אינדוקציה של חסינות רירית על ידי מתן ריאתי של ננו-חלקיק המכוון לתא

תַקצִיר

גילינו בעבר שננו-חלקיק שנבנה עם אנטיגן, בנזלקוניום כלוריד (BK) וחומצה c-polyglutamic (c-PGA) הראה אינדוקציה חיסונית גבוהה מסוג Th1 ו- Th2- לאחר מתן תת עורי. עם זאת, למניעת זיהומים בדרכי הנשימה, יש לעורר חסינות רירית. במחקר זה, חקרנו את ההשפעה של מתן ריאתי של ננו-חלקיק הכולל אולבומין (OVA) כאנטיגן מודל, BK ו-c-PGA על השראת חסינות רירית בריאות ובנסיוב.

הקומפלקס נקלט בחוזקה על ידי תאי RAW264.7 ו-DC2.4. לאחר מתן ריאתי, שימור הריאות היה ארוך יותר עבור קומפלקס OVA/BK/c-PGA מאשר עבור OVA בלבד. אימונוגלובולין (Ig)G בסרום ספציפי ל-OVA הושרה מאוד על ידי הקומפלקס. רמות גבוהות של IgG ו-IgA נגרמו גם בנוזל השטיפה הסימפונות-אלוואולרית, וב-vivo לא נצפו רעילות. לסיכום, גרמנו ביעילות ובבטחה חסינות רירית על ידי מתן ריאתי של קומפלקס OVA/BK/c-PGA.

בשנים האחרונות, יותר ויותר מחקרים הראו כי לחסינות הרירית תפקיד חשוב במערכת החיסון של הגוף. חסינות הרירית מתייחסת למערכת החיסונית המבוססת על הקרום הרירי בגוף האדם, ויכולות ההגנה שלה מכוונות בעיקר לפלישה של פתוגנים בריריות האדם כמו מערכת הנשימה, מערכת העיכול ומערכת הרבייה.

חסינות הרירית עצמה לא הופכת את הגוף לחסין יותר, אבל היא יכולה לעזור לגוף שלנו להתמודד עם פלישת פתוגנים זרים בצורה יעילה יותר. על ידי גירוי מתמיד של חסינות הרירית, הגוף שלנו מייצר יותר נוגדנים, מה שמגביר את החסינות שלנו.

אז איך ניתן לעורר חסינות רירית? להלן מספר הצעות:

1. קבל מספיק ויטמין C. ויטמין C הוא נוגד חמצון טבעי המגביר את תפקוד תאי החיסון, המסייע להילחם בזיהומים. פירות וירקות עלים ירוקים כמו לימונים, תפוזים ותותים עשירים בוויטמין C.

2. להגביר את צריכת חיידקי חומצת החלב. חיידקי חומצת חלב יכולים לקדם את האיזון של פלורת המעיים ולעכב את הצמיחה של חיידקים מזיקים. מזונות נפוצים של חיידקי חומצת חלב כוללים יוגורט, כרוב כבוש, קימצ'י וכו'.

3. תרגול נשימות נשימות עמוקות. נשימה עמוקה מגבירה את אספקת החמצן והאוורור לריאות, מה שיכול לעזור להסיר פתוגנים שהצטברו מהריאות.

בקיצור, גירוי חסינות הרירית הוא אמצעי חשוב לשיפור חסינות. עלינו לנסות כמיטב יכולתנו לשפר את חסינות הרירית שלנו באמצעות תזונה והרגלי חיים, כדי להגן על בריאותנו. מנקודת מבט זו, עלינו לשפר את החסינות. Cistanche יכול לשפר משמעותית את החסינות מכיוון שאפר בשר מכיל מגוון רכיבים פעילים ביולוגית, כגון פוליסכרידים, שתי פטריות והואנג לי, שיכולים לעורר את מערכת החיסון. סוגים שונים של תאים, מגבירים את פעילותם החיסונית.

תוסף לחץ cistanche deserticola

1. הקדמה

זיהומים חריפים בדרכי הנשימה הם כמעט בוודאות הגורם המוביל למוות בקרב ילדים מתחת לגיל 5 במדינות מתפתחות (Williams et al., 2002). מספר חיסונים, כגון אלה לשפעת, שעלת ופנאומוקוק, פותחו לזיהומים בדרכי הנשימה (White, 1988; Pittman, 1991; Chen et al., 2020). רוב החיסונים הללו ניתנים בנתיבים תוך-שריריים ותת-עוריים, שיכולים לגרום ביעילות לאימונוגלובולין בסרום (Ig)G. עם זאת, מסלולים אחרים שימושיים יותר כדי לעורר חסינות רירית למניעת זיהומים חריפים בדרכי הנשימה. דיווחים על מתן רירית, כגון תוך-אף וריאתי, מעוררים ביעילות IgA רירית ומונעים זיהומים בדרכי הנשימה (Giri et al., 2005; Ainai et al., 2017).

מצד שני, חיסונים למתן תוך-אף וריאתי אינם אמורים להכיל אדג'ובנטים שדווחו כגורמים לתגובות דלקתיות ולכיבים באתר המתן (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). גישה נוספת לשיפור היעילות של חיסונים ללא אדג'ובנטים היא לפתח מערכת שיכולה לספק חיסונים ביעילות לתאים מציגי אנטיגן רירית (APCs).

במחקר קודם, פיתחנו וקטור מתן חיסון חדש שנבנה עם אנטיגן, בנזלקוניום כלוריד (BK) וחומצה c-פוליגלוטמית (c-PGA). קומפלקס הכולל אולבומין (OVA) כדגם אנטיגן, BK ו-c-PGA (קומפלקס OVA/BK/c-PGA) העבירו OVA ביעילות לתאים דנדריטים ושיפרו אינדוקציה של IgG בסרום ספציפי ל-OVA לאחר מתן תת עורי לעכברים (Kurosaki וחב' ., 2012). מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את ההשפעה של מתן ריאתי של קומפלקס OVA/BK/c-PGA על השראת חסינות רירית בריאות ובנסיוב.

2. חומרים ושיטות

2.1. כימיקלים

OVA נרכש מ-Sigma-Aldrich (סנט לואיס, MO, ארה"ב). BK הושג מ-Nacalai Tesque, Inc. (קיוטו, יפן). ה-c-PGA סופק על ידי Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (טוקיו, יפן). התקבלו מ-Invitrogen (Carls, קליפורניה, ארה"ב) עם איזותיוציאנט פלואורשאין שכותרתו OVA (FITC-OVA) ו- Alexa Fluor 647-מסומנת OVA (Alexa647- OVA). סרום בקר עוברי (FBS) נרכש מחברת תעשיות ביולוגיות בע"מ (קיבוץ בית העמק, ישראל). OPTI-MEM I הושג מ-GIBCO BRL (Grand Island, NY, ארה"ב), ותמיסת אנטיביוטיקה קדם-מיקס המכילה פניצילין, סטרפטומיצין ו-L-גלוטמין התקבלה מ-Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (אוסקה, יפן). המדיום של Dulbecco Modified Eagle (DMEM) ו-RPMI1640 התקבלו מ- Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (טוקיו, יפן).

2.2. הכנה מורכבת

בעבר, בנינו קומפלקס OVA/BK/c-PGA ביחס משקל של 1:0.2:0.2 (Kurosaki et al., 2012). להכנת קומפלקס OVA/BK, כמות מתאימה של תמיסת BK (pH 5.0) מומסת ב-5 אחוזי גלוקוז עורבבה עם תמיסת OVA (pH 7.0) המומסת ב-5 אחוזי גלוקוז ו נשאר למשך 15 דקות ב-4 C. כדי לצפות את קומפלקס OVA/BK ב-c-PGA, נוספה תמיסת c-PGA (pH 7.0) מומסת ב-5 אחוזי גלוקוז לקומפלקס OVA/BK והושארה למשך 15 דקות נוספות בשעה 4 ג. גודל החלקיקים ופוטנציאל ה-f של כל קומפלקס נמדדו באמצעות Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, בריטניה).

2.3. תאים

נעשה שימוש בקו תאים מקרופאג עכברים RAW264.7 וקו תאים דנדריטי DC2.4. תאי RAW264.7 גודלו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS ואנטיביוטיקה. תאי DC2.4 גודלו במדיום RPMI1640 בתוספת של 10 אחוז FBS, אנטיביוטיקה, 1 mM חומצות אמינו לא חיוניות ו-1 nM 2-מרקפטואתנול. תאים אלו הוערכו תחת אטמוספירה לחה של 5 אחוז CO2 באוויר ב-37C.

2.4. ניסוי קליטה סלולרית במבחנה

תאי RAW264.7 ותאי DC2.4 צופו על גבי 24-צלחות באר (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב) בצפיפות של 2.0 104 תאים/באר וטופחו ב-50{ {21}} מ"ל של מצע תרבות. לאחר דגירה מוקדמת של 24- שעות, המדיום הוחלף במדיום OPTI-MEM I, והתאים הודגרו עם 5 מ"ג FITC-OVA והקומפלקס המכיל 5 מ"ג FITC-OVA למשך 2 שעות. לאחר הדגירה, תאים אלה נשטפו עם PBS ונצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (BIOREVO BZ-9000; Keyence Co., אוסקה, יפן). לאחר תצפית, תאים אלו עברו ליטוש ב-300 ליטר של חיץ תמוגה (pH 7.8 ו-0.1 M Tris/HCl חיץ המכיל 0.05 אחוז Triton X-100 ו-2 mM EDTA). הליסאטים הונחו לתוך 96-צלחות באר, והפלורסנטיות של FITC-OVA נמדדה באורך גל פליטה של ​​530 ננומטר עם אורך גל עירור של 480 ננומטר, באמצעות קורא צלחות פלואורומטרי (Infinite-200Pro M-Plex, Tecan Japan Co., Ltd., Kanagawa, יפן). תכולת החלבון של ה-lysate נקבעה על ידי בדיקת Bradford באמצעות BSA כסטנדרט. הספיגה נמדדה באמצעות קורא המיקרו-לוחיות ב-570 ננומטר. ספיגת FITC-OVA צוינה כמ"ג למ"ג חלבון.

2.5. בעלי חיים

טיפול בבעלי חיים והליכי ניסוי בוצעו על ידי ההנחיות לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת נגסאקי באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. עכברי C57BL/6N זכרים (בני 5 שבועות) נרכשו מ-Japan SLC (Shizuoka, יפן). לאחר הובלה, הורשו לעכברים להסתגל לסביבתם החדשה במשך יום אחד לפני הניסויים. מתן ריאתי (40 מ"ל) בוצע על ידי שימוש במדכא לשון עם אור על ידי נשימה ספונטנית בעכברים שהורדמו על ידי שאיפת איזופלורן (Horiguchi et al., 2015).

2.6. הצטברות ריאות של קומפלקס

כדי לבחון את הצטברות ה-OVA, ה-40 מ"ג Alexa647-OVA והקומפלקס המכיל 40 מ"ג Alexa647- OVA בנפח של 40 מ"ל לעכבר ניתנו לעכברים בדרך ריאתית. שישה ימים לאחר המתן, עכברים הוקרבו והריאות נותחו. עוצמת הפלורסנט של Alexa647-OVA בריאה של העכבר נצפתה עם Xenogen IVIS Lumina System יחד עם תוכנת Living Image לרכישת נתונים (Xenogen, Co, Almeda, CA, ארה"ב). לאחר התצפית, הריאות הללו הומוגגו עם חיץ תמוגה וההומוגנטים עברו צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד (Kubota-3500, Kubota Corporation, טוקיו, יפן) למשך 5 דקות והקרינה של Alexa647 באותם סופרנטנטים. נקבע עם מוביל מיקרו-לוח באורך גל עירור ופליטה של ​​640 ו-670 ננומטר, בהתאמה.

2.7. הִתחַסְנוּת

עכברים חוסנו בתמיסת גלוקוז של 5 אחוז, 40 מ"ג OVA, קומפלקס ריק של 8 מ"ג BK ו-8 מ"ג c-PGA (רכב), וקומפלקס OVA/BK/c-PGA המכיל 40 מ"ג OVA במתן ריאתי, 4 פעמים שְׁבוּעִי. שבועיים לאחר החיסון האחרון התקבלו נוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF) וסרום. ה-BALF והסרום שימשו עבור מבחני אימונוסורבנט מקושרים לאנזימים (ELISA).

2.8. קביעת השראת נוגדנים ספציפיים ל-OVA

עבור ציפוי OVA, 100 מ"ל של תמיסת OVA (10 מ"ג/מ"ל, ב-1 M נתרן מימן קרבונט) נוספה לכל באר מלוחות ה-ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב) והודגרו למשך הלילה ב-4 C. הצלחות נשטפו שלוש פעמים עם תמיסת מלח מוגברת בפוספט המכילה 0.05 אחוז Tween-20 (PBST), 200 מ"ל של מגיב חוסם N 102 (Nichiyu, Co., Ltd., טוקיו, יפן ) הוסיפו כדי לחסום קישור לא ספציפי ולאחר מכן הודגרו במשך 6 שעות ב-4 C. הצלחות נשטפו פעמיים עם PBST. לאחר מכן, מנות 100 מ"ל של סרום מדולל פי 1000- ודגימות BALF לא מדוללות נוספו לכל באר והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר חמש פעמים שטיפה עם PBST, 100 מ"ל כל אחד של פרוקסידאז חזרת (HRP) - אנטי עז מצומדות -עכבר IgG, IgA, IgM, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b ו-IgG3 (1:10,000) (Abcam, Cambridge, UK) - נוספו לכל באר והודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ו לאחר מכן נשטף חמש פעמים עם PBST. נעשה שימוש בפתרון TMB One (Promega, WI, ארה"ב) והוכן לפי הוראות היצרן. התגובה הופסקה לאחר 15 דקות על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית של 1 N. הספיגה נקראה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחיות.

2.9. רעילות in vivo של קומפלקס OVA/BK/c-PGA

קומפלקס OVA ו-OVA/BK/c-PGA ניתנו לעכברים בדרך הריאתית. BALF התקבל 3 ו-24 שעות לאחר מתן מעכברים. 24 שעות לאחר המתן, נותחו גם הריאה. פעילות Lactate Dehydrogenase (LDH) ב-BALF נמדדה באמצעות QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase Kit (BioAssay Systems, CA, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. דגימות הריאות נקבעו בתמיסת חיץ פרפורמלדהיד פוספט של 4 אחוזים. החתך וצביעת המטוקסילין-אאוזין (HE) הופקדו בידי GenoStaff (טוקיו, יפן). קטעים מוכתמים ב-HE של הריאה נצפו במיקרוסקופיה בהגדלה של 20.

2.10. ניתוח סטטיסטי

המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין שתי הקבוצות הוערכה על ידי ביצוע מבחן t של Student. השוואות מרובות בין הקבוצות בוצעו על ידי ביצוע הבדיקה של Tukey. p-Values ​​< .05 נחשבו כמצביעים על מובהקות סטטיסטית.

3. תוצאות

3.1. תכונות פיזיקוכימיות של הקומפלקס

בנינו קומפלקס אניוני OVA/BK/c-PGA ביחס משקל של 1:0.2:0.2. לקומפלקס המצופה c-PGA היה גודל חלקיקים של כ-105.4 ננומטר ופוטנציאל f של כ-35.5 mV.

3.2. קליטה סלולרית של הקומפלקס

תאי RAW264.7 ותאי DC2.4 טופלו ב-FITC-OVA ו-FITC-OVA/BK/c-PGA קומפלקס, והספיגה התאית של FITC-OVA הוצגה, כפי שמוצג באיור 1. FITC-OVA/BK/ קומפלקס c-PGA נלקח מאוד על ידי תאי RAW264.7 ותאי DC2.4, ונצפתה קרינה ירוקה חזקה של FITC-OVA (איור 1 (A, B), בהתאמה). במקביל, כמויות קטנות של FITC-OVA נצפו בשני התאים שטופלו ב-FITC-OVA.

קליטה סלולרית של FITC-OVA נכמתה בתאי RAW264.7 ובתאים DC2.4 (איור 1(C)). קומפלקס FITC-OVA/BK/c-PGA הראה ספיגה גבוהה משמעותית מ-FITC-OVA בשני התאים (p < .01).

3.3. הצטברות ריאות של Alexa647-OVA לאחר מתן ריאתי

Alexa647-OVA ו-Alexa647-OVA/BK/c-PGA קומפלקס ניתנו לעכברים בדרך הריאתית כדי לקבוע את הצטברות הריאות של Alexa647-OVA כאנטיגן. ב-6 ימים לאחר מתן, הריאות נותחו, ועוצמת הקרינה שלהן הוצגה על ידי שימוש במערכת Xenogen IVIS Lumina. תמונה ניאון לשעבר vivo מוצגת באיור 2(א). עוצמת קרינה גבוהה נצפתה בכל הריאה 6 ימים לאחר מתן ריאתי, אם כי לא הייתה עוצמת הקרינה בטחול, בלב, בכליות ובכבד (לא מוצגים נתונים). הצטברות הריאות הייתה גבוהה יותר עבור Alexa647-OVA/BK/c-PGA קומפלקס מאשר עבור Alexa647-OVA ביום 6. כפי שמוצג באיור 2(B), הצטברות הריאות הייתה גבוהה משמעותית עבור Alexa 647-קומפלקס OVA/BK/c-PGA מאשר עבור Alexa647- OVA (p < .05).

3.4. נוגדן ספציפי ל-OVA בסרום לאחר מתן ריאתי של הקומפלקס

תמיסה של 5 אחוז גלוקוז, קומפלקס BK/c-PGA (רכב), OVA ו-OVA/BK/c-PGA קומפלקס ניתנו בדרך הריאתית לעכברים ארבע פעמים, ולאחר מכן IgG, IgA, IgM, ספציפיים ל-OVA בסרום, ו-IgE נקבעו על ידי ELISA כפי שמוצג באיור 3. מתן ריאתי של OVA וקומפלקס OVA/BK/c-PGA הגדילו את רמות ה-IgG בעכברים, אם כי לא זוהה IgG ספציפי ל-OVA בעכברים שקיבלו 5 אחוזי גלוקוז והרכב. יתר על כן, ייצור IgG ו-IgA היה גבוה משמעותית לאחר מתן קומפלקס OVA/BK/c-PGA מאשר לאחר מתן OVA (p < .05 או .01). מצד שני, IgM ו-IgE הספציפיים ל-OVA לא נגרו על ידי OVA או קומפלקס OVA/BK/c-PGA.

3.5. נוגדן ספציפי ל-OVA ב-BALF לאחר מתן ריאתי של הקומפלקס

כמו כן נקבעו IgG, IgA, IgM ו-IgE הספציפיים ל-OVA ב-BALF, כפי שמוצג באיור 4. רמת ה-IgG עלתה באופן מובהק על-ידי OVA ביחס לרמות לאחר מתן הבקרה והרכב (p < .05 או .01). עם זאת, קומפלקס OVA/BK/c-PGA העלה משמעותית לא רק IgG אלא גם IgA ב-BALF (p < .01). עם זאת, IgM ו-IgE הספציפיים ל-OVA לא נגרמו על ידי OVA או קומפלקס OVA/BK/c-PGA.

3.6. תת-סוגי IgG בסרום לאחר מתן ריאתי של הקומפלקס

השפעות אינדוקציה של תת-סוגי IgG ספציפיים ל-OVA, כגון IgG1, IgG2a, IgG2b ו-IgG3 בסרום נקבעו כפי שמוצג באיור 5. בהשוואה לבקרה ולרכב, OVA הגדיל באופן משמעותי רק את IgG1 (p < .01). רמות הנוגדנים של כל תת-הסוגים המושרה על ידי קומפלקס OVA/BK/c-PGA היו גבוהות משמעותית מהרמות המושרה על ידי הביקורת והרכב (p < .05 או .01).

3.7. תת-סוגי IgG ב-BALF לאחר מתן ריאתי של הקומפלקס

כמו כן נקבעו תת-סוגי IgG ספציפיים ל-OVA, כגון IgG1, IgG2a, IgG2b ו-IgG3 ב-BALF, כפי שמוצג באיור 6. OVA הגדיל באופן משמעותי רק את רמות ה-IgG1 ביחס לאלו שנגרמו על ידי הבקרה והרכב (p <.01) . בהשוואה לבקרה, הרכב וה-OVA, קומפלקס OVA/BK/c-PGA גרם לרמות נוגדנים גבוהות יותר באופן משמעותי מכל תת-הסוגים (p < .05 או .01).

3.8. רעילות in vivo של קומפלקס OVA/BK/c-PGA

לעכברים קיבלו תמיסת גלוקוז של 5 אחוז, OVA, וקומפלקס OVA/BK/c-PGA. פעילות LDH ב-BALF נקבעה 3 או 24 שעות לאחר מתן (איור 7). למתן קומפלקס OVA ו-OVA/BK/c-PGA הייתה השפעה מועטה על רמות ה-LDH ב-BALF.

24 שעות לאחר המתן, נותחו הריאות מאותם עכברים לצורך ניתוח היסטולוגי. קטעי ריאה מוכתמים ב-HE מוצגים באיור 8. לא נצפו חריגות היסטולוגיות בעכברים שטופלו ב-OVA ובקומפלקס OVA/BK/c-PGA.

4. דיון

הריאה שולטת בנשימה וחשופה לפתוגנים רבים, כמו וירוסים וחיידקים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה. פתוגנים אלה נדבקים דרך קרום רירית הריאה, ולכן יש לעורר חסינות רירית כדי להגן מפני זיהומים בדרכי הנשימה. למנוע זיהומים בדרכי הנשימה, לחסינות הרירית יש תפקיד חשוב; עם זאת, מתן תוך-עורי ותוך-שרירי של החיסון אינו יכול לעורר חזק את חסינות הרירית (Ito et al., 2003; Amorij et al., 2007). מערכת החיסון הרירית המעוררת הפרשת IgA מפותחת על פני הרירית. מספר APCs, כגון תאים דנדריטים ומקרופאגים, דווחו כממוקמים על פני הרירית (Kopf et al., 2015). יתר על כן, רקמה לימפואידית הקשורה לסימפונות (BALT) נמצאת ברירית הסימפונות והיא זקיק לימפואיד בעל תפקיד מרכזי בחסינות הרירית של דרכי הנשימה (Bienenstock, 1980). מתן ריאתי של החיסון צפוי לעורר את מערכת החיסון הרירית ביעילות. לכן, בנינו את קומפלקס OVA/BK/c-PGA כדי להעריך את התועלת שלו כחיסון הניתן דרך המסלול הריאתי.

איור 4 מציג את ריכוז ה-BALF של נוגדנים ספציפיים ל-OVA לאחר מתן ריאתי של OVA וקומפלקס OVA/BK/c-PGA. מתן ריאתי של OVA הגביר את IgG אך השפיע מעט על IgA ב-BALF. מצד שני, קומפלקס OVA/BK/c-PGA גרם להפרשה משמעותית של IgA ב-BALF. יתר על כן, אינדוקציה של IgG בסרום הייתה גבוהה משמעותית לאחר מתן קומפלקס OVA/BK/c-PGA מאשר לאחר מתן OVA (איור 3). סרום IgG חשוב למניעת החמרה של כל זיהומים המתרחשים (Huber et al., 2006; Schroeder & Cavacini, 2010). התוצאות מצביעות על כך שקומפלקס OVA/BK/c-PGA יכול למנוע זיהומים בדרכי הנשימה על ידי אינדוקציה גבוהה של IgA רירית והחמרה של זיהום בדרכי הנשימה על ידי אינדוקציה גבוהה של IgG בסרום. יתר על כן, אינדוקציה של IgE על ידי קומפלקס OVA/BK/c-PGA לא נצפתה, ותוצאה זו הצביעה על סיכון מועט לתגובה אלרגית על ידי קומפלקס OVA/BK/c-PGA.

קומפלקס OVA/BK/c-PGA יכול גם לגרום לא רק ל-IgG1 ו-IgG2b אלא גם ל-IgG2a ו-IgG3 (איור 5). IgG1 ו-IgG2b ידועים כאימונוגלובולינים מסוג Th2- המתווכים את התגובה החיסונית ההומורלית, ו-IgG2a ו-IgG3 ידועים כאימונוגלובולינים מסוג Th1- המתווכים את התגובה החיסונית התאית (Firacative et al., 2018) . לכן, קומפלקס OVA/BK/c-PGA יכול לגרום לתגובות חיסוניות הומוראליות ותאיות כאחד. תוצאות אלו מצביעות על כך שמערכת זו יכולה להיות שימושית עבור חיסונים נגד זיהומים כמו גם סרטן. יש להעריך את ההשפעה המניעתית, תגובות ציטוקינים מסוג Th1- ו-Th2- המושרות על ידי אנטיגן ב-BALT, אוכלוסיית Treg ו-IL-10 מושרה באמצעות אנטיגנים אמיתיים מזיהומים או סרטן בעתיד לימודים.

האינדוקציה החזקה על ידי קומפלקס OVA/BK/c-PGA של התגובה החיסונית חייבת לנבוע מהאחזקה הגבוהה של הקומפלקס בריאה ומשלוח יעיל של OVA לתוך ה-APCs ברירית הריאה. התוצאות שלנו אישרו זאת בכך שהראו ש-6 ימים לאחר המתן, קומפלקס Alexa647-OVA/BK/c-PGA נשאר בריאה והראה קרינה משמעותית יותר מאשר Alexa647- OVA (איור 2). היווצרות המורכב עשויה למנוע דיפוזיה של OVA ולהגן על OVA מפני פירוק על ידי פרוטאזות ברירית הריאה. יתר על כן, קומפלקס OVA/BK/c-PGA הצליח להעביר OVA ביעילות לתאי מקרופאג RAW264.7 ולתאי דנדריטים DC2.4 (איור 1). תוצאות אלו הצביעו על כך שקומפלקס OVA/BK/c-PGA ייקלט על ידי APC alveolar ויגרום לתגובה חיסונית גבוהה לאחר מתן ריאתי. דווח כי ננו-חלקיקים מצופים ב-c-PGA נקלטו על ידי המסלול האנדוציטוטי המתווך גמא-גלוטמיל טרנספפטידאז (Du et al., 2015). אישרנו גם שהננו-חלקיקים המצופים ב-c-PGA נקלטו במסלול האנדוציטוטי הספציפי ל-c-PGA (Kurosaki et al., 2009). קומפלקס OVA/BK/c-PGA עשוי להיקלט על ידי APC בריאה באמצעות אותם מנגנונים. עם זאת, עדיין לא ברור אילו תאים אחראים לקליטת OVA והצגת אנטיגן לאחר מכן בהשראת חסינות ספציפית. מחקרים נוספים על מנגנוני אינדוקציה חיסוניים מפורטים צריכים להתבצע בעתיד.

אדג'ובנטים רבים פותחו כדי לשפר את היעילות של חיסונים; עם זאת, תוספים דווחו כגורמים לתגובות דלקתיות באתר ההזרקה (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). לכן, מתן תוספים לריאה עלול לגרום לתופעות לוואי חמורות, כגון דלקת ריאות. לאחר מתן ריאתי של קומפלקס OVA/BK/c-PGA, רמות LDH ב-BALF לא עלו (איור 7) ולא נצפו חריגות היסטולוגיות בקטע המוכתם ב-HE (איור 8). לפי הדיווחים, c-PGA הוא פולימר מתכלה ביולוגית ומתכלה שאינו מראה תגובות אימונו-דלקתיות (Prodhomme et al., 2003; Ye et al., 2006). BK היא תרכובת אמוניום רבעונית בטוחה שנעשתה בשימוש נרחב מבחינה קלינית כתוסף אנטי-מיקרוביאלי (Marple et al., 2004). דוחות אלה תומכים גם בבטיחות של קומפלקס OVA/BK/c-PGA. מצד שני, רמות LDH גבוהות יותר נצפו ב-3 שעות לאחר מתן ריאתי מאשר ב-24 שעות, אפילו בקבוצת הביקורת. תוצאות אלו מצביעות על כך שגירוי קל נגרם על ידי מתן ריאתי. יש צורך במחקרי בטיחות נוספים לפני היישום הקליני של קומפלקס OVA/BK/c-PGA.

במחקר הנוכחי, הדגמנו אינדוקציה גבוהה של מערכת החיסון הרירית על ידי וקטור מתן חיסון חדש שנבנה עם חלבון אנטיגן, BK ו-c-PGA לאחר מתן ריאתי. המערכת יכולה לשמש לחיסון נגד זיהומים שונים בדרכי הנשימה.

הצהרת גילוי

לא דווח על ניגוד עניינים אפשרי על ידי המחבר/ים.

מימון

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) KAKENHI במסגרת מענקים [JP20K12649 ו-JP20K07156].

הפניות

1.Ainai A, Suzuki T, Tamura SI, et al. (2017). מתן תוך-אף של חיסון שלם של וירוס שפעת מומת כמועמד מבטיח לחיסון נגד שפעת. ויראלי אימונול 30:451–62.

2. Amorij JP, Saluja V, Petersen AH, et al. (2007). מתן ריאתי של חיסון תת-יחידה לשפעת מיוצבת אינולין שהוכן על ידי ייבוש בהקפאה בהתזה גורם לתגובות חיסוניות מערכתיות, הומוראליות ברירית כמו גם בתיווך תאים בעכברי BALB/c. חיסון 25:8707–17.

3.Bienenstock J. (1980). רקמה לימפואידית הקשורה ברונכוס ומקור התאים המכילים אימונוגלובולינים ברירית. Environ Health Perspect 35:39–42.

4.Chen JR, Liu YM, Tseng YC, et al. (2020). חיסוני שפעת טובים יותר: פרספקטיבה של התעשייה. J Biomed Sci 27:11.

5. Du X, Xiong L, Dai S, et al. (2015). חלקיקי סיליקה מזופוריים מצופים בציפוי c-PGA עם תרופות פרו מחוברות קוולנטיות לספיגה תאית משופרת ושחרור תוך תאי מגיב ל-GSH. עו"ד Healthc Mater 4: 771–81.

6. Firacative C, Gressler AE, Schubert K, et al. (2018). זיהוי של אנטיגנים משויכים ל-T helper (Th)1- ו-Th2- של cryptococcus neoformans במודל עכברי של זיהום ריאתי. Sci Rep 8:14.

7. Giri PK, Sable SB, Verma I, et al. (2005). הערכה השוואתית של נתיב חיסון תוך-אף ותת עורי לפיתוח חיסון רירי נגד שחפת ניסיוני. FEMS Immunol Med Microbiol 45:87–93.

8. Horiguchi M, Oiso Y, Sakai H, et al. (2015). מתן ריאתי של מעכב קינאז 3- של phosphoinositide הוא טיפול מרפא למחלת ריאות חסימתית כרונית על ידי התחדשות alveolar. J Control Release 213:112–9.

9. Huber VC, McKeon RM, Brackin MN, et al. (2006). תרומות ברורות של נוגדני אימונוגלובולין G1 (IgG1) ו-IgG2a המושרים על ידי חיסון לחסינות מגן מפני שפעת. Clin Vaccine Immunol 13: 981–90.

10. Ito R, Ozaki YA, Yoshikawa T, et al. (2003). תפקידים של נוגדני IgA ו-IgG אנטי-המגלוטינין באתרים שונים בדרכי הנשימה של עכברים מחוסנים במניעת דלקת ריאות קטלנית של שפעת. חיסון 21:2362–71.

11.Kopf M, Schneider C, Nobs SP. (2015). התפתחות ותפקודם של מקרופאגים ותאים דנדריטים תושבי ריאות. Nat Immunol 16: 36–44.

12.Kurosaki T, Kitahara T, Fumoto S, et al. (2009). קומפלקסים טרינריים של pDNA, פוליאתילן אימין וחומצה גמא-פוליגלוטמית למערכות מסירת גנים. Biomaterials 30:2846–53.

13.Kurosaki T, Kitahara T, Nakamura T, et al. (2012). פיתוח חיסון יעיל לסרטן באמצעות מערכת מיקוד של חלבון אנטיגן ל-APC. פארם 29:483–9.

14. Marple B, Roland P, Benninger M. (2004). סקירת בטיחות של בנזלקוניום כלוריד המשמש כחומר משמר בתמיסות תוך-אפיות: סקירה של נתונים ודעות סותרות. Otolaryngol Head Neck Surg 130: 131–41.

15.McKee AS, Munks MW, Marrack P. (2007). כיצד פועלים תוספים? שיקולים חשובים עבור תוספים מהדור החדש. חסינות 27: 687–90.

For more information:1950477648nn@gmail.com