מטבוליזם במבחנה וב-Vivo של תמצית Cistanche Tubulosa בחולדות דיכאוניות רגילות וכרוניות בלתי צפויות הנגרמות על ידי מתח

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

תַקצִיר

Cistanche tubulosa, מין אחד של Cistanches Herba, אושר לאחרונה כבעל יעילות נוגדת דיכאון לחולדות בלחץ אינכרוני בלתי צפוי (CUS) על ידי שחזור הומאוסטזיס של מיקרוביוטה במעי. במאמר זה, אנו שואפים לחקור את הפרופיל המטבולי של C. tubulosa בחולדות מודל דיכאון נורמלי ו-CUS-in vitro in vitro ו-in vivo. באמצעות UPLC-Q-TOF-MS, חילוף החומרים במבחנה במערכת העיכול שלתמצית Cistanche tubulosa(CTE) הוערך הן בחולדות רגילות והן בחולדות CUS. במקביל, מטבוליזם in vivo של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות רגילות ומדוכאות נחקר גם בשתן ובצואה של חולדות. בסך הכל 20 ו-26 מטבוליטים אופיינו מ-in vitro ו-in vivometabolism בחולדות רגילות ו-CUS, בהתאמה. CTE(תמצית Cistanche tubulosa)עבר מטבוליזם לאגליקונים ותוצרי פירוק של גליקוזידים פנילתנואידים (PhGs) וגליקוזידים אירידואידים בין אם על ידי מיקרוביוטת מעיים של חולדה רגילה או מדוכאת במבחנה. מטבוליטים שלב II של אגליקונים ותוצרי פירוק של PhGs וגליקוזידים אירידואידים היו המטבוליטים העיקריים בשתן ובצואה של חולדות. בנוסף, היכולת המטבולית ליצור גליקוזידים ואגליקונים משניים במיקרוביוטת מעיים דיכאונית של חולדות הייתה חלשה בהרבה מזו של מיקרוביוטת מעיים רגילה של חולדות, אשר יוחסה להידרולאזות הגליקוזידים המופרעות שנוצרו על ידי מיקרוביוטת מעיים בחולדות מדוכאות CUS. תוצאות מחקר זה הניחו את הבסיס להבנת התהליך המטבולי והמנגנון הטיפולי של התכונה נוגדת הדיכאון של CTE.

מילות מפתח: Cistanche tubulosa, DepressionMetabolism, In vitro, In vivo, מיקרוביוטה של ​​המעי

1. הקדמה

Cistanches Herba מתועד רשמית כגבעולים עסיסיים מיובשים של Cistanche deserticola (YC Ma) ו-C. tubulosa (Schrenk), המשמשים לטיפול במחסור בכליות, אימפוטנציה, אי פוריות נשית, מורבידיאוקורריאה, מטרורגיה שופעת ועצירות סנילית [1]. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הראו כי ל-Cistanches Herba יש פעילויות ביולוגיות שונות כגון אנטי ניוון עצבי, ויסות חיסוני ואנטי דלקתיות [2,3]. החקירות הקודמות שלנו אימתו את זהתמצית Cistanche tubulosa(CTE), המורכבים מ-48.6 אחוזים פניל-אתנואידים גליקוזידים (PhGs), 6.9 אחוזים גליקוזידים אירידואידים, ו-20.0 אחוזים מכלל סכרידים, יכולים להקל באופן ניכר על תסמיני דיכאון של חולדות דיכאוניות כרוניות בלתי צפויות (CUS) על ידי חולדות דיכאוניות. שחזור הומאוסטזיס של מיקרוביוטה במעיים [4]. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ששינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי היו קשורים להתפתחות והתקדמות של דיכאון [5,6]. השפע היחסי של הזנים המיקרוביאליים היה מופרע באופן ניכר בחולדות מודל CUS דיכאוניות בהשוואה לביקורות רגילות [7]. בחולים מדוכאים, המגוון והעושר של המיקרוביוטה של ​​המעיים השתנו גם באופן משמעותי [8]. יתר על כן, תרכובות שונות כולל פניל-אתנואידים גליקוזידים (PhGs) וגליקוזידים אירידואידים נחשבו כמרכיבים העיקריים של Cistanches Herba [2,3], שעברו חילוף חומרים בקלות לגליקוזידים משניים ואגליקונים שלהם, כולל הידרוקסיטירוסול (HT), 3,4-dihydroxyphenethyl גליקוזיד, חומצה גניפוזידית דגליקוזילטית וכו' על ידי מיקרוביוטת מעיים אנושית. מטבוליטים אלו נספגים בקלות רבה יותר דרך המעי ומפעילים פעילות ביולוגית התואמת את רכיב האב-טיפוס[9-11]. לפיכך, אנו מאמינים כי במהלך התרחשות והתפתחות של דיכאון, ההפרעה במבנה המיקרופלורה של המעי תשפיע בהכרח על חילוף החומרים של תרופות סיניות מסורתיות (TCMs) בדרכי העיכול, בנוסף להשפעה על המצב הפיזיולוגי של המארח. רוב הנתונים המטבוליים הקיימים של Cistanches Herba מגיעים ממחקרים מטבוליים על בעלי חיים בריאים [12-15]. לכן, יהיה זה בעל משמעות קלינית יותר לחקור את הפרופיל המטבולי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במצב הפתולוגי בהבהרת מרכיביו הביו-אקטיביים והבנת מנגנון הפעולה ליעילותו האנטי-דיכאונית.

במחקר הנוכחי, אנו שואפים לאפיין את הפרופילים המטבוליים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות מודל דיכאוניות בריאות והן כתוצאה מ-CUS על ידי כרומטוגרפיה נוזלית quadrupole quadrupole time-of-fly spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS). מיץ קיבה, נוזל מעי ומיקרוביוטה של ​​חולדות פתולוגיות נורמליות ודיכאוניות שימשו כדי לדמות את התהליך המטבולי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במערכת העיכול במבחנה, באופן עצמאי וברצף. מטבוליטים in vivo מובהרים גם לאחר מתן אוראלי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות רגילות ו-CUS. מחקר זה מספק תובנות חדשות לגבי חילוף החומרים והמטבוליטים הפעילים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)לדיכאון.

2. חומר ושיטות

2.1. חוֹמֶר

גבעולים מיובשים של C. tubulosa נאספו ממחוז Hetian (Xinjiang, סין). דגימות דגימת השובר אושרו על ידי פרופ' שיאובו לי והופקדו בעשבון של בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת שנגחאי ג'יאאו טונג (שנחאי, סין). נעשה שימוש בשיטת החילוץ כפי שצוין בפרסום הקודם שלנו [4]. התמצית Cistanche tubulosaדגימות (CTE) אוחסנו ב-4 מעלות והומסו מחדש במים סטריליים לפני השימוש. תמיסות המים הסטריליות של ה-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)לאחר מכן סוננו הדגימות דרך ממברנה 0.22 מיקרומטר, והתסננים נאספו בצינורות סטריליים.

Echinacoside סופק על ידי המעבדה של ד"ר פנגפיי טו, אוניברסיטת פקינג (בייג'ינג, סין). Acteoside, isoacteoside, 2′-acetylacteoside, ו- cistanoside A נרכשו מסצ'ואן ווייקקי ביולוגית טכנולוגיה Co., Ltd. (צ'נגדו, סין). Hydroxytyrosol, Caffeic acid, 3,4-dihydroxybenzenepropionic acid, 3-hydroxyphenylpropionic acid,ו-3-phenylpropionic acid נרכשו מ-Aladdin IndustrialInc. (שנגחאי, סין). הטוהר של כל רכיב נקבע להיות> 95 אחוזים על ידי HPLC-UV. אצטוניטריל בדרגת HPLC נרכש מ-Merck (Darmstadt, גרמניה). מים דה-יונים הוכנו ממים מזוקקים באמצעות מערכת לטיהור מים Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ארה"ב). כל שאר הריאגנטים והכימיקלים שהיו בשימוש היו בדרגה אנליטית.

2.2. ניסויים בבעלי חיים

חולדות Sprague-Dawley ממין זכר (200 ± 20 גרם) נרכשו מחברת Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (בייג'ינג, סין), ושוכנו במרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת שנגחאי JiaoTong (שנחאי, סין). החיות אוכסנו בקבוצה תחת טמפרטורת חדר מבוקרת (25 ± 2 מעלות, 55 ± 10 אחוזי לחות יחסית) עם מחזור אור-חושך של 12:12 שעות. החולדות הורשו גישה חופשית לחולדות מעבדה רגילות למזון ולמים למשך שבוע. המתקנים והפרוטוקולים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאאו טונג (שנחאי, סין).

לאחר התאקלמות של שבוע, 12 חולדות תמימות חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות (n=6), קבוצת הביקורת וקבוצת הלחץ הכרוני הבלתי צפוי (CUS). חולדות CUS פותחו כמו בדוח הקודם שלנו [4], שהיו נתונים למגוון גורמי לחץ: רעש לבן (100 dB) למשך שעה אחת, תאורה סטרובוסקופית בעוצמה נמוכה למשך לילה (120 הבזקים לדקה), מניעת מים למשך 24 שעות, ריקון בקבוקי מים למשך שעה אחת (לאחר מניעת מים), מחסור במזון למשך 24 שעות, איפוק פיזי (1-2 שעות), שחייה מאולצת (5 דקות), כלוב מלוכלך למשך 24 שעות (200 מ"ל מים במצעי נסורת 100 גרם), צביטה בזנב ( 1 דקה), הלם למשך 30 דקות, הטיית כלוב ב-45 מעלות למשך 24 שעות, ותאורת לילה (12 שעות). סטרס הופעלו באופן רציף ואקראי במשך 4 שבועות, הסידור המפורט מתואר בטבלה S1. לאחר 4 שבועות של לחץ, בוצעו בדיקת העדפת הסוכרוז, בדיקת השדה הפתוח ובדיקת האכלה מדוכאת כמתואר קודם [4]. המתאר של ה-CUS והמבחן ההתנהגותי מוצג באיור S1. לאחר בדיקות התנהגות, התקבלו לפחות 4 כדוריות צואה מכל חולדה והונחו בצינורות חרוטיים סטריליים לצורך ניתוח חוץ-גופני של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)חילוף חומרים.

2.3. מטבוליזם במערכת העיכול של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי חולדה רגילה ו-CUS במבחנה

2.3.1. מטבוליזם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיצי קיבה ומעי מדומים

חמישים מיליגרם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)נוספו ל-10 מ"ל של מיץ קיבה מדומה ומיץ מעיים, בהתאמה. ואז CTE(תמצית Cistanche tubulosa)הודגר ב-37 מעלות למשך 4 שעות במיץ קיבה ו-6 שעות במיץ מעיים. התערובת המתורבתת (1 מ"ל) נכבתה עם 3 מ"ל של n-בוטנול רווי במים מיד ב-0 ו-4 שעות במיץ קיבה, וב-0 ו-6 שעות במעיים. שיטת העיבוד של המדגם בשימוש הייתה כמתואר קודם [9].

2.3.2. מטבוליזם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי מיקרוביוטת מעיים של עכברוש רגיל ו-CUS

דגימות צואה טריות של חולדות רגילות ו-CUS היו תחילה מעורבות והומוגניות עם נפח פי 25 של מרק GAM. משקעים הוסרו על ידי סינון דרך שלוש חתיכות גזה. לאחר מכן הודגר התרחיף ב-37 מעלות באינקובטור אנאירובי שבו הוחלף האוויר בתערובת גז (H2 5 אחוז, CO2 10 אחוז, N2 85 אחוז). 50 מיליגרם של CTE נוספו ל-5 מ"ל צואה של חולדה רגילה ו-CUS בנפרד, והתרחיף הודגרה ב-37 מעלות למשך 48 שעות. התערובת המתורבתת הוסרה וחולצה עם n butanol רווי מים ב-0, 12, 24 ו-48 שעות. שיטת עיבוד המדגם תוארה בעבר [9].

2.3.3. מטבוליזם רציף של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי מיץ קיבה, מיץ מעיים, מיקרוביוטת מעיים של עכברוש רגיל ו-CUS

ראשית, 100 מ"ג של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)הוספה ל-1{{10}} מ"ל מיץ קיבה מדומה והודגר ב-37 מעלות למשך 4 שעות. התגובה כולה נכבתה בנפח פי 3 של n-בוטנול רווי מים, וצנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 15 דקות, ולאחר מכן אידוי של הסופרנטנט מתחת לזרם של חנקן גז ב-37 מעלות. שנית, השארית הומסה מחדש ב-0.4 מ"ל מים סטריליים, הוספה ל-8 מ"ל של מיץ מעיים מדומה, והודגרה ב-37 מעלות למשך 6 שעות. הדגימה עם מיץ הקיבה הוכנה מראש באותו אופן. לבסוף, השארית הומסה מחדש ב-0.3 מ"ל מים סטריליים, הוספה ל-6 מ"ל צואה של חולדות רגילות ו-CUS בהתאמה, והודגרה ב-37 מעלות למשך 48 שעות באינקובטור אנאירובי. מיליליטר אחד מהתגובה נכבה על ידי 3 מ"ל של n-בוטנול רווי במים מיד ב-0 ו-4 שעות במיץ קיבה, ב-0 ו-6 שעות במיץ מעיים, וב-0, 12, 24 ו-48 שעות במיקרוביוטת מעיים של חולדה. . המדגם עובד באופן זהה CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיץ קיבה מדומה.

2.4. מטבוליזם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי חולדה רגילה ו-CUS in vivo

כל חולדה בשתי הקבוצות אוכסנה אז בכלוב מטבולי אינדיבידואלי. לאחר צום לילה שאיפשר רק גישה חופשית למים, כל החולדות קיבלו דרך הפה 2 מ"ל מים דרך צינור אגס. דגימות שתן ריקות וצואה נאספו מכל החולדות מ-0 שעות עד 12 שעות. יתר על כן, CTE(תמצית Cistanche tubulosa)(400 מ"ג/ק"ג) ניתנו באמצעות מתן. דגימות שתן וצואה נאספו מ-0 שעות עד 24 שעות. כל דגימות השתן והצואה אוחסנו מיד ב-80 מעלות.

דגימות שתן וצואה מחולדות רגילות ו-CUS טופלו מראש כפי שתואר קודם [12]. כל הדגימות שהתקבלו נותחו על ידי UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. שיטה אנליטית

UPLC בוצע על מערכת Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, ארה"ב) עם עמודה ACQUITY UPLC BEH C18 (100 מ"מ × 2.1 מ"מ מזהה, 1.7 מיקרומטר, Waters Corp. , ארה"ב) על ידי פליטת שיפוע תוך שימוש ב-{{10}}.1 אחוז חומצת פורמי אצטוטריל (A) ו-0.1 אחוז חומצה פורמית במים (B) בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה . פרופיל השיפוע היה: 0-5 דקות (A:5-20 אחוז), 5-7.5 דקות (A: 20-30 אחוז), 7.5-10 דקות (A: 30-70 אחוז), 10-11 דקות (A : 70-100 אחוז), והוחזק למשך 1.5 דקות. השיפוע הוחזר ל-5 אחוזים תוך 0.5 דקות והוחזק למשך 2.5 דקות לריצה הבאה. נפח ההזרקה היה 3 μL. הטמפרטורה של תנור העמוד הייתה מוגדרת ל-35 מעלות.

ספקטרומטריית מסה בוצעה באמצעות ספקטרומטר מסה Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, ארה"ב). יינון בוצע במצב אלקטרוספריי שלילי (ESI-). הפרמטרים של MS היו כדלקמן: מתח נימי, −2.0 kV; מתח חרוט, 20 וולט; טמפרטורת מקור, 120 מעלות ; טמפרטורת ההשמדה, 500 מעלות ; זרימות גז של חרוט והתפרקות, 50 ו-1000 ליטר לשעה, בהתאמה. למדידת מסה מדויקת, לאוצין-אנקפאלין שימש כמסת הנעילה ליצירת יון [M-H]- (m/z 554.2615). ניסוי MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) בשתי פונקציות סריקה בוצע באופן הבא: פונקציה 1 (אנרגיה נמוכה): m/z 50–1000, זמן סריקה של 0.25 שניות, עיכוב בין סריקה של 0.02 שניות, אנרגיית התנגשות של 6 eV; פונקציה 2 (אנרגיה גבוהה): m/z50–1000, זמן סריקה של 0.25 שניות, עיכוב בין סריקה של 0.02 שניות, רמפת אנרגית התנגשות של 20–45 eV.

2.6. עיבוד נתונים

הנתונים עובדו באמצעות תוכנת UNIFI 1.8.1 (Waters Corp.,Milford, MA, ארה"ב) לזיהוי מטבוליטים בתוך הנתונים הגולמיים בסריקה מלאה המדויקת שנאספו באמצעות MSE. תרכובות זוהו על סמך מסה מדויקת, שברי בספקטרומטריית מסה באנרגיה גבוהה. סף העוצמה נקבע כ-100.0 ספירות. זיהוי היעד, סובלנות התאמת הפרגמנטים ופרמטרים אחרים הוגדרו אוטומטית.

3. תוצאות

3.1. שינויים התנהגותיים בעכברוש הדיכאון המושרה ב-CUS

החולדות עם תסמיני דיכאון הנגרמים על ידי CUS הוערכו על ידי בדיקות התנהגותיות כולל מבחן העדפת סוכרוז, מבחן שדה פתוח ומבחן האכלה מדוכאת. מבחן ה-t של התלמיד גילה שהעדפת סוכרוז במבחן העדפת סוכרוז (p <.001), המרחק="" הכולל="" בבדיקת="" השדה="" הפתוח="" (p=""><.001), והשהייה="" לאכילה="" במבחן="" האכלה="" מדוכאת="" חידוש="" (p=""><.01) היו="" מובהקות="" שונה="" בהשוואה="" לקבוצת="" הביקורת="" לאחר="" טיפול="" cus="" של="" 4-שבוע="" (איור="" 1).="" ממצאים="" אלו="" הצביעו="" על="" כך="" שמודל="" הלחץ="" הכרוני="" הבלתי="" צפוי="" פותח="">

3.2. אפיון המרכיבים הכימיים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)

ניתוח מקיף של מרכיבי אב טיפוס של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בוצע על ידי UPLC-Q-TOF-MS. בסך הכל, 27 בוחרים מ-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)זוהו ואופיינו באופן טנטטיבי, כולל 20 PhGs, 5 אירידואידים ו-iridoid גליקוזידים ו-2 אוליגוסכרידים. מידע מפורט, כולל זמן שמירה, MS מדויק, ו-MS/MS fragment יוני מופיעים במידע התומך (טבלה S2) כדי לספק תובנה לגבי המבנה של מרכיבים כימיים אלה. UPLC-Q-TOF-MS סך יונים (TIC) של CTE הוצג באיור S2.

3.3. מטבוליזם במערכת העיכול של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי חולדה רגילה ו-CUS במבחנה

במחקר זה, המטבוליטים הפוטנציאליים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי חוליות נורמליות ו-CUSrats במבחנה זוהו מה-TICs וזוהו עם שילוב של קומפוזיציות יסוד וספקטרום מסה של מקטע MS/MS לאחר השוואה ביניהם לדגימות הביקורת. כל המטבוליטים מ-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיצי קיבה ומעי מדומים, מיקרוביוטת מעיים של עכברוש רגילה ו-CUS מופיעות בטבלה 1.

3.3.1. מטבוליזם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיצי קיבה ומעי מדומים

שבעה מטבוליטים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיץ קיבה מדומה זוהו באופן זמני על ידי מידע מדויק על מסה וחלקי MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1.66 דקות), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12, 2.36 דקות), M5 (m/z 430, C100. 2.60 דקות), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 דקות), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20,4.77 דקות), M16 (m/z 827.2580, C37H48O73, min.) ו-M.z .1968, C29H36O15, 5.81 דקות). דה-גליקוזילציה, דה-הידרוקסילציה, דה-הידרוגנציה ואיזומריזציה נחשבו כמסלולים המטבוליים העיקריים של CTE במיץ קיבה. M4 ו-M5 נמצאו כבעלי משקל מולקולרי של 2 Da ו-16 Da נמוך ממרכיב האב-טיפוס שלהם, decaffeoylacteoside, ולכן זוהו כמוצרים מפורקים ו-dehydroxylated שלו, בהתאמה. M12 זוהה כאיזומר של echinacoside, המייצר את אותם יונים כמו echinacoside ב-m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

אותם מטבוליטים זוהו לאחר CTE(תמצית Cistanche tubulosa)דגירה במעיים. ראוי לציין שקבוצת הקפאויל במיקום C-6′ ב-PhGs עברה חילוף חומרים בקלות על ידי אנזימי עיכול במיץ המעיים כדי לייצר את המטבוליטים של דה-קפאיל וחומצה קפאית.

3.3.2. מטבוליזם של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי מיקרוביוטת מעיים של עכברוש רגיל ו-CUS

בסך הכל 20 מטבוליטים עברו טרנספורמציה ביולוגית מ-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיקרוביוטה רגילה של מעיים זוהו וזוהו (איור 2). לפי התוצאות, נצפה ש-PhGs התפרקו לאגליקון הידרוקסיטירוסול (HT) M2 (מ/ז 153.0550, C8H10O3, 1.78 דקות), וחומצה קפאית (CA) M7 (מ/ז 179.0338, C9H8O4 דקות, ואז הם 2.85 דקות). עברו מטבול נוסף ל-M3 (מ/ז 163.0390, C9H8O3, 2.02 דקות), M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2.76 דקות), M10 (מ/ז 195.0655, C10H12O4, 4.15 דקות) ו-M6 (m/z/z.) , C9H10O3, 4.36 דקות) באמצעות דהידוקסילציה, הפחתה ומתילציה. בנוסף, המסלולים המטבוליים המרכזיים שייצרו מטבוליטים ישירים של תרכובות אב-טיפוס PhG מ-CTE במיקרוביוטת מעיים רגילה של חולדה הם הפחתה, מתוקסילציה, דה-גליקוזילציה, דה-קפאואיל, דהידרוגנציה ואיזומריזציה.

לאחר דגירה במיקרוביוטת מעיים של חולדה דיכאון המושרה על ידי CUS, CTE(תמצית Cistanche tubulosa)הומר ל-20 מטבוליטים דרך אותם מסלולים מטבוליים כמו חולדות רגילות.

3.3.3. מטבוליזם רציף של CTE על ידי מיץ קיבה, מיץ מעיים, מיקרוביוטת מעיים רגילה ו-CUS

לאחר דגירה רציפה במיץ קיבה, מיץ מעיים, מיקרוביוטת מעיים של עכברוש רגיל ו-CUS, CTE(תמצית Cistanche tubulosa)עבר מטבוליזם ל-14 מטבוליטים (כולל 8 עם מיץ קיבה, 7 עם מיץ מעיים, 11 עם נורמלי ו-10 עם מיקרוביוטת מעיים של חולדה CUS). בין אלה, M2(HT) ו-M11 (3-hydroxyphenylpropionic acid, 3-HPP) היו המטבוליטים הסופיים של PhGs לאחר דגירה רציפה של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)במיץ קיבה, מיץ מעיים ומיקרוביוטה של ​​המעיים. לא היה הבדל משמעותי במטבוליטים בין חולדה רגילה ל-CUS.

M8, M9, M14, M17, M19 ו-M20 זוהו רק במטבוליזם הבלתי תלוי של CTE על ידי מיקרוביוטת מעיים רגילה ו-CUS של עכברוש. מטבוליטים אלו היו בעיקר תוצרי ביניים מטבוליים שעברו חילוף חומרים לחלוטין למטבוליטים סופיים במחקר של המטבוליזם הרציף של CTE ולכן קשה לזהותם.

3.3.4. הבדלים בין קצב חילוף החומרים של CTE לפי מיקרוביוטה רגילה של רטינטסטינלית CUS

כדי להבהיר את ההבדלים בין קצב חילוף החומרים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)לפי מיקרוביוטת מעיים רגילה ו-CUS, התוכן היחסי של 27 תרכובות אב טיפוס ו-20 מטבוליטים לאחר דגירה עם מיץ קיבה, מיץ מעיים, מיקרוביוטת מעיים רגילה ו-CUS של עכברושים נקבעו בנפרד וברצף (טבלאות S3 ו-S4). התוצאות הצביעו על כך שלמרות שלא היו הבדלים משמעותיים בין CTE(תמצית Cistanche tubulosa)מטבוליטים של חולדות נורמליות ודיכאוניות, נצפה הבדל משמעותי בקצב חילוף החומרים שלהן. לדוגמה, C2 ו-C5 זוהו כחומצה אפילוגנית 8-או האיזומר שלה. הם חולקו לחלוטין בדגימות רגילות תוך 12 שעות דגירה. עם זאת, במיקרוביוטת מעיים של חולדה מדוכאת פתולוגית, הם עברו מטבוליזם יסודי לאחר 48 שעות דגירה. היה ברור שקצב חילוף החומרים בחולדה הרגילה היה מהיר יותר מזה של חולדה CUS. תוצאות דומות התגלו מ-C18 (isoacteoside). יתר על כן, ראוי לציין ששטח השיא של M12 (איזומריזציה של אכינאקוסיד) ו-M16 (איזומריזציה של טובולוזיד A) בדגימות רגילות היה גדול בהרבה מזה שבדגימות CUS, מה שמצביע על כך שתגובת האיזומריזציה של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)היה נפוץ יותר במיקרוביוטת מעיים רגילה של חולדה בדיכאון במיקרוביוטת מעיים של חולדה.

3.4. מטבוליזם של CTE על ידי חולדה רגילה ו-CUS in vivo

על ידי השוואת דגימות ביולוגיות של הקבוצה שטופלה ב-CTE עם דגימות ביולוגיות חסרות, סך של 26 מטבוליטים (תרכובת 1-26) של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)זוהו חולדות לא נורמליות ו-CUS (טבלה 2). כרומטוגרמות UPLC אופייניות של דגימות שתן של חולדות רגילות ו-CUS מוצגות באיור 3.

3.4.1. אפיון המטבוליטים של CTE ברטורין נורמלי ו-CUS

בסך הכל 18 מטבוליטים in vivo של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות רגילות זוהו דגימות שתן בהיסוס. מטבוליטים של פירוק PhGs כולל HT ו-CA, וסולפציה נוספת שלהם (תרכובות 1, 2, 3, 5, 8 ו-16), מתילציה (6, 21, 22 ו-24), ומטבוליטים של מתוקסילציה (13 ו-14) היו מטבוליטים עיקריים בשתן רגיל של חולדות. גליקוזידים אירידואידים עברו חילוף חומרים בקלות לאגליקונים (23, 25 ו-26) באמצעות דגליקוזילציה. ראוי לציין ששום רכיב אב טיפוס לא זוהה בדגימת השתן הרגילה של חולדה.

בדגימת השתן של חולדה דיכאונית, 22 מטבוליטים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)זוהו ואופיינו. תרכובת אב טיפוס אחת, 8-חומצה אפילוגנית, זוהתה בשתן חולדה פתולוגי. מטבוליטים אחרים היו בהתאם לאלו שנמצאו בשתן רגיל של חולדה, כולל מטבוליטים סולפטים (1, 2, 3, 8, 10 ו-16), מטבוליטים מתילטים (6, 11, 19 ו-22), מטבוליטים מתוקסילטים (13 ו-14) של HT ו-CA, ותאגליקונים של גליקוזידים אירידואידים (25 ו-26).

3.4.2. אפיון המטבוליטים של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בצואה רגילה ו-CUS

במחקר זה, רק מטבוליט אחד (תרכובת 20, 3-HPP) של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)זוהה בצואה רגילה של חולדה. רוב ה-PhGs הופרדו לראשונה ל-CA וכתוצאה מכך עברו חילוף חומרים נוסף למטבוליט המיקרוביאלי העיקרי שלו, 3-HPP. בדגימת הצואה מהחולדה של CUS, 3 מטבוליטים אופיינו באופן מובהק, כולל סולפט 3-HPP (תרכובת 16) ו- HT סולפטיד (תרכובות 2 ו-3).

3.4.3. הבדלים בין מטבוליטים in vivo של CTE ב-CUSrats נורמליים

לאחר מתן אוראלי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa), המטבוליטים in vivo הראו הבדלים ברורים בחולדות מודל בריאות ודיכאוניות. 21 מטבוליטים (תרכובת 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17 ו-19-26) זוהו בדגימות בריאות ובדגימות חולדות CUS. תרכובת 23 (חומצה deglycosylatedgeniposid) זוהתה רק בדגימות חולדות בריאות, בעוד תרכובות 4 (HT), 7 (8-חומצה אפילוגנית), 15 (3, 4-חומצה דיהידרוקסי-בנזנפרופיונית) ו-18 ({{ 19}}צימוד גלוקורוניד HPP) זוהו רק בדגימות חולדות ממודל CUS. לסיכום, מרכיבי אב טיפוס זוהו רק בחולדות CUS, ואילו מטבוליטים נוספים של שלב II התגלו בחולדות רגילות.

4. דיון

במחקר זה, שלושה מודלים של דגירה חוץ גופית, כולל מיץ קיבה, מיץ מעיים, מיקרוביוטת מעיים רגילה ו-CUS של עכברוש, הופעלו באופן עצמאי וברצף כדי לחקור את הפרופיל המטבולי של מערכת העיכול של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בַּמַבחֵנָה. נמצא כי PhGsand גליקוזידים אירידואידים ב-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)עברו חילוף חומרים בקלות לגליקוזידים המשניים והאגליקונים שלהם על ידי מיקרוביוטת מעיים דיכאונית הנגרמת על ידי CUS. לאחר מכן, מטבוליזם in vivo של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות רגילות ו-CUS אומת גם. המסלולים המטבוליים המוצעים עבור CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות דיכאוניות בריאות ו-CUS מוצגות באיור 4. PhGs, כגון echinacoside ו-acteoside, עברו מטבוליזם ל-HT ו-CA, ו-CA עבר חילוף חומרים נוסף למטבוליט המיקרוביאלי העיקרי שלו, 3-HPP. לאחר מכן, HT, CA ו-3-HPP עברו חילוף חומרים למטבוליטים סולפטים, מתילטים ומתוקסילטים שלהם. גליקוזידים אירידואידים, כולל חומצה גניפוסידית, קנקנוסיד A וקנקנוסיד N, עברו מטבוליזם לאגליקונים שלהם באמצעות דגליקוזילציה. אלה עוד הוכיחו כי PhGs וגליקוזידים אירידואידים ב-CTE(תמצית Cistanche tubulosa)עברו מטבוליזם קל לגליקוזידים ואגליקונים משניים בחולדות CUS. מטבוליטים אלה מפגינים בדרך כלל ספיגה טובה יותר במעיים וזמינות ביולוגית כדי להיספגים עוד יותר בדם כדי להפעיל פעילות ביולוגית [16-18]. ראוי לציין כי איזומריזציה הייתה נפוצה עבור PhGs במערכת העיכול, מטבוליטים רלוונטיים זוהו לאחר שהושוו לזמן השמירה של UPLC של תרכובות אב הטיפוס שלהם בהתבסס על פרופיל גרדיאנט אידיאלי UPLC אופטימלי.

חומצת קפאית הייתה תוצר הפירוק העיקרי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)על ידי מיקרוביוטת מעיים של חולדה דיכאונית פתולוגית. פרסומים קודמים דיווחו כי חומצת קפאית מייצרת השפעות דמויות נוגדות דיכאון בבדיקת שחייה מאולצת בעכברים. גם רמת ה-mRNA של גורם neurotrophic (BDNF) שמקורו במוח בקליפת המוח הקדמית וגם רמת ה-mRNA TrkB ב-theamygdala ירדה באופן משמעותי לאחר בדיקת השחייה הכפויה, וההפחתה הקודמת עוכבה באופן משמעותי על ידי חומצה קפאית [19]. Hydroxytyrosol היה האגליקון של PhGs, אשר מגן על נוירוגנזה ותפקוד קוגניטיבי על ידי מניעת הורדת ויסות הנגרמת על ידי מתח של חלבון עצבי BDNF [20]. לפיכך, יש צורך להקדיש יותר תשומת לב לכמה מטבוליטים ביו-אקטיביים (כלומר, HT ו-CA) שהשתנו על ידי מיקרוביוטה של ​​המעי לאחר מתן אוראלי.

בנוסף, הממצאים הנוכחיים מספקים הוכחה לכך שבמיקרוביוטת מעיים דיכאונית, היכולת המטבולית ליצור גליקוזידים משניים ואגליקונים הייתה חלשה משמעותית מזו של מיקרוביוטת מעיים לא תקינה של חולדה. הסיבה עשויה להיות מיוחסת לשינויים מבניים הנגרמים בדיכאון של מיקרוביוטת המעיים, אשר מובילים לירידה בפעילות של אנזימים מטבוליים המיוצרים על ידי מיקרוביוטה של ​​המעי [21]. מעניין, מחקר קודם הראה שפילום Bacteroidetes קידד את הגנים הגליקוזידים הידרולאז והפוליסכריד ליאז הנפוצים ביותר עבור הידרוליזה של גליקוזידים וחילוף של פחמימות מורכבות עם מנגנון סילוק [22]. באופן ספציפי, Bacteroides spp. כולל B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, ו-B. xylanisolvens הראו מספר כולל דומיננטי של גנים המקודדים GHs ו-PLs. Parabacteroides distasonis גם הוא בעל אותם מאפיינים [22]. מחקרים קודמים שלנו אישרו שגירוי סטרס כרוני בלתי צפוי ביום 28- הפחית את השפע היחסי של סוגים Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas ו-Weissella, בעוד שהגביר את Ruminococcus ו-Deinococcus בחולדות [4]. ראוי לציין ש-Bacteroides ו- Parabacteroides היו שתי הטקסיות המיקרוביאליות השכיחות ביותר שהיוו כ-20 אחוזים יחסית בשפע בחולדות רגילות. לאחר טיפול ב-CUS, השפע היחסי של Bacteroides ו- Parabacteroides ירד בחדות לכ-5% בחולדות מודל דיכאוניות. לכן, זה יוביל בהכרח להפחתה במספר הכולל של אנזימי GH ו-PL בחולדות CUS, ועוד מטריד את התגובה הדה-גליקוזילונית על ידי מיקרוביוטת מעיים דיכאונית של CUS לאחר מתן פומי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)בחולדות דוגמניות.

5. מסקנה

במחקר הנוכחי, טכניקת UPLC-Q-TOF-MS הוקמה ויושמה כדי לסנן ולזהות מטבוליטים שלCistanche tubulosaextractבחולדות רגילות ו-CUS דיכאוניות במבחנה ובאינבו. התוצאות הראו כי CTE(תמצית Cistanche tubulosa)עבר מטבוליזם לאגליקונים ותוצרי פירוק של PhGs וגליקוזידים אירידואידים על ידי מיקרוביוטת מעיים בריאה ומדוכאת כאחד. לאחר מתן אוראלי של CTE(תמצית Cistanche tubulosa), מטבוליטים שלב II של אגליקונים ותוצרי פירוק של PhGs ו-iridoidglycosides נמצאו בעיקר בשתן של חולדה. היכולת המטבולית ליצור גליקוזידים ואגליקונים משניים במיקרוביוטה דיכאונית של רטינטסטינלית הייתה חלשה בהרבה מזו של מיקרוביוטת המעיים של החולדה הרגילה, אשר יוחסה לגליקו-זידהידרולאזים הפרועים שנוצרו על ידי מיקרוביוטה מעיים בחולדות מדוכאות ב-CUS. מחקר זה מספק פרספקטיבה חדשה למאוחר יותר. פיתוח של CTE(תמצית Cistanche tubulosa)כתרופה נוגדת דיכאון פוטנציאלית.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המפתח הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2017YFC1702400).

נספח א' נתונים משלימים

ניתן למצוא נתונים משלימים למאמר זה באינטרנט בכתובת HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

מאת: ' מטבוליזם במבחנה ו-in vivo שלתמצית Cistanche tubulosaבחולדות דיכאוניות רגילות וכרוניות בלתי צפויות הנגרמות על ידי מתח' מאתYang Li, et al

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

הפניות

[1] ועדת הפרמקופיה הסינית, הפרמקופיה של הרפובליקה העממית של סין, מהדורת 2015, China Medical Science Press, Beijing, China, 2015, p. 135 חלק א'.
[2] Y. Jiang, P.-F. טו, ניתוח של מרכיבים כימיים במינים של Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: סקירה של תכונת הכימיה, הפרמקולוגיה והפרמקוקינטיקה שלו, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, השפעות דמויות נוגדות דיכאון שלתמצית Cistanche tubulosaעל חולדות מתח כרוניות בלתי צפויות באמצעות שיקום הומאוסטזיס של מיקרוביוטה במעיים, פרונט. פרמקול. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Gut-brain axis: כיצד המיקרוביום משפיע על חרדה ודיכאון, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, התפתחויות אחרונות בהבנת תפקיד המיקרוביוטה של ​​המעי בבריאות המוח ובמחלות, אן. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in gut microbiota and Fcal metabolic phenotype הקשורים לדיכאון על ידי רצף גנים 16S rRNA ו-LC/ מטבולומיקה מבוססת טרשת נפוצה, J. Pharm. ביומד. אנאלי. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: Depression-associated gut microbiota induces שינויים נוירו-התנהגותיים בחולדה, J. Psychiatr. שו' 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Human gastrointestinal metabolism of the Cistanches Herba water extract in vitro: הבהרת הפרופיל המטבולי מבוסס על זיהוי מטבוליטים מקיף במיץ קיבה, מעיים מיץ, חיידקי מעיים אנושיים ומיקרוזומי מעיים, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, זיהוי מטבוליטים של אכינאקוסיד המיוצרים על ידי חיידקי מעיים אנושיים באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים/קוודרופול זמן טיסה של זמן טיסה, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, סקר וזיהוי של שלושה מטבוליטים טיפוסיים של פנילתנואידים גליקוזידים מ- Cistanches Herba על ידי חיידקי מעיים אנושיים באמצעות UPLC/Q-TOF-MS, J. פארם. ביומד. אנאלי. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, בדיקה מהירה וזיהוי ההבדלים בין מטבוליטים של מיצוי מי Cistanche deserticola ו-C. tubulosa בחולדות על ידי UPLC- Q-TOF-MS ניתוח זיהוי תבניות משולב, J. Pharm. ביומד. אנאלי. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, מאפיינים באופן שיטתי את המטבוליטים של echinacoside ו-acteoside מ- Cistanche tubulosa בפלסמה של חולדה, מרה, שתן וצואה על בסיס UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, An approach to זיהוי מטבוליטים עוקבים של גליקוזיד פנילתנואיד טיפוסי, echinacoside, המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית-זמן לכידת יונים של
ניתוח מסה ספקטרומטריית טיסה, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of echinacoside, נוגד חמצון טוב, בחולדות: בידוד וזיהוי של המטבוליטים המרה שלו, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, הבנת המנגנונים המולקולריים של יחסי הגומלין בין תרופות צמחיות ומיקרוביוטה במעיים, מד. מילון Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorption and disposition of ginsenoside after oral oral מתן תמצית נוטוגינסנג של Panax לחולדות, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, אינטראקציות של מיקרוביוטה במעיים עם רכיבי מזון פונקציונליים וחומרי תזונה, Pharmacol. מילון 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid מחלישה את הירידה בביטוי ה-BDNF mRNA בקליפת המוח הנגרמת על ידי חשיפה למאולץ. מתח שחייה בעכברים, אירו. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, מתן הידרוקסי-טירוסול אימהי משפר נוירוגנזה ותפקוד קוגניטיבי בלחץ טרום לידתי צאצא, י. נוטר. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, השפעת המיקרוביוטה של ​​המעי על חילוף החומרים והרעילות של תרופות, מומחה. Drug Metab. טוקסיקול. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, השפע והמגוון של אנזימים פעילים בפחמימות במיקרוביוטה של ​​המעי האנושי, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.