), 79.2 (C-300), 101.3 (C-1000), 102.3 (C{{124} } ), 113.6 (C-80), 114.7 (C-20), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50), 116.3 (C{{139} }), 119.6 (C-6), 121.5 (C-60), 125.6 (C-10), 129.2 (C-1), 143.6 (C{{154} }), 145.0 (C-3), 145.0 (C-30), 145.6(C-70), 148.5 (C-40), 165.7 (C{{169} } ) (איורים S6-S8).

איזו-אקטאוזיד (3):אבקה לבנה; ESI−MS m/z: 623 [M - H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} }), 2.65 (2H, m, H-7), 4.35 (1H, d, J=10.0 Hz, H-100), 5.10 (1H, s, H{{ 24}} ),6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-80 ), 6.45 (1H, dd, J=8.0, 1.8 Hz, H{{ 38}}), 6.58 (1H, d, J=8.8 Hz, H-5), 6.73(1H, d, J=1.6 Hz, H{{50} }), 6.74 (1H, d, J=8.1 הרץ, H-50), 6.94 (1H, d, J=8.2 הרץ, H-60) , 7.04 (1H, s, H-20 ),7.46 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 מגה-הרץ): δ 17.9 (C-6000), 35.2 (C-7), 63.5 (C-600), 68.2 (C-5000 ), 70.4 (C-400), 70.6 (C-3000), 71.7 (C-8), 72.1 (C-2000), 73.7 (C-4000 ), 74.1 (C-500), 74.5 (C-200), 80.9(C-300), 100.7 (C-1000), 102.7 (C-100 ), 113.9 (C-20), 114.9 (C-80), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50), 116.3 (C-2 ), 119.6(C-6), 121.5 (C-60), 125.5 (C-10), 129.2 (C-1), 143.5 (C-4 ), 145.0 (C-3), 145.3 (C-30), 145.6 (C-70), 148.5 (C-40), 165.6 (C-90 ) (איורים S9–S11).

4.4. הכנת תמצית מימית Cistanche Tubulosa (CTE)

גזע אבקת Cistanche tubulosa חולץ פעמיים על ידי ריפלוקס עם מים למשך 1.5 שעות, ותמיסת התמצית סוננה. המסונןCistanche tubulosaתמצית מימית(CTE) אוחסן ב-4 ◦C לפני השימוש.

5. מסקנות

מחקר זה הראה כי 1-3 הוא המרכיב הפעיל של CTE לפעילות נגד AD. קלציית ברזל הפכה למושג החדש לעיצוב דור חדש של תרופות לטיפול ב-AD [41]. CTE היא תרופה בוטנית פוטנציאלית נגד AD רפואה סינית המתמקדת בהצטברות ותצהיר A הנגרמת על ידי קלציית ברזל. בנוסף, הוכחנו עוד ש-1-3 יגיעו למוח דרך מחסום הדם-מוח (BBB). רכיבים פעילים ואישור המנגנון הבסיסי של CTE יסייעו רבות לבקרת האיכות והזמינות הביולוגית של מחקרי מוצרים בעתיד. יחד עם זאת, שיטת הניתוח המתקדמת והיעילה המוצגת תהיה שימושית בקביעת 1-3 בצמחים, מזונות, דם ורקמות מוח עבור טביעות אצבע כימיות ומחקר פרמקוקינטי.

הפניות

1. וו, YT; בייזר, א.ס.; Breteler, MMB; פראטיגליוני, ל. הלמר, ג; הנדרי, HC; הונדה, ח.; איכרם, מ"א; לנגה, ק"מ; לובו, א.; et al. השכיחות והשכיחות המשתנה של דמנציה לאורך זמן - עדויות עדכניות. נאט. כומר נוירול. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. רובינסון, ל. טאנג, ע.; טיילור, JP דמנציה: אבחון בזמן והתערבות מוקדמת. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. מיטשל, ר.; דרייפר, ב.; הארווי, ל.; ברודטי, ח.; Close, J. ההישרדות והמאפיינים של אנשים מבוגרים עם ובלי דמנציה המאושפזים בעקבות פגיעה עצמית מכוונת. Int. י.גריאטר. פסיכי. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. אוט, א.; ברטלר, מ"מ; ואן הרסקאמפ, פ.; קלאוס, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; הופמן, א. שכיחות מחלת אלצהיימר ודמנציה וסקולרית: קשר עם חינוך. המחקר ברוטרדם. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; אריזגה, ר.; פרידלנד, RP; Galasko, D.; הול, ק.; Luchsinger, JA; Oguniyi, A.; פרי, EK; פוטוצ'ניק, פ.; et al. מחלת אלצהיימר ודמנציה וסקולרית במדינות מתפתחות: שכיחות, ניהול וגורמי סיכון. אִזְמֵל. נוירול. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. עובדות ונתונים על מחלת אלצהיימר לשנת 2018. דמנט אלצהיימר. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. הרדי, ג'יי; Selkoe, DJ השערת העמילואיד של מחלת אלצהיימר: התקדמות ובעיות בדרך לטיפול. מדע 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM מחלת אלצהיימר. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. אייטון, ש.; ליי, פ.; Bush, AI Metallostasis במחלת אלצהיימר. רדיק חופשי. ביול. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. קים, AC; לים, ש; Kim, YK השפעות יוני מתכת על צבירת A ו-Tau. Int. י.מול. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. רוברט, א.; ליו, י.; נגוין, מ.; Meunier, B. ויסות הומאוסטזיס נחושת וברזל על ידי chelators מתכות: כימותרפיה אפשרית למחלת אלצהיימר. A. Chem. מילון 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Copper(I) chelators למחלת אלצהיימר. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. סנטוס, MA; צ'אנד, ק.; Chaves, S. התקדמות אחרונה בכללטרי מתכת רב תכליתיים כתרופות פוטנציאליות למחלת אלצהיימר. קוורד. Chem. Rev. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. ד'אקונטו, CW; קפלנק, ר.; גבלקובה, ח.; קג'יק, ז; בריזה, ט.; ואסינה, ל. האבליק, מ.; רומל, ט; Kral, V. Metallomics לטיפול במחלת אלצהיימר: שימוש בדור חדש של chelators המשלבים תכונות התקשרות מתכת-קטיון והובלה. יורו J. Med. Chem. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. וואנג, X.; וואנג, X.; Guo, Z. Theranostics המעורבים במתכת: אסטרטגיה מתפתחת למלחמה במחלת האלצהיימר. קוורד. Chem. Rev. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. שאו, ML; מא, XW; וו, ז.; יו, WM; Chen, XN Pharmacopoeia סינית; הוצאה כימית ותעשייתית: בייג'ינג, סין, 2005; ע. 90.

17. לי, ז; לין, ה.; גו, ל.; גאו, ג'; צנג, סי-מ. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): אחת המתנות הפרמצבטיות הטובות ביותר של הרפואה הסינית המסורתית. חֲזִית. פרמקול. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. גואו, ש.; ג'ואו, י.; וואנג, CJ; Huang, YM; לי, YT; סו, MH; Lu, J. מחקר פתוח, לא מבוקר פלצבו, על כמוסות Cistanche tubulosa glycoside (תזכורת חוזרת (R)) לטיפול במחלת אלצהיימר בינונית. אמ. ג'יי אלצהיימר דיס. דמן אחר. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. וו, CR; לין, HC; Su, MH היפוך על ידי תמציות מימיות של Cistanche tubulosa מחסרים התנהגותיים במודל חולדה דמוי מחלת אלצהיימר: רלוונטיות לתצהיר עמילואיד ותפקוד נוירוטרנסמיטר מרכזי. השלמה של BMC. אלטרנט. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. וואנג, י.מ; ג'אנג, SJ; Luo, GA; הו, י.נ.; Hu, JP; ליו, ל.; ז'ו, י.; Wang, HJ ניתוח של גליקוזידים פנילתאנואידים בתמצית של עשב ציסטנצ'יס על ידי LC/ESI-MS/MS. אקטה פארם. סיניק. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; טיאן, XF; טו, PF; Pu, XP השפעות נוירו-הגנה של echinacoside במודל MPTP של עכבר של מחלת פרקינסון. יורו J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; יאנג, X.; קאי, ד.; אתה, ל.; הו, י.; ג'אנג, ל.; צ'נג, ג'; שן, י.; וואנג, ק.; Bai, Y. Echinacoside מגן מפני אפופטוזיס עצבי המושרה על ידי MPP( plus ) באמצעות ויסות מסלול ROS/ATF3/CHOP. Neurosci. שׁוֹר. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. וואנג, י"ה; שואן, ZH; טיאן, ש.; Du, GH Echinacoside מגן מפני 6-הפרעה בתפקוד המיטוכונדריאלי המושרה על ידי הידרוקסידופאמין ותגובות דלקתיות בתאי PC12 באמצעות הפחתת ייצור ROS. Evid. משלים מבוסס. אלטרנטיבה. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; סו, MH; לין, HC; Wu, CR Echinacoside משפרים את ליקוי הזיכרון ואת החסר הכולינרגי הנגרם על ידי פפטידים עמילואיד-ביתא באמצעות עיכוב של שקיעת עמילואיד וטוקסיקולוגיה. פונקציית אוכל. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; סו, MH; לין, HC; Wu, CR אקטאוזיד ואיזו-אקטאוזיד מגנים על ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי עמילואיד-בטא פפטיד, ליקוי קוגניטיבי והפרעות נוירוכימיות ב-Vitro וב-Vivo. Int. י.מול. Sci. 2017, 18. [CrossRef]