הערכה חוץ גופית של אינטראקציות תרופתיות-תרופתיות בתיווך P-gp באמצעות מודל תאי הכליה האנושיים RPTEC/TERT1

edmund.chen@wecistanche.com

מבוא הערכה חוץ גופית של פוטנציאל המעכב של P-glycoprotein (P-gp) היא נושא חשוב בתהליך פיתוח התרופה, מכיוון שהיא מאפשרת חיזוי של אינטראקציות בין תרופתיות רלוונטיות קלינית (DDIs) [1-3]. P-gp שייך למשפחת הטרנספורטרים של ה-ATP-binding cassette (ABC) ומקודד על ידי הגן העמידות לריבוי תרופות MDR1 (הידוע גם בשם ABCB1). מעביר ממברנה זה ידוע כמתבטא יתר על המידה בתאי הגידול וכגורם לעמידות לתרופות אנטי סרטניות רבות [4]. ממוקם בתוך כל המחסומים הפיזיולוגיים, כולל מעי, כבד וכליות, P-gp מגן מפני קסנוביוטיקה על ידי הגבלת הספיגה של מצעים אלה ממערכת העיכול והקלה על הזרימה שלהם למרה ולשתן. לפיכך, P-gp ממלא תפקיד בולט בפרמקוקינטיקה של מחלקות טיפוליות שונות [5-7]. שפע של תרופות כגון תרופות אנטי-סרטניות, אנטי-פטרייתיות ותרופות לב וכלי דם ידועות כמצעים ו/או מעכבי P-gp, ורבות מהן מעורבות באינטראקציות רלוונטיות מבחינה קלינית [8-10]. לפיכך, מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) קובע כי יש להעריך את פוטנציאל מעכבי ה-P-gp בשלבים המוקדמים של פיתוח התרופה. מבחני מבחנה המבוצעים למטרה זו מתבססים בדרך כלל על מחקרי הובלה של תרופות באמצעות שורות תאים המבטאות P-gp. ליתר דיוק, הנחיות ה-FDA ממליצות על קביעת ערכי הריכוז החצי-מקסימלי המעכב (IC50) במבחנה כדי להעריך את הסיכון של DDIs קליניים הנובעים מעיכוב P-gp. לשם כך, נערכו מבחני ניסוי רבים, ורובם התמקדו באינטראקציות תרופתיות הקשורות לספיגה במעיים באמצעות המודלים Caco-2 או MDCK-MDR1 [11–13]

CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות

מאזשֶׁל הַכְּלָיוֹתחיסול הוא גם מסלול חיסול נפוץ עבור סוגים שונים של תרופות, הפרשה צינורית פעילה באמצעות טרנספורטרים של ABC עשויה גם היא למלא תפקיד מפתח באינטראקציות אלו [14]. עם זאת, נתונים במבחנה עלשֶׁל הַכְּלָיוֹתDDIs בתיווך P-gp מוגבלים. זה נובע בחלקו מחוסר פיתוח ואפיון של מודלים במבחנה לחיזוי שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתהובלת סמים. בין שורות תאים אנושיות שונות, נראה כי מודל RPTEC/TERT1 מראה הבטחה להערכתשֶׁל הַכְּלָיוֹתאינטראקציות תרופתיות. קו תאים זה נגזר מתורם אנושי בריא והוא נוצר מתאי אבובות פרוקסימליים שהונצחו. יתרה מכך, הביטוי והפונקציונליות של P-gp הוכחו באמצעות מודל זה, ובכך מאשרים את יכולתו לחזותשֶׁל הַכְּלָיוֹתזרימת תרופות [15, 16]. בהקשר זה, המחקר הנוכחי תוכנן לחקור פוטנציאל מעכב P-gp באמצעות מודל RPTEC/TERT1. ראשית, בוצע בדיקת סקר הצטברות rhodamine 123 (R123) כדי לקבל פרופל עיכוב עבור כל תרופה שנבדקה. בהתבסס על סקר זה, נבחרו ארבע תרופות להערכת ההשפעות התלויות בריכוז שלהן על הצטברות תוך-תאית של שתי תרופות מצע P-gp: אפיקסבן וריברוקסבן

מילות מפתח:תא כליות, מודל כליות, תרופה לכליות, סילוק כליות, כליות.

חומרים ושיטות

ריאגנטיםApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban, ri va r oxa ban,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin, and dabigatran etexilate נרכשו מאלסכים (Illkirch, Illkirch) צָרְפַת). Verapamil, ketoconazole, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ותמיסת HEPES נרכשו מסיגמא-אלדריך (Saint-Quentin-Fallavier, צרפת).

תרבית תאים  תאי RPTEC/TERT1 התקבלו מאוסף American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, צרפת) ותופחו במדיום ללא סרום מוגן הורמונלית המורכב מ-Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) בתוספת ערכת גורם גדילה (ATCC) ו- 1 אחוז תערובת אנטיביוטית/אנטימיקוטית (פניצילין-סטרפטומיצין, אמפוטריצין B) ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO 2. עבור כל הניסויים, זרעו תאים ב96-צלחות באר בצפיפות של 50,000 תאים לבאר ושימשו לגידול לאחר 14 ימי תרבית. המדיום חודש כל יומיים והשתמשו בתאים ממעבר 27 למעבר 34. תאי Caco-2 נרכשו גם מ-ATCC. התאים נשמרו במצע תרבות המורכב ממדיום מינימלי חיוני של Eagle (Sigma–Aldrich, מיזורי, ארה"ב) בתוספת של 10 אחוז FBS, 1 אחוז חומצות אמינו לא חיוניות ותערובת אנטיביוטית/אנטימיקוטית של 1 אחוז (פניצילין-סטרפטומיצין, אמפוטריצין B ) ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO2. תאי Caco-2 נזרעו בצלחות של 96-בארות בצפיפות של 5 × 10 3 תאים לבאר ושימשו לגידול לאחר 14 ימי תרבית. תאי אפיתל פרוקסימלי צינורי אנושיים (HPTECs) התקבלו מ- BIOPREDIC (רנס, צרפת) ותופחו ב-DMEM/F12 בתוספת הידרוקורטיזון, EGF, אינסולין, טרנספרין ונתרן סלניט. תאים נזרעו ב96-צלחות תרבית מצופות היטב בקולגן בצפיפות של 6600 תאים לבאר ושימשו לגידול לאחר 11 ימי תרבית.

Rhodamine 123 בדיקת הצטברות  פוטנציאל העיכוב של P-gp נקבע על ידי מדידת הצטברות תוך תאית של rhodamine 123 בתאי RPTEC/TERT1 בנוכחות והיעדר סוגים שונים של תרופות. בין 14 התרופות שנבדקו, ציקלוספורין A (10 µM), ketoconazole (50 µM), verapamil (100 µM) ואמיודרון (50 µM) שימשו כמעכבי P-gp. Apixaban, rivaroxaban ו-dabigatran etexilat - שלושה נוגדי קרישה דרך הפה ישירות (DOACs) - שימשו כמצעי P-gp (10 µM). וורפרין (50 µM) שימש כגורם שאינו מעכב, וחמש תרופות נוגדות סרטן כולל נילוטיניב, קריזוטיניב, ארלוטיניב ואידלליסיב שימשו מבלי לדעת את רמת העיכוב שלהן בריכוז של 10 µM. מספר מצבים שוחזרו עם תאי Caco-2, אשר מאושרים על ידי ה-FDA למחקרי הובלת תרופות. באופן זה, האחזקה התוך תאית של rhodamine 123 נקבעה בתאי Caco-2 בנוכחות והעדר וראפמיל (100 מיקרומטר), ציקלוספורין A (10 מיקרומטר), נילוטיניב (10 מיקרומטר) ו-DOACs (10 מיקרומטר). ). בקצרה, לאחר 14 ימים של תרבית ב96-צלחות בארות, התאים הודגרו מראש למשך 10 דקות ב-37 מעלות כאשר כל תרופה מומסת ב-HBSS עם 10 mM HEPES (v/v). לאחר מכן התאים הודגרו עם 10 מיקרומטר rhodamine 123 למשך 45 דקות ב-37 מעלות. לבסוף, לאחר שלוש שטיפות בתמיסת HBSS / HEPES קרה, התאים עברו ליטוש בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בתמיסה של סודיום דודציל סולפט (SDS) המכילה 1 אחוז נתרן בוראט. כמות rhodamine 123 תוך תאי נמדדה באמצעות ננו-ספקטרו-פואורומטר של Infnite M (מדעי החיים, TECAN, שוויץ), תוך הגדרת אורכי הגל ל-485/535 ננומטר. הנתונים הובאו כאחוזים של הצטברות rhodamine 123 בתאי בקרה שלא נחשפו למעכבי P-gp פוטנציאליים כלשהם ונקבעו באופן שרירותי על 100 אחוז הצטברות.

בדיקת הצטברות תוך תאית של DOAC וקביעת IC50 ממבחן ההקרנה הקודם של rhodamine 123, נבחרו ארבע תרופות לחקור את ההשפעות התלויות בריכוז שלהן על הצטברות תוך תאית של אפיקסבן וריברוקסבן (10 µM) בתאי RPTEC/TERT1. Ketoconazole, crizotinib ונילוטיניב נבחרו כמעכבי P-gp, ו-warfarin נבחר כבלתי מעכב. Cyclosporin A (10 µM) שימש כמעכב רחב טווח של טרנספורטרים. מחקרים על האינטראקציות בין DOACs ונילוטיניב לקביעת ערכי IC50 שוחזרו בתאי Caco-2 על מנת להשוות בין שני המודלים הסלולריים. כל התרכובות דוללו לבד או עם המעכב המשויך במאגר HBSS הובלה בתוספת של 1 אחוז HEPES (v/v) ו-1 אחוז DMSO (v/v). לפני הדגירה, כל התמיסות חוממו מראש ל-37 מעלות וה-pH הותאם ל-7.4. עבור התרופות האנטי-סרטניות crizotinib ונילוטיניב, עקב מסיסותן הירודה ופוטנציאל הציטוטוקסי שלהן, הריכוזים נעו בין 0.1 ל-25 µM. עבור ketoconazole ו-warfarin, הריכוזים נעו בין 0.1 ל-100 µM. בקצרה, לאחר 14 ימי תרבית, כל התרופות המומסות ב-HBSS עם 1 אחוז HEPES (v/v) הודגרו מראש למשך 10 דקות ב-37 מעלות. לאחר מכן, התאים הודגרו עם 10 מיקרומטר של אפיקסבן או ריברוקסבן למשך 60 דקות ב-37 מעלות. לבסוף, לאחר שלוש שטיפות בתמיסת HBSS/HEPES קרה, תאים עברו ליטוש בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בתמיסה של 0.2 אחוזים של Triton X -100. כמות ה-DOAC התוך תאי נמדדה לאחר מכן באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS). הנתונים באו לידי ביטוי כאחוז עלייה בהצטברות DOAC, והצטברות התוך-תאית של DOAC נקבעה באופן שרירותי על 100 אחוז בתאי ביקורת. ערכי ה-IC50 לעיכוב פעילות P-gp, התואמים לערכי הריכוז האפקטיבי החצי-מקסימלי (EC50) להגברת הצטברות DOAC, נקבעו ממודל רגרסיה לא-לינארית של ריבועים קטנים לא משוקללים של צבירה מוגברת עם הפונקציה 'nls()' ב-R תוכנה, לפי המשוואה הבאה (משוואה 1):

כרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסהכימות של apixaban (m/z 460.19793) ושל rivaroxaban (m/z 436.07285) בוצע באמצעות Ultimate U300{{18 }} מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (Dionex, Sunnyvale, CA, ארה"ב) בשילוב עם ספקטרומטר מסה Q-Exactive Plus (ThermoFisher, ברמן, גרמניה). הפרדות LC הושגו באמצעות עמודה אנליטית Hypersil Gold C18 (3 מיקרומטר, 50 × 2.1 מ"מ) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, ארה"ב) וקצב הזנה של 0.6 מ"ל/דקה . שלב A נייד היה מים עם 0.1 אחוז חומצה פורמית (FA) ושלב B נייד היה אצטוטריל עם 0.1 אחוז FA. עבור rivaroxaban, הגרדיאנט היה: 0–0.3 דקות, 10 אחוז B; 0.3-1 דקות, ליניארי מ-10 אחוז ל-70 אחוז B; 1-1.5 דקות, 70 אחוז B; 1.51 דקות, חזרה לתנאי ההתחלה עד 3 דקות. עבור apixaban, הגרדיאנט היה: 0-0.3 דקות, 10 אחוז B; 0.3-0.7 דקות, ליניארי מ-10 עד 90 אחוז B; 0.7–1.5, 90 אחוז ב; 1.51 דקות, חזרה לתנאי ההתחלה עד 3 דקות. הזיהוי בוצע במצב ניטור תגובה מקבילה-PRM (PRM) ברזולוציה של 35,000 (ב-m/z 200). התקנים הפנימיים (ISs) היו [13C,2H7]-apixaban (m/z 468.2452) עבור apixaban ו-[13C6]-rivaroxaban (m/z 442.09297) עבור rivaroxaban. עבור כל תרופה וה-IS בהתאמה, נוטרו יון מטרה (לכימות) ויון מאשר. עבור rivaroxaban וה-IS שלו, יון המטרה היה m/z 144.95125 והיונים המאשרים היו m/z 231.11280 ו-m/z 237.13298, בהתאמה. עבור apixaban וה-IS שלו, יון המטרה היה m/z 199.08656 והיונים המאשרים היו m/z 282.12387 ו-m/z 241.06062, בהתאמה.

תוצאות

Rhodamine 123 בדיקת הצטברותבדיקת בדיקת הצטברות rhodamine 123 בוצעה בתאי RPTEC/TERT1 עם 14 תרופות עם פרופילי עיכוב שונים (איור 1). כצפוי, ההצטברות התוך תאית של rhodamine 123 בנוכחות cyclosporin A, מעכב רחב טווח, הייתה מהגבוהות, עם עלייה בהצטברות של 75 אחוז בהשוואה לתאי הביקורת. הנוכחות של verapamil, מעכב P-gp ספציפי, הובילה לעלייה בהצטברות של rhodamine 123 של 57 אחוזים, מה שמוכיח את מעורבותו של P-gp. באותו אופן, ketoconazole, המתואר כמעכב P-gp חזק, הוביל לעלייה גדולה יותר (66 אחוזים) בהצטברות התוך-תאית של rhodamine 123 בהשוואה ל-verapamil, מה שמאשר את רמת העיכוב שלו. לעומת זאת, תוספת של אמיודרון, המאופיין כמעכב P-gp בינוני, גרמה לעלייה בהצטברות של 59 אחוז, הדומה לזו הנגרמת על ידי ורפמיל. פרופילי עיכוב שונים נצפו עבור התרופות נוגדות הסרטן nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib ואידלalisib. התוספת של Nilotinib גרמה לעלייה חזקה בהצטברות של rhodamine 123 (71 אחוזים), מה שמרמז על פוטנציאל מעכב משמעותי, ואחריו Axitinib, שגרם לעלייה בשמירה של 57 אחוזים. מצד שני, crizotinib ו-erlotinib הראו פוטנציאל מעכב בינוני עד נמוך, עם עלייה בהצטברות rhodamine 123 של 23 אחוז ו-16 אחוזים, בהתאמה. Idelalisib לא השפיע על הצטברות של rhodamine 123; אותו הדבר היה נכון לגבי וורפרין, שהיה

נבחר כבלתי מעכב. בין שלושת ה-DOACs, apixaban ו-rivaroxaban גרמו לעלייה קלה בשמירה של rhodamine 123: 33 אחוז ו-12 אחוז, בהתאמה. מעניין לציין שדביגטרן אטקסילאט, פרו-תרופה של דאביגטרן ומצע ידוע של P-gp, גרם לעלייה בשמירה של rhodamine 123 של כ-50 אחוז, למרות שהוא אינו מתואר כמעכב P-gp פוטנציאלי. לבסוף, הוספה של סימבסטטין גרמה לעלייה קלה בלבד בהצטברות המצע הפלורסנטי (32 אחוז). בהתבסס על סקר זה, נבחרו ארבע תרופות להערכת ההשפעות התלויות בריכוז על הצטברות תוך-תאית של אפיקסבן וריברוקסבן במסגרת מודל RPTEC/TERT1. Ketoconazole נבחר כמצב בקרה חיובי לעיכוב P-gp, ו-warfarin נבחר כבלתי מעכב של P-gp למצב הבקרה השלילי. Nilotinib ו- crizotinib נבחרו כמעכבי P-gp חזקים ומתונים, בהתאמה. מספר תנאים שוחזרו עם מודל הייחוס, Caco-2. ההצטברות התוך תאית של R123 בתאים נקבעה לאחר שילוב (או לא) עם אפיקסבן וריברוקסבן (10 מיקרומטר), נילוטיניב (10 מיקרומטר) ועם ציקלוספורין A (10 מיקרומטר) ו-ורפמיל (100 מיקרומטר) עבור תנאי הביקורת לעיכוב (איור 2א). כצפוי, וראפמיל וציקלוספורין A גרמו לעלייה גבוהה בשימור R123 של 297 אחוז ו-275 אחוז, בהתאמה. באותו אופן, nilotinib גרם לעלייה גבוהה בהצטברות התוך-תאית של R123 (229 אחוז), מה שמאשר את הפוטנציאל המעכב שלו. שילוב של R123 עם DOACs הביא לעלייה קלה בהצטברות של R123 (40-44 אחוזים) בהשוואה לתרופות האחרות. יתרה מכך, הצטברות תוך תאית של רודמין 123 בהיעדר ונוכחות של ציקלוספורין A בשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאים אנושיים ראשוניים נחקרו גם במחקר זה כדי לבדוק את מהימנות התוצאות שהושגו עם תאי RPTEC/TERT1 (איור 2B). ניתוחים אלה הראו שנוכחות cyclosporin A הגדילה את שימור R123 ב-71 אחוזים. ערך זה היה קרוב לזה שהושג באותם תנאים עם תאי RPTEC/TERT1 (עלייה של 75 אחוז עם cyclosporin A). לכן, פעילות ה-P-glycoprotein הייתה דומה במודל RPTEC/TERT1 ובתאים אנושיים ראשוניים.

בדיקת הצטברות תוך תאית של DOAC: קביעת יחס IC50 ו-I1/IC50 מחקרי הצטברות תוך תאית בוצעו כדי להעריך את ההובלה המתווכת ב-P-gp של אפיקסבן וריברוקסבן בריכוז קבוע של 10 מיקרומטר בתאי RPTEC/TERT1 במבחנה ובנוכחות ריכוזים גדלים של nilotinib, crizotinib, ketoconazole , וורפרין (איורים 2, 3). המודל של שימור מוגבר של אפיקסבן וריברוקסבן הוערך כדי לקבוע ערכי IC50. שילוב של DOACs עם nilotinib הוביל לערכי IC50 הנמוכים ביותר: 0.85 µM ו-1.37 µM עבור rivaroxaban ו- apixaban, בהתאמה (איורים 4, 5). שילוב עם crizotinib הניב ערכי IC50 של 10.1 µM ו-12.2 µM עבור rivaroxaban ואפיקסאבן, בהתאמה. באופן מפתיע, שילוב של DOACs עם קטו קונאזול לא יצר את ערכי ה-IC50 הנמוכים ביותר (16.5 µM ו-16.9 µM עבור rivaroxaban ואפיקסאבן, בהתאמה). לבסוף, כצפוי, שילוב עם וורפרין, שהיה

שנבחר כבלתי מעכב, לא השפיע על החזקות התוך-תאיות של שני ה-DOACs. לכן, ההצטברות התוך-תאית של אפיקסבן וגם של ריברוקסבן בתוך תאי Caco-2 בנוכחות ריכוזים עולים של נילוטיניב נחקרה לשם השוואה עם המודלים הסלולריים. מעניין, כפי שנצפה במודל RPTEC/TERT1, ערך ה-IC50 עבור rivaroxaban (4.16 µM) היה נמוך מזה שהתקבל עבור apixaban (9.35 µM). מעניין גם לציין שערכי ה-IC50 שנצפו בתאי Caco-2 היו גבוהים יותר מאלה שהתקבלו בתאי RPTEC/TERT1 עבור אותו מעכב. ניתן לחזות את הרלוונטיות הקלינית של DDIs על פי נתוני in vitro. על פי הנחיות ה-FDA, יחסי [I1]/IC50 חושבו עבור כל שילוב של תרופות. יחס זה מאפשר להשוות ריכוזים in vivo לאלה הידועים כמייצרים אפקט רלוונטי במבחנה. עבור apixaban בתאי RPTEC/TERT1, היחסים היו 3.1, 0.06 ו-17.4 עם nilotinib, crizotinib ו-ketoconazole, בהתאמה (טבלה 1). בתאי Caco-2, היחס [I1]/IC50 היה 0.46 עבור האינטראקציה בין אפיקסבן ונילוטיניב (טבלה 1). עבור rivaroxaban, היחסים היו מעט גבוהים מאלה שהתקבלו עבור apixaban בתאי RPTEC/TERT1: 5.1, 0.08 ו-17.7, בהתאמה, עבור nilotinib, crizotinib ו-ketoconazole (טבלה 2). באותו אופן, היחס [I1]/IC50 שנצפה עבור האינטראקציה בין rivaroxaban ו-nilotinib בתאי Caco-2 היה 1.03, שהיה גבוה מזה שהתקבל עבור apixaban (טבלה 2).

דִיוּן

מחקרים רבים שבוצעו בעשורים האחרונים דיווחו על תפקיד בולט של P-gp בפרמקוקינטיקה של תרופות [17-19]. לאור העניין הרגולטורי הגובר באינטראקציות בין תרופתיות המתווך על ידי P-gp, מבחני מבחנה לבדיקת פוטנציאל המעכב של תרופות הם היבט חשוב בפיתוח תרופות ובפרקטיקה הקלינית. לשם כך, נערכו מבחני מבחנה רבים, ורוב הנתונים הקשורים על ספיגת מעיים חזויה נוצרו משורות התא Caco-2 ו-MDCK-MDR1 [20-22]. עם זאת, נתונים מעטים זמינים על הפרשת צינורות פעילה של תרופות, שגם היא ממלאת תפקיד מפתח בנטייה לתרופות ותלויה בנוכחות של מעבירי ABC. התבוננות זו קשורה בבירור לחוסר המאפייניםשֶׁל הַכְּלָיוֹתקווי תאים לניבוי תרופהשֶׁל הַכְּלָיוֹתefux. מטרה זו דורשת בדיקה חוץ גופיתשֶׁל הַכְּלָיוֹתמודל המחקה מקרוב את המחסום הפיזיולוגי. קו התאים האנושי RPTEC/TERT1, המבטא מספר טרנספורטרים של ABC (במיוחד P-gp), נראה כחלופה טובה, כפי שהוכח במחקר קודם [16]. בהקשר זה, העבודה הנוכחית חקרה את היישום של מודל RPTEC/TERT1 כדי להעריך את פוטנציאל העיכוב של P-gp. למיטב ידיעתנו, עבודה זו היא הראשונה לספק נתונים ממחקרי עיכוב P-gp באמצעות בני אדםשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאים.

מבחני במבחנה לקביעת פוטנציאל המעכב של P-gp מבוססים בדרך כלל על שימוש במצע ייחוס ספציפי של P-gp, כגון digoxin או rhodamine 123 [23-25]. בשל קלות השימוש שלהם, בדיקות פלורסנט הן יתרון עבור מבחני תפוקה גבוהה. יתר על כן, rhodamine 123 יושם באופן נרחב לאיתור פעילות P-gp במגוון רחב של מחקרים [26-28]. בדרך זו, בדיקות של הצטברות rhodamine 123 בתאי RPTEC/TERT1 בוצעו במחקר זה כדי לזהות את פרופילי העיכוב של 14 תרופות. בין התרופות הללו, נבחרו ציקלוספורין A, ketoconazole ו- verapamil כמעכבי P-gp חזקים. מעכבים אלו אופיינו בהרחבה בשל פוטנציאל העיכוב המשמעותי שלהם ב-P-gp, מה שמוביל לאיפונון של תחבורה של דיגוקסין ושל rhodamine 123 כאחד [27, 29, 30]. כצפוי, תרופות אלו גרמו לשמירות ה-Rhodamine 123 הגבוהות ביותר בתאי RPTEC/TERT1. לעומת זאת, לא נצפתה עלייה בשמירה של R123 עם warfarin, ששימש כבקרה שלילית, מה שמאשר את המהימנות של מודל RPTEC/TERT1. מעניין לציין שבין כל התרופות שנבדקו, DOACs - כולל dabigatran etexlate, apixaban ו- rivaroxaban - גרמו לעלייה ברורה בשמירה של R123, למרות שהם לא אופיינו בעבר כמעכבים, רק מצעי P-gp [31, 32]. תצפית זו עשויה לנבוע מקיומו של עיכוב שנקרא "תחרותי", שבו התרופות יכולות לקיים אינטראקציה עם אותם אתרי קישור ב-P-gp. האתרים המאופיינים היטב עבור P-gp הם אתר H (לקישור Hoechst 33342) ואתר R (לקישור rhodamine 123). עם זאת, אתרי קשירה לא ידועים מרובים אחרים יכולים לשחק תפקיד באינטראקציות אלו, מה שיכול להסביר את ההשפעות השונות של ה-DOACs על הצטברות של R123 [33, 34]. עיכוב ה-P-gp שנצפה עבור תרופה נתונה תלוי אפוא במצע המשמש במהלך מחקרים במבחנה [28, 35]. לכן יש לשקול את השימוש במצעי P-gp שונים המקיימים אינטראקציה עם אתרי קשירת תרופות שונים כדי לתאר במדויק את עוצמת מעכבי P-gp המשוערת של תרופות. מעניין גם לציין שמספר תנאים מההקרנה של rhodamine 123 בוצעו גם בתאי Caco-2 על מנת להשוות את תאי RPTEC/TERT1 עם מודל ייחוס במחקרי הובלה של תרופות. כצפוי, ציקלוספורין A, ורפמיל ונילוטיניב גרמו לעליות הגבוהות ביותר באצירת רודמין. אותם פרופילי עיכוב נצפו גם בתאי Caco-2 וגם בתאי RPTEC/TERT1. עם זאת, העליות בשימור rhodamine 123 שנוצרו על ידי האינטראקציות במודל Caco-2 היו גדולות מאלה שנצפו בתאי RPTEC/TERT1, מה שמצביע על הבדל פוטנציאלי בביטוי של P-glycoprotein בין המודלים. לכן, בהווה במחקר, נעשה שימוש בשיטה שנייה כדי להעריך ולאשר את העיכוב הפוטנציאלי של P-gp על ידי תרופות.

CISTANCHE ישפר דיאליזה של כליות/כליות

בהתבסס על בדיקת הצטברות rhodamine 123, נבחרו ארבע תרופות כדי לקבוע את ההשפעות התלויות בריכוז שלהן על הצטברות תוך תאית של אפיקסבן וריברוקסבן. הוכח כי P-gp ממלא תפקיד עיקרי באפוקס של אפיקסבן וריברוקסבן [32, 36]. ערכי IC50 של nilotinib, crizotinib ו-ketoconazole הוערכו לפיכך, כאשר DOACs נבחרו כתרופות "הקורבן". למיטב ידיעתנו, מחקר זה הוא הראשון לבצע מחקרי הצטברות תוך תאית עם DOACs בבני אדםשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאים. ערכי IC50 שהתקבלו עבור nilotinib ו- crizotinib היו בהתאם לפרופילי העיכוב שלהם שהתקבלו ממבחן הצטברות rhodamine 123. Nilotinib, שגרם לעלייה חזקה בשמירה של R123, הציג את ערך ה-IC50 הנמוך ביותר עבור שני ה-DOACs, מה שמאשר את פוטנציאל העיכוב הגבוה שלו. תוצאה זו תואמת גם מחקר קודם שהראה עלייה תלוית ריכוז בהצטברות התוך תאית של [3H]-paclitaxel בתאים שעברו MDR1-, מה שמצביע על כך שיש לו פרופיל מעכב [37]. עבור crizotinib, בדיקת R123 הראתה פוטנציאל מעכב בינוני, עם עלייה פחותה בשימור R123 מזו הנגרמת על ידי nilotinib. תצפית זו נתמכת על ידי מחקר קודם שבו crizotinib הגביר את ההצטברות התוך תאית של R123 ו- doxorubicin בתאים שעברו MDR1- [38]. תוצאה זו תואמת גם לערכי IC50 שנקבעו עם DOACs, שהיו גבוהים מהערכים המקבילים עבור nilotinib, מה שמאשר את פרופיל העיכוב המתון שלו. עם זאת, מעניין לציין שריכוז של 10 µM של nilotinib או crizotinib לא גרם לאותן עליות בשמירה של rhodamine 123 ו-DOACs. בהקרנת rhodamine, Nilotinib הגביר את החזקת המצע בכ-71 אחוז, בעוד שזה היה כ-40 אחוז עבור DOACs. לעומת זאת, crizotinib גרם לעלייה קטנה בשמירה של rhodamine (23 אחוז) אך לעלייה גדולה יותר בשמירה של DOACs (כ-50 אחוז) באותו ריכוז. כפי שנדון בעבר, ניתן להסביר תצפית זו על ידי הבדלים באתרי הקישור ב-P-gp. ידוע שתרופות רבות מקיימות אינטראקציה ומתחרות עם אתר הקישור H ולא עם אתר הקישור R (שזה המקום שבו rhodamine 123 נקשר), ולהיפך [39]. מעניין לציין ש-ketoconazole, הידוע כמעכב P-gp חזק, גרם לעלייה מעט קטנה יותר בשמירה של rhodamine 123 מאשר Nilotinib (66 אחוז לעומת 71 אחוז, בהתאמה). עם זאת, ערך דומה נצפה עם תאי Caco-2, כאשר נוכחות ketoconazole גרמה לעלייה של 60 אחוז בהצטברות R123 [40]. ההצטברות התוך-תאית של DOACs לקביעת ערכי IC50 הראתה גם ערכים גבוהים יותר בהשוואה ל-nilotinib ו- crizotinib. מעניין לציין שרוב ערכי ה-IC50 שנמצאו במודלים של LLC-PK1 או Caco-2 המשתמשים בדיגוקסין כמצע P-gp היו בין 3 ל-4 מיקרומטר עבור ketoconazole [41, 42]. ערכים אלה שונים למדי מאלה שנמצאו במחקר הנוכחי (16.5 מיקרומטר ו-16.9 מיקרון עם אפיקסבן וריברוקסבן, בהתאמה). תצפית זו מאשרת כי הבחירות של המצע והמודל המשמש הם השפעות מכריעות בקביעת פוטנציאל המעכב P-gp. בנוסף, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי לרמות הביטוי של מעבירי ABC במודלים תאיים חוץ-גופית יש השפעה על מבחני הובלה של תרופות ולכן על הערכת DDIs הקשורים ל-P-gp [43]. ואכן, קביעת ערכי IC50 עבור verapamil באמצעות rivaroxaban כמצע P-gp חשפה הטרוגניות בין המודלים של תאי MDCKMDR1 ו-Caco-2, עם ערכי IC50 של 6.94 µM ו-21.2 µM, בהתאמה [43]. יתר על כן, ההשפעה התלויה בריכוז של nilotinib על הצטברות תוך תאית של אפיקסבן וריברוקסבן נחקרה גם בתאי Caco-2 במחקר זה. מעניין, ערכי IC50 עבור nilotinib היו גבוהים משמעותית בתאי Caco-2 מאשר בתאי RPTEC/TERT1. תצפית זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההבדל בביטוי P-gp בין מודלים אלה. בנוסף, ידוע כי התפלגות P-gp תלויה ברקמה הנחשבת. פאלון וחב'. הוכיח שרמת ה-P-gp הייתה גבוהה יותר בכִּליָהמאשר ברקמת הכבד בבני אדם [45]. מצד שני, נראה שרמת הביטוי של P-gp גבוהה יותר במעי מאשר בכִּליָהרקמה [46]. השימוש בתאים אנושיים כגון מודל RPTEC/TERT1, שאינם מבטאים טרנספורטרים יתר על המידה, עשוי לספק נתונים נוספים. ניתן להשתמש בנתונים אלה ולזקוף אותם במודלים פרמקוקינטיים מבוססים פיזיולוגית (PBPK) על ידי שילוב מספר פרמטרים, כגון כמות P-gp במודל רקמה או במבחנה או ערכי IC50.

למרות שערכי ה-IC50 שנמצאו עבור ketoconazole במודל RPTEC/TERT1 היו גבוהים יותר מאלה שנצפו בספרות, היחס [I1]/IC50 - שאושר כמנבא של DDIs פוטנציאליים קליניים רלוונטיים לתרופות במתן דרך הפה - הראה ערכים גבוהים שהיו מעל הסף של 0.1 שהוגדר על ידי ה-FDA. תוצאה זו היא בהתאם למחקר קליני שהראה עלייה פי שניים בחשיפה לאפיקסאבן עם מתן משותף של ketoconazole [44]. ביחד, כל התוצאות הללו מוכיחות שמודל RPTEC/TERT1 הוא כלי מבטיח להערכת פוטנציאל מעכב P-gp.

CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות

סיכום

המחקר שלנו הראה שהיישום של מודל RPTEC/TERT1 נוח להערכת פוטנציאל מעכבי P-gp של סוגים שונים של תרופות. מבחני הצטברות Rhodamine 123 אפשרו לבצע בדיקת תרופות ראשונית. עם זאת, יש לחקור גם את פוטנציאל העיכוב P-gp של תרופות שאינן מקיימות אינטראקציה עם אתר ה-R של P-gp באמצעות מצעים נוספים כדי לאשר את התחזיות. ערכי ה-IC50 שנקבעו מהצטברות תוך-תאית של אפיקסבן וריברוקסבן הם בהתאם לפרופילי העיכוב שנצפו עם rhodamine 123. יתרה מכך, השימוש בקטוקונזול ובוורפרין כמעכבים חזקים וכבלתי מעכבים של P-gp, בהתאמה, אישר את מהימנות של מודל RPTEC/TER1 כאשר הוא משמש להשגת נתונים במבחנה לגבי פוטנציאל המעכב של תרופות כלפי P-gp. לבסוף, השוואה של התוצאות שהתקבלו באמצעות מודל RPTEC/TERT1 לאלו שהתקבלו באמצעות תאי Caco-2 הדגישה את החשיבות של ביצוע מחקרים במבחנה במודלים תאיים שונים כדי לאשר את הפרופיל המעכב של תרופה נתונה.