פעילות אימונוסטימולטורית של פוליסכרידים הניתנים לחילוץ במים מ-Cistanche Deserticola כתוסף צמחי במבחנה וב-Vivo

מבוא

חיסונים חשובים לשליטה או מניעת מחלות. חיסונים חדשים שנוצרו ומתפתחים כעת הם אנטיגנים רקומביננטיים מטוהרים ביותר עם בטיחות גבוהה יותר, אך אנטיגנים מטוהרים אינם יכולים לעורר תגובה חיסונית מספקת בהשוואה להכנות פתוגנים מוחלשים או מומתים. בעזרת אדג'ובנטים, חיסונים יכולים לגרום לתגובות חיסוניות מתמשכות [1,2]. תוספים חזקים חדשים מודאגים באופן נרחב בשני החיסוניםהתפתחות ובריאות האדם. עד כה זוהו ונחקרו בהרחבה תוספים שונים. תוספים אלו מעניקים לחיסונים מספר יתרונות, כולל הפחתת הכמות הנדרשת של אנטיגנים, מזעור מספר החיסונים הנדרשים לתגובות חיסוניות תקינות, והשראת תגובות חיסוניות מהירות, רחבות וחזקות יותר [3–5]. למרות שפותחו אדג'ובנטים חזקים רבים, כמו ליפופוליסכריד (LPS) ואדג'ובנט מלא של פרוינד (FCA), הם אינם מיושמים באופן נרחב בשל רעילותם. לפיכך, רק כמה אדג'ובנטים, כגון אלום, מורשים לשימוש קליני [6]. בסך הכל, יש לפתח תוספים יעילים ובטוחים יותר כדי לקדם חיסונים מניעתיים וטיפוליים טובים יותר נגד מחלות זיהומיות ולא מדבקות.

CISTANCHE TUBULOSA טבעי להגברת החיסונית PHGS75% ECH 30% ACT 12%

בטיחות היא גורם שיקול חשוב בפיתוח אדג'ובנטים. מרכיבים עשבוניים סיניים כוללים חומרים מזינים וחומרים מרוכבים פעילים חשובים, כגון תרכובות פנוליות ופוליסכרידים, שיכולים לפעול כממריצים חיסוניים רבי עוצמה [7-9]. ביניהם, פוליסכרידים מצמחי מרפא סיניים מסורתיים נחקרו בהרחבה בשל פעילותם החיסונית והרעילות הנמוכה שלהם. לדוגמה, אינולין הוא תוסף חיסוני ללא רעילות של תוספים אחרים כגון FCA. AdvaxTM delta inulin גם שיפר בהצלחה את האימונוגניות של החיסון [10,11]. אסטרגלוס, הידוע גם בשם Huangqi בסינית ו- Radix Astragali בלטינית, מופץ באופן נרחב ברחבי העולם. פוליסכריד הוא אחד המרכיבים הפעילים העיקריים שלו האחראים על הפעילות האימונומודולטורית. מחקרים ניסיוניים הוכיחו כי לפוליסכריד Astragalus היו השפעות אימונומודולטוריות חזקות הן במבחנה והן במבחנה [12, 13]. פוליסכרידים מסוג Lycium barbarum כתוסף חיסון הראו גם שיפורים טובים והשפעות מעוררות [14, 15]. מחקרים אלו העלו כי פוליסכרידים סיניים צמחיים היו מועמדים אידיאליים לפיתוח אדג'ובנט.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" בסינית) הוא עשב סיני מסורתי רב ערך ונחשב בדרך כלל כ"ג'ינסנג של המדבריות" בגלל ההשפעות הטוניקות המעולות שלו. הוא מופץ באזורים צחיחים או צחיחים למחצה בשינג'יאנג. בסין, הגבעול הבשרני המיובש שלו שימש כמזון טוניק במשך מאות שנים [16, 17]. במשך שנים רבות, CD מבושל שימש כמזון טוניק לטיפול בליקוי כתוצאה מלחץ יתר, דבר המצביע על כך שהוא בטוח למתן דרך הפה. צמח זה נחשב באופן נרחב בשל תפקידיו הרפואיים הרחבים. מחקרים פיטוכימיים ותרופתיים עדכניים הראו שפוליסכרידים היו הרכיבים הפעילים העיקריים מבחינה ביולוגית והיו להם השפעות ביולוגיות שונות, כוללפעילות אימונומודולטורית, השפעה נוגדת חמצון והשפעות אנטי דלקתיות[18–21]. עם זאת, פעילות השיפור החיסונית של פוליסכרידים הניתנים לחילוץ מים מ-C. deserticola ב-Xinjiang דווחה רק לעתים רחוקות.

ידוע היטב ש-DCs הם תאים המציגים אנטיגן חשובים (APCs) המספקים אותות הנדרשים להפעלת תגובות חיסוניות ולוויסות תאים מולדים ומסתגלים. חלק מהתוספים המשפרים את ספיגת האנטיגן על ידי DCs יכולים להגביר מולקולות קו-סטימולטורי או MHC ולשפר חסינות. כשהתבגרות DCs מתחילה, נוצרות יותר מולקולות מעוררות שיתוף וציטוקינים ו-DCs מראים פנוטיפים ברורים [22, 23].

במחקר זה, ניצלנו לראשונה האם WPCD יכול לקדם את ההפעלה של DCs דרך מסלול האיתות TLR4 in vivo. מכיוון ש-DCs היו הקשר בין תגובות חיסוניות מולדות להתאמה, שיערנו שהפעלת DCs מגורה על ידי WPCD תשפיע על התוצאה של חסינות אדפטיבית. בדקנו את התגובה החיסונית הספציפית לאובלבומין (OVA) בעכברים שטופלו ב-WPCD, כולל טיטרים של תת-סיווג IgG, IgG1 ו-IgG2a, שגשוג T ו-B, וייצור ציטוקינים. בדקנו האם טיפול ב-WPCD יגדיל את הפעילות של תאי DC ותאי Treg בטחול של עכברים אלו. הממצאים שלנו הוכיחו את הפעילות האימונומודולטורית הפוטנציאלית של פוליסכרידים טבעיים מ-C. deserticola והרחיבו את היקף היישום שלו.

חומרים ושיטות

בעלי חיים

עכברי נקבות C57BL/6, BALB/c או ICR בני שמונה עד עשרה שבועות נרכשו מבית החולים הראשון של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג (Urimuqi, Xinjiang, סין). העכברים אוכסנו בתנאים נטולי פתוגנים בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) של אוניברסיטת שינג'יאנג לבריאות ורווחת בעלי חיים. נהלי הניסוי בבעלי חיים אושרו על ידי AUCC של אוניברסיטת שינג'יאנג.

מיצוי תמציות מימיות

C. deserticola הוא מפעל במחוז שינג'יאנג בסין. הפוליסכריד הגולמי הושג באמצעות מיצוי מים ומשקעים אתנול. בקצרה, 100 גרם של C. deserticola מיובש נטחן לאבקה ולאחר מכן סונן. האבקה הוחזרה עם אתר נפט בטמפרטורת החדר שוב ושוב ולאחר מכן הוחזרה עם אתנול נטול מים למשך שעה אחת כדי להסיר מרכיבים צבעוניים ושומנים. שאריות חולצו עם מים רותחים במשך שלוש פעמים והתמציות אספו יחד, עברו צנטריפוגה ב-4000 סל"ד למשך 10 דקות, ועברו ריפלוקס ב-60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. ארבע פעמים נפח של 95% אתנול נוספו לתמיסה כדי לזרז פוליסכרידים גולמיים. הפוליסכרידים הגולמיים הומסו מחדש במים מזוקקים וטופלו עם ריאגנט Sevage להסרת חלבונים. תמציות הומסו ב-PBS ועוקרו דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. לבסוף, תכולת הסוכר הכוללת של WPCD הייתה 59.58%, כפי שצוין על ידי ניתוח פנול-חומצה גופרתית [24].

דור של DCs

BM-DCs נוצרו על פי השיטה שתוארה קודם לכן עם שינויים קלים [25]. מח עצם DCs מעכברי C57BL/6 נשטפו עם מדיום RPMI-1640 שלם (Gibco) בתוספת של 10% סרום עגל עוברי (Hyclone). התאים שנאספו הושעו מחדש במדיום RPMI-1640 עם 50 מיקרומטר -מרקפטואתנול (Sigma, St Louis, MO) ו-20 ng/mL GM-CSF עכבר (Peprotech, Rocky Hill, NY) והודגרו ב-37˚ C באווירה של 5% CO2. מחצית ממד התרבות הוחלף במדיום טרי המכיל GM-CSF כל 1-2 ימים. תאים נאספו ביום 6, טופלו במינונים שונים של WPCD ו-LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) למשך 24 שעות, ולאחר מכן הוערכו על ידי ציטומטריית זרימה.

זיהוי התבגרות של DCs והפעלת תאי T במבחנה

השפעת ההתבגרות במבחנה של WPCD על BM-DCs הוערכה על סמך תוצאות ניתוח פנוטיפי על ידי FACs. ביום 7, BM–DCs מ-C57BL/6 נרשמו בנוכחות GM-CSF ולאחר מכן טופלו בריכוזים שונים של WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1 ו-0.2 מ"ג/מ"ל) למשך 12 שעות בשלושה עותקים. LPS (100 ng/mL) שימש כביקורת חיובית. לאחר שטיפת BM-DCs ב-PBS ו-Fc Block (BD Biosciences, CA) שימש למניעת קישור נוגדנים לא ספציפי, תאים נצבעו ב-PBS על ידי שימוש ב-FITC-, PE-, או APC-מצומד CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80 ו-MHC-II נוגדנים (BD) למשך 20 דקות ב-37°C. התאים המוכתמים זוהו על ידי FACs Calibur (BD). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת FlowJo (Tree Star).

בניסוי ההתבגרות של DCs במבחנה, נאספו גם סופרנטנטים של תרבית תאים כדי לנתח IL-12 ו-TNF- על ידי שימוש בערכות בדיקת ציטוקינים (בוסטר, ווהאן, סין) לפי הוראות היצרן. הספיגה ב-450 ננומטר נמדדה עם קורא לוחות ELISA (Bio-Rad, ארה"ב). כמויות ציטוקינים בדגימות חושבו עם עקומות סטנדרטיות של ציטוקינים רקומביננטיים לפי שיטת הרגרסיה הליניארית.

כדי לבדוק את פעילות הגירוי האלוגני שלהם, הניסוי של תגובה לימפוציטים מעורבת (MLR) בוצע לפי השיטה הקודמת [26] על ידי בדיקת MTT (Sigma, St Louis, MO). בקצרה, BM-DCs מעכברי C57BL/6 המשמשים כתאי ממריצים אוששו ביום 7 במדיום RPMI-1640 בתוספת GM-CSF וטופלו בריכוזים שונים של WPCD במשך 12 שעות ב-37°C. התאים נשטפו והושעו מחדש במדיום RPMI-1640 לפני הציפוי לתוך 24-צלחת הבאר. תאים מגיבים להשעיה של Singleplenocyte בודדו מעכברי BALB/c. BM-DCs היו מעורבבים עם splenocytes לפי היחסים של 1:5 ו-1:10. תאים תורבו ב-37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 למשך שלושה ימים בשלושה עותקים. טיפול ב-LPS שימש כביקורת חיובית. לאחר מכן נוספו תרבויות עם 20 μL של MTT עבור הטיפוח האחרון של 4- שעות. הספיגות באורך הגל המדידה (490 ננומטר) ואורך הגל הייחוס (650 ננומטר) נמדדו עבור ניתוח התפשטות תאי T. כל הדגימות נמדדו על רקע בקרת רקע.

CISTANCHE TUBULOSA טבעי לשיפור מערכת החיסון שלך PHGS75% ECH 30% ACT 12%

טיפול במעכבי TLR4 במבחנה

BM-DCs טופלו מראש ב-5 מיקרומטר TAK-242 (מעכב TLR4, Medchemexpress Inc. USA) למשך שעה אחת ולאחר מכן תורבו יחד עם ריכוזים שונים של WPCD (100 ו-200 ug/mL) למשך 12 שעות בנוכחות או בהיעדר גולגי סטופ בשלושה עותקים. בבקרה החיובית נוספה LPS. תאים וסופרנטנטים זוהו על ידי FACs לניתוח סמני שטח CD86 ו-CD40 ועל ידי ELISA לניתוח ציטוקינים TNF-a ו-IL-12, בהתאמה.

פרוטוקול חיסון

בדיקת רעילות חריפה

במבחן הרעילות החריפה של הפה במחקר זה, נעשה שימוש ב-40 עכברי ICR בוגרים בריאים. עכברי ICR צמו (אוכל אך לא מים למשך הלילה) לפני המינון. WPCD ניתנה דרך הפה בהתאמה במינונים של 0, 50, 500 או 5000 מ"ג/ק"ג משקל גוף לכל חיה במשך 7 ימים. עכברים שטופלו במי מלח ועכברים שטופלו באלום נכללו בקבוצת הביקורת. החיות נצפו מדי יום במשך 14 ימים רצופים. העכברים נצפו בנפרד כדי לתעד תמותה וסימנים קליניים. בנוסף, לאורך הניסוי נמדדו משקלי הגוף וצריכת המזון והמים. ביום 14, מדד הטחול או התימוס חושב כ(משקל טחול או תימוס/משקל גוף) × 10.

זיהוי פעילות אימונומודולטורית של WPCD in vivo.

כדי לחקור אם ל-WPCD יש פעילות אימונומודולטורית, אולבומין (OVA) (Sigma) שימש כאנטיגן המודל, ועכברי ICR נקבות הופרדו באופן אקראי ל-7 קבוצות (קבוצת ביקורת שלילית (0.9% NaCl ו-WPCD 400 ug. ) והביקורת החיובית (אלום 200 אג' עם OVA)). העכברים ניתנו תת עורית פעמיים עם 10 ug OVA לבד או WPCD עם OVA לפי המינון של 20, 100 או 400 ug עם מרווח של 2-שבוע. דגימות דם וטחול התקבלו לאחר חיסון המאיץ כדי לזהות טיטרים של IgG, תת-הקבוצות של IgG, שגשוג טפלנוציטים וציטוקינים, סמני משטח DCs ותדירות Treg.

זיהוי של נוגדנים ספציפיים ל-OVA

טיטרים ותתי מחלקות IgG ספציפיים ל-OVA נבדקו על ידי ELISA לפי השיטה הקודמת [27]. לוחות ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) צופו במשך הלילה ולאחר מכן נחסמו. דגימות סרום הודללו באופן סדרתי לצורך ניתוח טיטר IgG או זיהוי של IgG1 ו-IgG2a (Southern Biotech, Inc.). הצלחות הודגרו עם PBST המכיל IgG אנטי-עכבר מצומד HRP, IgG1 ו-IgG2a למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. התגובה הקולורימטרית פותחה עם tetramethylbenzidine (TMB) ולאחר מכן נמדדו הספיגות ב-450 ננומטר/655 ננומטר והובאו כיחידות צפיפות אופטית (OD).

זיהוי של התפשטות ספלנוציטים וציטוקינים

התפשטות הטפלנוציטים נקבעה על ידי בדיקת MTT. ביום 21 לאחר החיסון הראשון, התקבלה תרחיף ספלנוציטים בודדים. תאים תורבו במדיום RPMI-1640 בצלחות 96-באר בהתאם לריכוז של 1×106 תאים/באר בשלושה עותקים. התרבויות עוררו עם OVA (ריכוז סופי 10 ug/mL), ConA (ריכוז סופי 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) ו-LPS (ריכוז סופי 100 ng/mL) למשך 48 שעות ב-37˚C . תאים תורבו במשך 48 שעות ו-20 μL (5 מ"ג/מ"ל) של MTT (Sigma, St Louis, MO) נוספו לכל באר והודגרו למשך 4 שעות נוספות. לאחר הוספת 50 μL של DMSO לכל באר כדי לעצור את התפתחות הצבע (Sigma), הלוחות נקראו ב-570 ננומטר על ידי קורא לוחות מיקרוטיטר (BioRad, CA, ארה"ב). התפשטות הספלנוציטים התבטאה כאינדקס גירוי (SI), שהיה היחס OD570 ננומטר של באר מגורה לבאר לא מגורה.

התשואות של IL-4 ו-IFN- בתאי T נמדדו על ידי צביעת ציטוקינים תוך תאיים לפי פרוטוקול שפורסם עם שינויים קלים [27, 28]. תרחיף ספלנוציטים בודד הוכן ביום 21 לאחר החיסון הראשון. לאחר תמוגה של תאי דם אדומים, הספלנוציט (2×106 תאים/מ"ל) הודגרה עם OVA (10 ug/mL) לגירוי של 4- שעות ו-Golgi stop (BD) נוספה למשך 12 שעות דגירה, PMA חיובי לִשְׁלוֹט. תאים נאספו, נשטפו עם PBS, נצבעו ב-CD4-FITC/CD8-FITC, ותוקנו ועברו חלחול עם ערכת Cytofix/Cytoperm (BD) בהתאם להוראות היצרן. צביעת ציטוקינים תוך תאית בוצעה עם הריכוז המתאים של נוגדני IL-4-PE או IFN- -APC ב-4°C למשך 20 דקות. תאים מוכתמים זוהו על ידי FACs. ניתוח נתונים בוצע ב-FlowJo.

הערכה של התבגרות DCs ותאי Treg בטחול

לצורך ניתוח התבגרות DC מספלנוציטים בעכברים, בוצעה צביעת פני התא עם נוגדני CD11c-PE, CD40-FITC ו-CD80-APC. ביום 3 לאחר החיסון הראשון, הושג תרחיף ספלנוציטים בודדים (1×106 תאים/מ"ל) והתאים עברו צביעה כפולה. עוצמות הפלורסנט נמדדו על ידי FACs Calibur והנתונים הנמדדים נותחו על ידי FlowJo.

כדי לראות אם WPCD יכול להפחית את התדירות של תאי CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg. תרחיף ספלנוציטים בודד הוכן ביום 7 לאחר החיסון השני. הספלנוציט (2×106 תאים/מ"ל) עבר צביעה על פני התא עם נוגדן CD4-APC, ואחריו צביעה של ציטוקינים גרעיניים עם נוגדני CD25-FITC ו-Foxp3-PE המתאימים עם ערכת הצביעת תאי T הרגולטורית של עכבר (eBiosciences) לפי הוראות היצרן. התדירות של תאי CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg נבדקה על FACs. ניתוח נתונים בוצע ב-FlowJo.

ניתוח סטטיסטי

בדיקות ניתוח שונות (ANOVA) (מבחן ריבוי השוואה של Tukey) בוצעו כדי לנתח את ההבדלים בין מספר קבוצות ניסוי. כל הערכים מבוטאים כממוצע ±SD. פ< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

תוצאות WPCD קידמה את ההבשלה והתפקוד של BM-DCs במבחנה

חסינות מסתגלת נקבעת על ידי הפעלה של DCs, כולל סוגי מולקולות מעוררות שיתוף וציטוקינים [29, 30]. בתחילה, חקרנו האם WPCD יכול לקדם את הביטוי של מולקולות קו-סטימולטוריות. לפי מינונים שונים של WPCD, BM-DCs

מ-C57BL/6 ניתנו. רמות הביטוי של CD11c, CD86, CD80, CD40 ו-MHC-II בתאים נותחו (איור 1). התאים שסגרו עם SSC ו-FSC הראו שהטיפול במינונים שונים של WPCD לא שינה את המורפולוגיה של BM-DCs (נתונים לא מוצגים). רמות הביטוי של CD86, CD80 ו-CD40 היו מווסתות באופן משמעותי בצורה תלוית מינון בהשוואה לקבוצה שלא טופלה והגיעו לרמה מתחת למינון של 20 ug/mL של WPCD, אך ההבדל היה לא משמעותי בהשוואה לקבוצת ה-LPS (איור 1A-1C). רמת הביטוי של MHC-II עלתה באופן משמעותי לערכו המרבי במינון של 50 ug/mL (איור 1D). תוצאות הניתוח של סמני פני השטח הסלולריים הראו ש-DCs שטופלו ב-LPS או WPCD הראו רמות ביטוי מוגברות משמעותית של CD86, CD80, CD40 ו-MHC-II וקידמו התבגרות פנוטיפית.

חלק מהתוספים יכולים להגביר את המולקולות הקו-סטימולטוריות ב-DCs או לגרום ישירות להפרשה של ציטוקינים. IL-12 ו-TNF- הם הציטוקינים העיקריים להפעלת התגובה החיסונית Th1. ניתחנו את התשואות של ציטוקינים ב-BM-DCs בטיפול ב-WPCD. לאחר BM-DCs טופלו עם תוכן שונה של WPCD במשך 12 שעות, הסופרנטנט נאסף כדי לזהות את התוכן של IL-12 ו-TNF- עם ערכת ELISA. WPCD יכול להגביר את הייצור של IL-12 (איור 2A) ו-TNF- (איור 2B), בהתאם למינון. התוצאות הראו ש-WPCD יכול לגרום להתבגרות תפקודית של DCs.

בתגובה חיסונית, יש צורך להפעיל פונקציונלית DCs. לאחר מכן, הרמה הגבוהה יותר של שגשוג תאי T אלוגני נגרמה על ידי DCs בשלים לחלוטין. לכן, התגובה התפקודית של DCs ל-WPCD נחקרה על ידי MLR. היכולת הסטימולטורית של DCs המושרה על ידי WPCD, בדומה ל-LPS, הוגברה באופן דרמטי באופן תלוי מינון ביחס המצוין (איור 2C ו-2D). התוצאות הצביעו על כך ש-WPCD שיפר את הצגת האנטיגן ומיטב את התגובה של תאי T על ידי MLR במבחנה.

WPCD קידם את הבשלת DCs דרך מסלול TLR4

ניתן להסיק מהתוצאות שלעיל כי BM-DCs שהופעלו על ידי WPCD הצביעו על ביטויי מולקולות פני DCs דומים ל-LPS (ליגנד TLR4). לפיכך שיערנו ש-BM-DCs מופעלים על ידי WPCD דרך מסלול TLR4. לאחר BM-DCs טופלו מראש עם TAK-242 (מעכב TLR4) ותורבו יחד עם WPCD ו-LPS במשך 12 שעות, הביטוי של CD40, CD86, TNF-a או IL{{12 }} זוהה על ידי FACs או ELISA. כפי שמוצג באיור 3A ו-3B, הטיפול ב-TAK-242 הביא לביטויים מווסתים משמעותית של CD40 ו-CD86 שנגרמו על ידי LPS או WPCD, וייצור ציטוקינים של IL-12 או גם TNF-a ירדו באופן משמעותי (איור 3C ו-3D). התוצאות הצביעו על כך ש-WPCD יכול להפעיל התבגרות DC דרך מסלול TLR4.

WPCD הגבירה חסינות הומורלית ותאית

לשם השוואה, הערכנו את ההשפעות של WPCD על יצירת תגובה חיסונית הומורלית בעכברים מחוסנים ב-OVA. לפני החיסון ובימים 14, 21,

35 ו-49 לאחר החיסון הראשון, נאסף דם כדי לזהות נסיוב של IgG ו-IgG תת-סרום על ידי ELISA. תגובת נוגדני IgG ל-OVA עלתה עם העלייה במינון של מתן WPCD (100 ו-400 ug) באופן תלוי מינון (איור 4). הריכוז האופטימלי היה 100 ug/mL של WPCD והגדיל את תגובות IgG פי שניים בהשוואה ל-OVA בלבד בימים 21, 35 ו-49 (איור 4A). הושגו עליות ניכרות ברמות נוגדני IgG1 ו-IgG2a הספציפיים ל-OVA מתחת ל-20 ו-100 ug של מתן WPCD בהשוואה לקבוצת OVA בסרום ביום 35 (איור 4B). בינתיים, Alum קידם רק את רמות הביטוי של נוגדני IgG ו-IgG1 ספציפיים ל-OVA בעכברים המחוסנים. WPCD לבדו לא עורר נוגדנים ספציפיים ל-OVA. התוצאות לעיל הצביעו על כך ש-WPCD יצר טיטר נוגדנים גבוה יותר ותגובות Th1/Th2 מאוזנות יותר מאשר Alum.

התפשטות הספלנוציטים היא אינדיקטור נוסף לחסינות תאית. ConA ממריץ תאי T ו-LPS ממריץ את התפשטות תאי B. ביום ה-21 לאחר החיסון הראשון, הושג תרחיף ספלנוציטים בודדים ועוררו בהתאמה עם OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) פפטיד, ConA (5 ug/mL) ו-LPS ( 5 ug/mL) למשך 48 שעות. לאחר מכן נמדדה התפשטות תאי T בשיטת MTT. WPCD יכול לקדם באופן משמעותי את התפשטות הספלנוציטים המגורים OVA-antigen, Con A-mitogen ו-LPS בעכברים שחוסנו עם OVA ו-WPCD (איור 5) והריכוז האופטימלי של WPCD היה 100 ug/mL. נתונים אלו הצביעו על כך ש-WPCD כחומר אדג'ובנט לחיסון בעכברים מחוסנים ב-OVA יכול לגרום להפעלה של תאי T ותאי B בצורה יעילה יותר מאשר Alum.

כל תוספי ה-WCPD שנבדקו שנוסחו עם חיסוני OVA יצרו חסינות הומורלית ותאית חזקה באותה מידה (איורים 4 ו-5). בהתבסס על נתונים אלה, כדי להעריך עוד יותר את השפעות WPCD על תגובת תאי T עוזר (Th) ספציפיים ל-OVA, ניתחנו עוד ביטויי ציטוקינים בתאי CD8+ ו-CD4+ T על ידי ציטומטריית זרימה (איור 6) . ביום 21 לאחר החיסון הראשון, בודד ספלנוציט בודד של עכברים ולאחר מכן תורבה יחד עם ה-OVA (10 ug/mL). תפוקת IL-4 בתאי CD4+ T בקבוצה שקיבלה 100 ug OVA/WPCD הייתה גבוהה משמעותית מזו בקבוצת OVA/Alum וקבוצת OVA ודומה לזו ב-PMA (איור 6A). יתרה מכך, תפוקת IFN- בתאי CD8+ ו-CD4+ גדלה באופן משמעותי גם בעכברים שקיבלו OVA/WPCD (20, 100 ו-400 ug) (איור 6B ו-6C). בהשוואה לאלום אדג'ובנט, WPCD הראה יכולת טובה יותר לעורר הפרשות IL-4 ו-IFN- מתאי T.

התבגרות בגירוי WPCD של DCs וירידה בתדירות Treg in vivo DCs מוכרים כ-APCs החזקים ביותר המעורבים בהתחלת תגובות חיסוניות ראשוניות. לפיכך, ביום 3 לאחר החיסון הראשון, חקרנו גם את ההשפעות של WPCD על CD40 ו-CD80 על DCs בטחול בעכברים (איור 7A ו-7B). העכברים בקבוצת 100-ug OVA/WPCD יצרו רמות גבוהות משמעותית של CD40 ו-CD80 ב-DCs מאשר אלה בקבוצת OVA/Alum. נתונים אלה הראו כי WPCD יכול להפעיל DCs ולעורר התבגרות DC בעכברים. תאי Treg יכולים לאזן את הסבילות ואת התגובות החיסוניות. כדי להמשיך ולחקור כיצד WPCD מווסת את התגובה החיסונית, תאי Treg בטחול בעכברים נצבעו בערכת צביעת תאי T מווסתת של עכבר. ביום 21 לאחר החיסון הראשון, נצפתה ירידה בתדירות של תאי CD25+ Foxp3+ Treg בסך תאי ה-CD4+ T (איור 7C). בהשוואה לקבוצות OVA ו-OVA/Alum, קבוצת WPCD הראתה תדירות Treg מופחתת משמעותית.

הערכת בטיחות של WPCD בעכברים

כדי להעריך את הרעילות החריפה בפה, ביצענו את בדיקת הרעילות החריפה. העכברים שניתנו דרך הפה עם 5000 מ"ג/ק"ג משקל גוף לא הראו התנהגות חריגה או תופעות לוואי ולא נמצאה תמותה במבחן הערכת הרעילות. לא תועד הבדל משמעותי בעלייה במשקל הגוף, באינדקס התימוס ובאינדקס הטחול בקרב קבוצות שונות של עכברים שקיבלו מינונים שונים של WPCD ולא היה הבדל משמעותי (טבלה 1). לא נצפתה תמותה לאחר 14 ימים. לכן, ערך ה-LD50 של WPCD היה יותר מ-5000 מ"ג לק"ג משקל גוף.

כדי לבדוק אם ל-WPCD היו השפעות שליליות על צמיחת העכברים, לפני ואחרי חיסון תת עורי, משקל הגוף נקבע בהתאמה עבור כל עכבר (טבלה 2). בתצפית שלאחר מכן בעכברים, לא נצפו תופעות לוואי או התנהגויות חריגות. חוץ מזה, משקל הגוף של העכברים שקיבלו WPCD ושל העכברים שקיבלו תמיסת מלח או OVA/Alum לא הראו הבדל משמעותי. תוצאות תצפית אלו הוכיחו כי מתן WPCD היה בטוח.

דִיוּן

תוספים הם מרכיבי מפתח בחיסונים [31]. בשל ההתקדמות בגנומיקה ובפרוטאומיקה, מזוהות יותר ויותר רקומביננטים ומולקולות חיסון סינתטיות. לכן, נדרשים יותר תוספים וניסוחים. כמה תוספים חזקים קשורים בדרך כלל לרעילות מוגברת, למשל, FCA. לכן, יש צורך למצוא פורמולציה בטוחה המכילה רכיבים סינרגיסטים שונים המניעים בסופו של דבר את התגובה החיסונית הרצויה.פוליסכרידים מצמחי מרפא סיניים אינם רעיליםולא מראים תופעות לוואי משמעותיות [32,28]. דרוש תוסף בטוח עבור חיסון מסוים.

Cistanche deserticola הוא עשב טוני חשוב וקיים בשטחים צחיחים ומדבריות חמים בצפון מערב סין. Cistanche deserticola מודאגים רבים בשל הפעילות הביולוגית שלו, כולל השפעות אימונומודולטוריות, נוגדות חמצון, אנטיבקטריאליות ואנטי-גידוליות [20,21]. חלה התקדמות מסוימת באפיון המבני ובפעילות האימונולוגית של Cistanche deserticola, שהוא מועמד טוב לפיתוח אדג'ובנטים. הערכנו בניסוי את ההשפעות המסייעות והמנגנון של WPCD במבחנה ובאינבו. מתן תת עורי של WPCD קידם באופן משמעותי תגובות חיסוניות הומוראליות ותאיות על ידי הגברת נוגדנים בסרום ושגשוג לימפוציטים, הגברת הביטוי של ציטוקינים, ויסות עלייה של התבגרות DC וויסות מטה של ​​תדירות CD4+ CD{{5} } Foxp3+ תאי Treg.

DCs הם APCs מפתח עבור תחול תאי T נאיביים. ההפעלה של DCs חשובה עבור אדג'ובנטים. DCs, במיוחד DCs שמקורם במח עכברים, משמשים לעתים קרובות להערכת אדג'ובנטים וחיסונים. ציטומטריית זרימה יכולה להבחין בין התאים שהופעלו לאחר לכידת אנטיגן מהתאים הסובבים. בניתוח FCM, מידת הצבירה של מגורה

תאים הם אינדיקטור עקיף להערכת בטיחותם של אימונומודולטורים [3]. לפיכך, נתוני פעילות עזר של WPCD ב-DCs in vitro עשויים לספק מידע רב ערך עבור מודלים של בעלי חיים. בהתבסס על מודל BM-DC, רמות הביטוי של MHC-II, CD86, CD80 ו-CD40, ייצור ציטוקינים ושגשוג תאי T אלוגני זוהו בטווח הריכוז האופטימלי של WPCD. רמות הביטוי של MHC-II, CD86, CD80 ו-CD40 היו מווסתות למעלה ב-BM-DCs והתשואות של TNF-a ו-IL-12 עלו באופן תלוי מינון. נצפתה שגשוג תאי T אלוגני. המורפולוגיה של BM-DCs לא שונתה. על ידי השראת הפעלת BM-DCs והפרשת ציטוקינים דלקתיים במבחנה, תוסף WPCD עשוי להגדיל באופן משמעותי את כמות האנטיגן ומספר ה-APCs ולעורר תאי T להפריש IFN-, מה שתורם לשיפור הפעילות האימונומודולטורית.

שׁוֹנִיםפוליסכרידים עשבוניים סינייםמסוגלים להפעיל את מערכת החיסון ובעלי יכולות אדג'ובנטיות מצוינות באמצעות גירוי הבשלת DC על ידי מסלול TLR4 [33,28]. לפיכך, אנו מניחים ש-TLR4 משתתף במסלול האיתות של התבגרות DCs המושרה על ידי WPCD. כצפוי, טיפולים במעכבי TLR4 הביאו לירידה משמעותית ב-TNF-a ו-IL-12. יתר על כן, העיכוב של מסלול TLR4 גם הפריע לביטוי של CD40 ו-CD80 ב-DCs, מה שמצביע על כך שההבשלה של DCs הייתה תלויה ב-TLR4. לכן, ברור ש-TLR4 משתתף בהבשלת ה-DCs המושרה על ידי WPCD.

סיטנשה טבעית לשיפור חסינות PHGS75% ECH 30% ACT 12%

המינון האופטימלי של אדג'ובנטים וניסוח חיסון נקבע אמפירית בניסויים רבים. כדי לחקור את הקשר מינון-תגובה של אנטיגנים של WPCD ואנטיגנים OVA בעכברים, בחרנו מינונים שונים של WPCD על סמך נתונים שדווחו בעבר מ-BM-DCs במבחנה כדי לתת תת עורי עכברי ICR פעמיים. מצאנו ש-WPCD הגדיל באופן משמעותי את התשואה של נוגדנים ספציפיים ל-OVA וגרם לתגובה חיסונית מאוזנת Th1/Th2 עם שיפור של רמות IgG1 ו-IgG2a. במיוחד, רמת ה-IgG2a הייתה גבוהה מזו שטופלה עם אלום במינון האופטימלי. לכן, WPCD הביא לרמות גבוהות יותר של נוגדנים ספציפיים וליעילות גבוהה יותר עם ההזרקות הנמוכות יותר.

חיסונים חדשים דורשים אינדוקציה של תגובות תאי חזקות, הכוללות נוגדנים, תאי T עוזר (Th) ולימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL). חיסון טיפולי נועד לגרום לתגובות חזקות יותר של תאי T. התוסף האידיאלי משפר את עוצמת החיסון ומקדם חסינות מתווכת תאים מבלי לגרום להשפעות רעילות [34]. בין התצפיות במודלים של עכברים מחוסנים, WPCD הוביל לעלייה בשגשוג הספלנוציטים הספציפיים ל-OVA ולא ספציפיים בהשוואה לאלום. חלק מהתוספים מסדירים את הציטוקינים ואת מערכת החיסון. לדוגמה, ספונינים עשויים לעורר תגובות חיסוניות בתיווך תאים לאנטיגן שבדרך כלל גורם רק לנוגדנים. בחרנו ב-IL-4 וב-IFN- כאינדיקטורים להערכת עקיפה של רמות החסינות בעכברים. WPCD יכול לגרום ליותר הפרשות IL-4 ו-IFN- מאשר Alum. לפיכך, תגובות חזקות של תאי T עוזרים והפרשות ציטוקינים נצפו כתוצאה מחיסון WPCD, מה שמצביע על כך ש-WPCD יכול לעורר ביעילות רבה יותר לימפוציטים להפריש את הציטוקין מסוג Th1-וציטוקין מסוג Th2- מאשר אלום.

תוספים המשפיעים על הצגת אנטיגן יכולים להשפיע על תהליכים חיסוניים מורכבים. תאי Treg יכולים לווסת תגובות Th1 ו-Th2 [35]. מינון מתאים של WPCD עשוי לקדם את הבשלת DCs בעכברים על ידי הגדלת רמות הביטוי של CD80 ו-CD40 והגברת היכולת של הצגת אנטיגן OVA בתגובה החיסונית המוקדמת. תוצאות הניסוי של הפעלת DCs ותדירות Treg הוכיחו ש-WPCD גרמה להתבגרות של DCs והפחיתה את תדירות Treg בטחול בעכברים. תוצאות אלו הוכיחו ש-WPCD הגביר את היעילות של חיסוני OVA על ידי הגדלת המיקוד של תאים המציגים אנטיגן וקידום הפעלה ספציפית לתאי T.

בפיתוח אדג'ובנטים, קשה לעורר באופן סלקטיבי את התגובה החיסונית המתאימה כנגד הזיהום המקביל. תוסף מתאים צריך להיות בעל תופעות לוואי נמוכות ורעילות לבני אדם או לבעלי חיים. לפיכך, יש לשקול את בטיחות ה-WPCD, כולל תופעות לוואי מיידיות וארוכות טווח. במחקר זה, חקרנו את הרעילות החריפה של WPCD ואת ההשפעה השלילית של WPCD על ביצועי הצמיחה של עכברים במשך 110 ימים. התוצאות של רעילות חריפה של WPCD הראו שלמשקל הגוף, מדד התימוס או מדד הטחול לא היה הבדל משמעותי. ערך ה-LD50 של WPCD היה יותר מ-5000 מ"ג לק"ג משקל גוף. במהלך התצפית הניסיוני שלאחר מכן בעכברים, לא נמצאו תופעות לוואי או התנהגות חריגה בעכברים. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-WPCD בטוח.

לסיכום, במחקר זה, WPCD, פוליסכריד גולמי המופק מ-C. deserticola מ-Xinjiang, הציג כמה תכונות של אדג'ובנטים. לדוגמה, WPCD שיפר את תגובת Th1 וגם Th2 על ידי הפעלת DCs, הגדלת תגובות נוגדנים ושיפור ייצור ציטוקינים. יתר על כן, חקרנו את המנגנון של יעילות WPCD על ידי ניתוח התבגרות ותפקוד DCs דרך מסלול TLR4 במבחנה. בעכברים שטופלו רק ב-WPCD, לא נצפתה תופעת לוואי ברורה. לפיכך, ל-WPCD הייתה פעילות אימונוסטימולטורית גבוהה יותר בתגובות חיסוניות תאיות והומורליות. תוספים הם תערובת של מספר תרכובות. לתערובת של כמה תמציות גולמיות עשויות להיות השפעות מועילות יותר מתמצית צמח בודדת. יש צורך לחקור באופן שיטתי תמציות WPCD, לבדוק את יעילותן ובטיחותן ולהבהיר את מנגנוני ההשפעות שלהן.

סיטנשה טבעית לשיפור חסינות PHGS75% ECH 30% ACT 12%