הדמיית הכליה: מיקרוסקופיה מאור לסופר-רזולוציה

איש קשר: ali.ma@wecistanche.com

מריה לוסיה אנג'לוטי^1,2, ג'וליה אנטונלי^1,2 קרולינה קונטה^1,2ופאולה רומניאני^1,2

תַקצִיר

ההישגים החשובים בכִּליָהניתן לייחס בעיקר מנגנונים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים להתקדמות בטכנולוגיית המיקרוסקופיה. הרבה ממה שאנחנו יודעים על הארכיטקטורה שלכִּליָהמבוסס על תיאורים בסיסיים של מיקרוסקופים אנטומיים המשתמשים במיקרוסקופ אור ומאוחר יותר על ידי ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי שסופק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. שתי הטכניקות הללו שימשו עבור מערכות הסיווג הראשונות של מחלות כליות ולעדכונים מתמידים שלהן. לאחרונה, סדרה של טכניקות הדמיה חדשות הוסיפו את הניתוח בממדים נוספים של זמן ומרחב. מיקרוסקופיה קונפוקלית אפשרה לנו לדמיין ברצף קטעים אופטיים לאורך ציר ה-Z והזמינות של תוכנת ניתוח ספציפית סיפקה עיבוד תלת מימדי של דגימות רקמה עבות יותר. מיקרוסקופיה מולטיפוטונים אפשרה לנו לחקור בו זמניתכִּליָהתפקוד ומבנה בזמן אמת. מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנציה אפשרה לנו לחקור את ההתפלגות המרחבית של מטבוליטים. מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה הגבירה את הרגישות והרזולוציה עד לרמות ננו-סקאלה. בעזרת מיקרוסקופ קריו-אלקטרון, חוקרים יכלו לדמיין את הביו-מולקולות הבודדות ברמות אטומיות ישירות ברקמות ולהבין את האינטראקציה שלהן ברמות תת-תאיות. לבסוף, ספקטרומטריית מסה הדמיית לייזר בסיוע מטריצה ​​איפשרה מדידה של מאות מולקולות שונות בו-זמנית על קטעי רקמה ברזולוציה גבוהה. סקירה זו מספקת סקירה כללית של זמיניםכִּליָהאסטרטגיות הדמיה, תוך התמקדות בהשפעה האפשרית של השיפורים הטכנולוגיים האחרונים.

מילות מפתח:אימונוהיסטוכימיה,כִּליָהביופסיה, פודוציטים,מְקוֹרָבאַבּוּבִית, תאי גזע

Cistanche herba למחלת כליות, לחץ כאן לקבלת הדוגמא

מבוא

הכליותנדרשת מורכבות מבנית מרתקת למילוי תפקידיה הפיזיולוגיים המגוונים. בהתחלה, לימוד הכִּליָההיה מוגבל לתצפיות מקרוסקופיות ותרומתם לאבחון מחלות כליה הייתה מוגבלת ללא ספק. תוארו ביטויים קליניים אך המנגנונים הפתוגנטיים הבסיסיים לא היו ידועים. את ההישגים בהבנת הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הכליות ניתן לייחס במידה רבה להתקדמות מתמשכת בתחום המיקרוסקופיה. ניסיונות בכִּליָהההדמיה החלה לפני זמן רב [1]. בשנת 1666 בדק האנטומאי מלפיגיכִּליָהרקמה עם מיקרוסקופ אור שעוצמתו נאמדת ב-25-30 ותיארה לראשונה את הגלומרולוס כ'בלוטה שבה מופרד השתן מדם'[2]. תרומה זו זכתה להתעלמות עד 1842 כאשר מבני נפרון נפרמו עם מיקרוסקופ אור חזק פי 10 על ידי סר וויליאם באומן. באומן גילה את הקפסולה הפריגלומרולרית (לימים נקראה קפסולת באומן) כמחוברת אנטומית לחלק הראשון של הצינורית [3]. בשנת 1862, ג'ייקוב הנל תיאר את מקטע הצינורית דמוי הלולאה שקיבל את שמו, המחבר בין הצינורית הקורטיקלית לבין הפפילה הכלייתית.

הודות להכנסת מיקרוסקופיה אור, סיווג היסטמורפולוגי שלכִּליָהמחלותהפך לאפשרי [1]. הסיכוי לצפות במה שמתרחש בכליות חולות אפשר להבין ששינויים פתולוגיים משתנים במידה ניכרת בין מטופלים עם ביטויים קליניים דומים. עם זאת, המחקרים הראשונים על שינויים פתולוגיים ברקמת הכליה בוצעו על דגימות נתיחה, שהובילו בעיקר לתיאור מחלות כרוניות. חוסר המידע על התפתחות פתולוגיות הכליות והבעיה הטכנית של תופעות אוטוליטיות, בקורלציה לשימוש ברקמות שלאחר המוות, הגביל את הידע על מחלות אנושיות. בשנת 1951, הצגתכִּליָהביופסיה אפשרה צפייה ישירה ומחקר לא רק של מחלות כליה כרוניות אלא גם של מחלות כליה חריפות. בינתיים, המיקרוסקופיה השתכללה בהדרגה עם עלייה הדרגתית ברגישות וברזולוציה עד לרמות ננומטריות. בסקירה זו, נספק סקירה של תגליות כליות בסיסיות שהתאפשרו על ידי התקדמות בטכנולוגיית המיקרוסקופיה, תוך התמקדות באפשרויות המתפתחות מההתפתחויות הטכניות האחרונות.

ויזואליזציה של אימונופתולוגיה של הכליה

אימונו-תיוג ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

האפשרות להשיג שבר מייצג של רקמה חיה אפשרה יישום של טכניקות מתפתחות שדרשו שימור רקמות מקסימלי, כמו השיטות האימונוהיסטוכימיות (תחילה פלואורסצנטי, ואז אנזימטי). למעשה, בשנת 1950, Coons פיתחה את השיטה של ​​תיוג נוגדנים עם פלואורסציאין איזוציאנאט, כלומר אימונופלואורסצנטי, מבלי להרוס את היכולת להגיב ספציפית עם אנטיגנים של הרקמה שלהם. מאז שולבה אימונופלואורסצנטי בהליך האבחון להערכת דגימות ביופסיה כליות קפואות. לראשונה, טכניקות אלו אפשרו תצפית באימונוגלובולינים תוך-כליות (Igs) ובמשקעי משלים בחולים שנפגעו מגלומרולונפריטיס, תרמו להבחנה של פתופיזיולוגיות שונות העומדות בבסיס נגעים מסוימים של רקמה לא ספציפית, למשל, בגלומרולונפריטיס סהרונית [4]. בנוסף, האפשרות לצפות בתבנית צביעה אופיינית וצימוד של פלואורסצין לנוגדנים שאינם Immunoglobulin G (IgG) הובילה להכרה של משקעי אימונוגלובולין A (IgA) בנפרופתיה של IgA, כמו גם משקעים משלימים בגלומרולונפריטיס פוסט-זיהומי. וגלומרולונפריטיס ממברנופרוליפרטיבי [4].

מיקרוסקופיה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עברה שיפור טכני ניכר עם כניסתה של מיקרוסקופיה קונפוקלית בסוף שנות ה-80. אלמנטים מרכזיים במיקרוסקופיה קונפוקלית הם תאורה נקודתית ממוקדת וסרוקה על פני הדגימה וצמצם קונפוקאלי משתנה (חור חריר) בחזית הגלאי המאפשר איסוף אור מקטע דק בלבד מסביב למישור המוקד (הנקרא הקטע האופטי). מיקרוסקופיה קונפוקלית אפשרה את המחקרים הראשונים ב-vivo של הכליה במודלים ניסיוניים ותצפית על קליטה והובלה של מולקולות ניאון דרך צינוריות בשלמותןכליותלאחר מיקרופנצ'ר. זה אפשר מחקרים על תפקוד צינורי במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 ננומטר, עקב מגבלת הדיפרקציה של האור הנראה, הלבנת צילום ופוטוטוקסיות.

הבנת מחסום הסינון הגלומרולרי: מיקרוסקופיה אלקטרונית

הניסיון הראשון להתגבר על מגבלת הרזולוציה של מיקרוסקופים של אור ופלורסצנטי היה ב-1931 כאשר ארנסט רוסקה ומקס קנול המציאו את מיקרוסקופ האלקטרונים (EM), שמשתמש בקרן אלקטרונים מואצת, במקום אלומת אור, כמקור עירור, ובעל כושר רזולוציה גבוה יותר ממיקרוסקופי אור (עד 0.2 ננומטר). על חידוש זה, בשנת 1986 זכה ארנסט רוסקה בפרס נובל לפיזיקה. הודות לכוח הרזולוציה המוגבר, עד מהרה התברר שהגלומרולוס אינו רק מסנן מכני, אלא איבר מורכב ביותר המורכב משלוש שכבות: תאי אנדותל, קרום הבסיס הגלומרולרי (GBM) ופודוציטים [9]. העברה EM (TEM) אפשרה הדמיה של תאים גלומרולריים מבפנים [10] וחשפה כי לתאי האנדותל יש גופי תאים דקיקים עם גדר, בעוד לפודוציטים יש גופי תאים גדולים, והרחבת תהליכי 'רגל' ראשוניים ומשניים המעוגנים ל-GBM ומחוברים ביניהם באמצעות צמתים ליניאריים (הדיאפרגמה הקלה) (איור 1B). יתר על כן, סריקת EM (SEM), לכידת אלקטרונים מפוזרים לאחור, אפשרה הדמיה של תאים גלומרולריים מפני השטח החיצוניים שלהם [10] וחשפה כי תהליכי כף הרגל של פודוציטים שכנים התערבבו וכיסו את ה-GBM (איור 1C). EM נשאר מכשיר רב עוצמה לא רק להבנה של מבנה אולטרה גלומרולרי נורמלי אלא גם להבנהכִּליָהפיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה [11]. מחקרים רבים שבוצעו על דגימות אנושיות או במודלים ניסיוניים גילו כי תהליכי מחלה שונים קשורים למערכת של דפוסים ייחודיים של שינויים אולטרה-סטרוקטורליים, מה שמרמז על עדכונים נוספים על מערכת סיווג מתפתחת שלכִּליָהמחלות. היכולת הטכנית לדמיין מורכבות נוספת של מבנה האולטרה של הכליה אישרה את ההתמחות של "נפרו"פתולוגים.

טכניקת SEM עדכנית, המבוססת על גלאי רגיש במיוחד, אפשרה לחקור את החלק העמוק ביותר של דיאפרגמת החריץ וחשפה כי היא מאופיינת בנקבוביות בגדלים משתנים [12]. בחולדות, הופעת פרוטאינוריה הייתה קשורה לנקבוביות גדולות, מה שהעלה את האפשרות ששינויים אולטרה-סטרוקטורליים של סרעפת החריץ יכולים להיות סיבתיים לשינויים בסלקטיביות הגלומרולרית [12]. כהתקדמות טכנית נוספת, SEM עם פנים בלוק איפשר מעבר מתצוגה דו-ממדית לתלת-ממדית של מחסום הסינון הגלומרולרי עם רזולוציה מספיקה כדי לעקוב אחר הננו-מבנה של התהליכים התאיים הדקים ביותר בעכברים בריאים, עכברים חולים ובמהלךכִּליָהפיתוח [13, 14].

לבסוף, הצימוד של EM למערכת מיקרואנליזה של רנטגן (מיקרוסקופיה רנטגן) אפשר ניתוח יסודי של תאים או חלקי תאים ברמה אולטרה-סטרוקטורלית. מיקרוסקופיה בקרני רנטגן משתמשת ב-TEM סורק עם קרן אלקטרונים צרה כדי לעורר את המדגם. פגיעת האלקטרונים עתירי האנרגיה מהקרן עם האטומים בדגימות מייצרת אנרגיה בצורה של פוטוני רנטגן. אות רנטגן זה, שנאסף באמצעות גלאי מוליכים למחצה מפזר אנרגיה, משמש לזיהוי היסודות הקיימים בדגימה, ברזולוציה של, במקרה הטוב, 30 ננומטר. בתוך הכִּליָהבתחום, המיקרואנליזה של קרני רנטגן נוצלה בהצלחה על ידי בק ות'וראו כדי לחקור את הובלת יוני צינורית טרנספיתל [15] ואת ריכוז היסודות התוך תאי בתאים צינוריים [16].

ויזואליזציה של הפיזיולוגיה הכלייתית עם מיקרוסקופיה מולטי-פוטונים

מיקרוסקופיה מולטיפוטונים (MPM) סיפקה התקדמות נוספת בתחוםכִּליָהמחקר, כלומר, האפשרות לחקור בו-זמנית את תפקוד הכליות ואת קשרי המבנה בזמן אמת [17]. בשונה ממיקרוסקופי אור קונבנציונליים, עירור שני פוטון תלוי בקליטה בו זמנית של שני פוטונים עם אורך גל עירור כפול הדרוש כדי לעורר את הפלואורופור בעירור קלאסי של פוטון אחד (איור 1D). השימוש בלייזרי עירור עם אנרגיה נמוכה זמינים מסחרית אינפרא אדום, הגדיל את חדירת הרקמות העמוקה והקטין את הפוטוטוקסיות (איור 1D). זה אפשר לחוקרים לדמיין תהליכים תאיים דינמיים ישירות בבעלי חיים חיים, תכונה שלא הייתה מושגת קודם לכן בשום טכניקה אחרת. MPM מאפשר כימות של תפקודי כליות בסיסיים ושינויים פתולוגיים כגון חדירות גלומרולרית, זרימת דם וסקולרית, קצב סינון גלומרולרי יחיד-נפרון וזרימה צינורית [17] (איור 1E ו-F). בנוסף, MPM מאפשר חקר תהליכים תוך-תאיים בתגובה לפציעה, כולל מוות ונשירת תאים, גלגול לויקוציטים וגיוס והפרעות של GBM [17]. שיפורים טכניים נוספים אפשרו הדמיה תוך-חיונית ממושכת לאורך ימים עד שבועות [18] שבשילוב עם עכברים מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים, נעשה שימוש כדי לעקוב אחר גורלם של תאים בודדים ישירות in vivo בכליות הבריאות והפצועות [19] להבין טוב יותר את המנגנונים של תחלופה והתחדשות של תאי כליה.

טכניקות הדמיה ללא תווית היו אפשריות גם עם MPM, תוך ניצול האוטופלואורסצנטי הטבעי של nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NADH) כדי לחקור את מצב החיזור של תאים צינוריים לאחר פציעה [20]. בנוסף, נעשה שימוש בדור הרמוני שני מקולגן פיברילרי כדי לכמת שקיעת קולגן, סמן של פיברוזיס בכליות [21]. דור שני הרמוני הוא תהליך אופטי לא ליניארי שבו שני פוטוני עירור בעלי אותו אורך גל מתקשרים עם מבנים לא צנטרוסימטריים ברקמות ביולוגיות, כמו קולגן או מיקרוטובולים, ומייצרים פוטון חדש עם מחצית מאורך הגל.

חידוש אחרון של מיקרוסקופיה תוך-חיונית היה הצגת אנדוסקופ מולטיפוטונים ממוזער המשמש בהצלחה לצילום כליות בעכברים חיים מורדמים [22]. MPM זעיר פולשני זה עשוי לסלול את הדרך לאבחון בזמן אמת in vivo, ללא הסרת רקמות, ובזמן קצר מאוד.

הכליה בתלת מימד: טכניקות לניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של הרחבה

למרות השיפורים הטכנולוגיים, אחד הגבולות העיקריים להדמיה נפחית עמוקה יותר הוא אטימות רקמת הכליה, מה שהופך אתכִּליָהאחד האיברים המאתגרים ביותר מבחינה אופטית. זו הסיבה שטכניקות ניקוי רקמות עוררו עניין רב [23]. מטרת הגישות הללו היא להפוך רקמה אטומה לרקמה שקופה, לשמר חלבונים ובסופו של דבר סמנים פלואורסצנטיים, לדמות פרוסות רקמה עבות. השילוב של ניקוי אופטי עם מיקרוסקופיה מתקדמת מספקת אפשרות לניתוח מורפומטרי, כגון כימות נפח ומספר גלומרולרי, ברקמות עבות או אפילו בכליה שלמה [24]. יישומים אחרים כוללים ניתוח של מקטעי צינוריות ברורים [25], תפקידיהם [26], וכימות אובדן פודוציטים [27].

כדי לצלם כמויות גדולות של רקמות ובמקביל, לפתור פרטים מבניים עדינים, הוצגה לאחרונה גישה טכנית חדשה, כלומר, מיקרוסקופ הרחבה (ExM). הרעיון הוא להרחיב פיזית איבר שלם 4- ל5-קיפול תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת ותוכן הפרוטאום התלת-ממדי. באמצעות פולימר מתרחב, המסונתז ישירות בתוך הדגימה, מולקולות קרובות יותר מגבול העקיפה של האור מופרדות איזוטרופית בחלל למרחקים גדולים יותר ולכן ניתן לפתור אותן אופטית אפילו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל. בנוסף, ה-ExM מספק שקיפות אופטית גדולה יותר ומפחית את פיזור האור, מה שמאפשר לדמיין נפח גדול יותר של רקמה. באמצעות גישה זו, ניתן לנתח את הלוקליזציה של חלבונים מרובים בסרעפת החריץ וב-GBM אפילו עם מיקרוסקופ קונפוקאלי רגיל [28]. לדוגמה, זה יכול לחשוף את מחיקת תהליך כף הרגל בעכברים פרוטאינוריים, הן בדו-ממד וגם בתלת-ממד, ברזולוציה ננומטרית שלא הושגה מעולם [29]. לאחרונה נעשה שימוש ב-ExM להערכת לוגיקה היסטופטו קלינית של דגימות מוטבעות בפרפין שכבר נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין [30]. טכניקה זו יכולה לממש את מחיקת תהליך כף הרגל ברמה ננומטרית שהייתה אפשרית בעבר רק עם EM. ההתקדמות בהדמיה נפחית מאפשרת ניתוח תלת מימד ברזולוציה גבוהה של האיבר כולו, באופן שהמגבלה העיקרית להדמיה עמוקה מיוצגת כעת ביכולת של נוגדנים לחדור לרקמה.

לימוד הפרופיל המטבולי: מיקרוסקופיה של תדירות-תחום פלואורסצנציה-לאורך חיים

הכִּליָההוא איבר מטבולי עם תכולה גבוהה של מיטוכונדריה. הצורה המופחתת של NADH ומטבוליטים אחרים הם פלואורסצנטי באופן טבעי וניתן להשתמש ב-autofluorescence זה כאינדקס של מצב החיזור [20]. עם זאת, ספקטרום הפליטה של ​​הפלואורופורים האנדוגניים הללו חופפים, וזיהוים בנפרד היה בלתי אפשרי. אבל משך החיים של הקרינה (כלומר דעיכת הזמן של הקרינה) נמצאו שונים באופן משמעותי. מכאן שמיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנציה (FLIM) מאפשרת חקר פרופילים מטבוליים [31]. לאחרונה, באמצעות שילוב של MPM ו-FLIM, ניתן היה לאפיין חתימות מטבוליות ספציפיות לתא ולנטר שינויים מטבוליים in vivo במהלךכִּליָהמחלה [32]. FLIM צפויה לספק תובנות נוספות לגביכִּליָהחילוף חומרים in vivo בבריאות ובמחלות.

דחיפת רזולוציה מעבר לגבולות: הדמיה ברזולוציה סופר של הכליה

מיקרוסקופ אור סטנדרטי עומדת בפני מגבלה של הרזולוציה האופטית מעבר ל-200 ננומטר. טכנולוגיות חדשות, המכונה הדמיה ברזולוציית סופר, מאפשרות כעת למיקרוסקופ פלואורסצנטי לצלם מעבר לגבול העקיפה שלה כנקודת התחלה של עידן הננוסקופיה [33]. גישות אלה משלבות רזולוציה ננוסקופית עם היתרונות של תיוג פלואורסצנטי רב-צבעוני. מתוך הכרה בהשפעה הפוטנציאלית של חידושים אלה, הוענק פרס נובל לכימיה לשנת 2014 לאריק בציג, סטפן הל, וויליאם מורנר על פיתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סופר-פתורה. ניתן ליישם אסטרטגיות שונות של הדמיה ברזולוציית על כדי לטפל בשאלות ביולוגיות שונות. ניתן לקבץ גישות אלו לשתי קטגוריות עיקריות, תלוי אם רזולוציית העל מנוצלת ברמת מולקולות בודדות או בהרכבים [33].

טכניקות מבוססות אנסמבל

טכניקות מבוססות אנסמבל שוברות את גבול הדיפרקציה על ידי אפנון זמני ומרחבי של קרן האור המעורר. ביניהם, הדמיית דלדול פליטה מגורה ברזולוציה על (STED) משתמשת בשני לייזרים, לייזר עירור ולייזר דלדול (STED לייזר) מרוכז, בעל צורת סופגנייה, כדי לדכא את פליטת הקרינה מהפלואורופורים הממוקמים מחוץ. מרכז ההתרגשות. דיכוי זה מושג באמצעות פליטה מגורה ומאפשר איסוף רק את האות שמקורו בנקודה מוקדית עם מימד מתחת לגבול העקיפה (איור 2A). הדמיית STED שימשה לצילום דיאפרגמת החריץ בניקיון אופטיכִּליָהרקמות (איור 2B-c') ואיפשר לוקליזציה של ההפצה המרחבית של פודוקין ונפרין בקנה מידה ננומטרי עד לפחות 30 lm של עומק [34]. בנוסף, האפשרות לצפות ולכמת את מחיקת תהליך כף הרגל במודל ניסיוני יכולה להפוך את הדמיית STED לשימושית עבור מחקרים של מחסום הסינון הגלומרולרי [34].

מיקרוסקופיה STED דורשת פרוטוקולים ספציפיים להכנת דגימה, פלואורפורים מיוחדים והדרכה טכנית. מסיבה זו, במהלך השנים האחרונות ניתנה יותר תשומת לב לטכניקת רזולוציית-על נוספת, מיקרוסקופיה מובנית תאורה (SIM), אשר יכולה להרחיב את גבול העקיפה בפקטור של שניים הן לרוחב והן בציר. SIM משתמש במערך מיקרוסקופ רחב שדה עם דפוס תאורה עם פסים עדינים, המאפשר לכידת מידע בתדר גבוה (המקביל לפרטים עדינים במדגם) בתדרים מרחביים נמוכים יותר. על ידי רכישת תמונות מרובות עם דפוסי תאורה של שלבים וכיוונים שונים, ניתן לשחזר תמונה ברזולוציה גבוהה (איור 3A). ה-SIM תואם לפלוורופורים סטנדרטיים, אינו דורש הכנת דגימה ספציפית, ומאפשר הדמיה תלת מימדית. בהתחשב בכל היתרונות הללו, בוצעו מחקרים שונים כדי להעריך את האפשרות להשתמש ב-SIM ככלי אבחון מהיר [35], למשל, עם זמן אספקה ​​קצר יותר מאשר EM. לאחרונה נעשה שימוש ב-SIM תלת מימדי ועיבוד תמונה אוטומטי ככלי אבחון מהיר של מחיקת תהליך כף הרגל באמצעות קטעי פרפין שגרתיים מביופסיות של חולים עם מחלת שינוי מינימלי [36] (איור 3B ו-C). היכולת הזו לזהות בהצלחה שינויים במחלות הידועות כמציגות פתולוגיה ננומטרית אישרה את ה-SIM ככלי מבטיח לאבחון שגרתי.

שיטות הדמיה מבוססות לוקליזציה של מולקולה אחת

טכניקות אלו מסתמכות על האפשרות להפעיל ולכבות באופן מחזורי מולקולות פלואורסצנטיות בודדות הקרובות מכדי להיפתר. בגישות אלה, ניתן להפעיל מולקולות בתוך אזור מוגבל עקיפה בנקודות זמן שונות, כך שניתן יהיה לצלם אותן בנפרד ולאחר מכן למקם אותן בדיוק ננומטרי על ידי מציאת מרכזים חישוביים (איור 3D). בין הגישות הללו, הוצגה לראשונה מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM).כִּליָהמחקר בשנת 2013, עם מחקר שחשף את הארגון המולקולרי המורכב של GBM בדיוק ננומטרי, כולל הכיוון של מולקולות בתוך [37]. במודל עכבר של תסמונת נפרוטית מולדת נדירה, STORM חשף את האינטגרציה וההתמצאות הנכונה של laminin 521 בתוך GBM לאחר הזרקה תוך ורידית, ופתחה את הדרך לאפשרויות טיפוליות מתקדמות עבור חולים [38]. מחקר אחר תיאר את הארגון של ציטושלד האקטין בפודוציטים ברזולוציה בקנה מידה מולקולרי [39] (איור 3E-I). כממצא חדש, פודוציטים מכילים צרורות אקטין מתכווצים הקשורים לצרורות אקטין לא מתכווצות בתהליכי כף הרגל. במודלים של פגיעות פודוציטים, מבנה האקטין בכף הרגל התפרק, מה שהוביל לקריסת המבנה המתכווץ בגוף הראשי [39].

הצגת מבנים תלת מימדיים של ביומולקולות בסיסיות ברמה האטומית: מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון

עד לאחרונה, האפשרות לחקור את המבנה של ביומולקולות בסיסיות הוגבלה למיקרוסקופ אלקטרוני, ברזולוציה של ננומטרים בודדים. מכשולים טכניים, כגון נזק לדגימה על ידי אלומת אלקטרונים אינטנסיבית, ניגודיות תמונה נמוכה ותנועות מולקולות לאחר אינטראקציה עם אלקטרונים או קשיים לשמר מים בדגימות ביולוגיות בוואקום המופעל בתוך תא ה-EM, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לפתור מולקולות מתחת לגודל זה . קירור הדגימה יכול להפחית את אידוי המים ואת הנזק הנגרם באמצעות אלקטרונים [40]. מתוך רעיון זה, הוצג cryo-EM בשנות החמישים. לפני מספר שנים, הצגתו של גלאי חדש לספירת אלקטרונים בודד דחפה סוף סוף את הרזולוציה מעבר לגבולות הקודמים. בשנת 2017, פרס נובל בכימיה הוענק לז'אק דובושט, יואכים פרנק וריצ'רד הנדרסון על "פיתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של ביומולקולות בתמיסה". התקדמות אלו מאפשרות כעת קביעה מבנית של ביומולקולות בתמיסה [41].

בכִּליָהבמחקר, המבנים של חלבונים בסיסיים נקבעו ברמה האטומית [42, 43]. ביניהם, מבנה הפוליציסטין האנושי-2, שהמוטציות שלו אחראיות לפוליציסטיות אוטוזומליות דומיננטיותכִּליָהמחלה [44], והמבנה של 6 תעלות יונים קנוניות בפוטנציאל הקולטן החולף, שהמוטציות שלהן גורמות ל-FSGS בבני אדם [43], נקבעו ברזולוציה של כמה אנגסטרמים [44].

הבנת הבסיס המולקולרי של מחלות כליה: מיקרוסקופיה אינטגרטיבית של כליות

בשנים האחרונות נרשמה התעניינות מוגברת בגישות ללא תוויות המסוגלות למפות באופן ספציפי ובו-זמנית את הספקטרום הכולל של מולקולות ברקמות [45]. ביניהם, ספקטרומטריית מסה הדמיית לייזר (MALDI-IMS) בפיזור/יינון באמצעות לייזר מאפשרת מדידה של מאות מולקולות שונות בו-זמנית ישירות על קטעי רקמה ברזולוציה גבוהה. בניסוי MALDI-IMS, חתך רקמה דק, קפוא או מוטבע בפרפין, מצופה במטריקס הסופג את אנרגיית הלייזר ומקדם יינון של אנליטים של רקמות. הניתוח בספקטרומטר המסה מייצר ספקטרום לכל קואורדינטת x/y. לאחר מדידת MALDI, ניתן לצבוע את אותו קטע רקמה בהליכים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים מסורתיים כדי לשלב את הדפוס המולקולרי עם פרטים היסטולוגיים. בחקר הכליות, MALDI-IMS משמש לחקר תרופות, מטבוליטים, שומנים, פפטידים וחלבונים ברקמות תקינות וחולות [45].

אחד היישומים השכיחים ביותר של MALDI-IMS הוא זיהוי של סמנים מולקולריים לסיווג קרצינומה של תאי כליה [46] ולביסוס השוליים האמיתיים בין רקמה סרטנית ונורמלית ברמה המולקולרית כמו גם ברמה ההיסטולוגית [47]. MALDI-IMS שימש בהצלחה גם לחקר רעילות של תרופות כלייתיות כדי לספק זיהוי מוקדם של רעיליםכִּליָהמנגנוני נזק בתיווך מועמדים לתרופות [48]. יתרה מכך, MALDI-IMS משמש לחקר שומנים ותפקידם בפתולוגיות כליות, כגון נפרופתיה סוכרתית [49], פגיעה בכליות חריפה [50] ופוליציסטיות.כִּליָהמחלה [51], וגם לחשוף פרופילים מטבוליים אנדוגניים להבנה מעמיקה יותר של מנגנונים הקשורים למחלה [52]. זיהוי הפרופילים המולקולריים הושלם גם עבור סמנים ביולוגיים אפשריים שיכולים להיות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ופרוגנוסטיים חדשים [53, 54].

מסקנות ונקודות מבט לעתיד

שיפורים מתמידים בטכניקות הדמיה פתרו בהדרגה מחסומים טכניים קריטיים רביםכִּליָהמחקר ואפשרו תיאור דינמי של המבנה והתפקוד בכליות תקינות וחולות. ואכן, הופעתן של טכנולוגיות מיקרוסקופיה חדשות אפשרה תגליות מדעיות בסיסיות ובעקבות כך שינתה את השקפתנו על פיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של הכליות, שניתן להמחיש כעת בתלת מימד ואף לצלם בסרטונים, כאשר הזמן מייצג את המימד הרביעי. עם החידוש הטכנולוגי האחרון של מיקרוסקופיה ברזולוציית סופר והתקדמות טכניקות הדמיה מולקולרית, חוקרים יכולים כעת לדמיין ביו-מולקולות בודדות ישירות ברקמות ולקבוע כיצד הן מקיימות אינטראקציה ברמה התאית והתת-תאית.

האפשרות ליישם כלים אלה על פתולוגיכִּליָהדגימות, המתמקדות בפרטים המולקולריים והתת-תאיים בביופסיות קליניות, אמורות לסייע בסיווג מחדש של המחלה. אם ומתי זה ייצור השפעה על האבחנה של מחלת כליות או אפילו על ניהול החולה, כרגע לא ברור.

מימון

המימון ניתן על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק 648274).

הפניות

1. Weening JJ, Jennette JC. אבני דרך היסטוריות בפתולוגיה של הכליות. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. בולוניה 1666

3. Bowman W. על המבנה והשימוש בגופים המלפיגיים של הכִּליָה, עם תצפיות על מחזור הדם דרך אותה בלוטה. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. עליית הפתולוגיה הכלייתית בנפרולוגיה: מבנה מאיר את התפקוד. אני ג'ייכִּליָהDis 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקאלית ומיקרו-פנצ'ר בחולדות שלמות. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. חסימת Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 מחדשת באופן מועדף פודוציטים שאבדו בנפרונים בקליפת המוח על ידי מיקוד למנגנון משוב פנימי של פודוציטים-אבות.כִּליָהאינט 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. היפרטרופיה של תאים צינוריים הקשורים לאנדומחזור וריבוי אבות משחזרים את תפקוד הכליות לאחר אקוטיכִּליָהפציעה. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. תובנות חדשות לגבי דפוסים מבניים שנתגלו בגלומרולוסקלרוזיס. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. טישר CC. אנטומיה פונקציונלית שלכִּליָה. הוספ פראקט 1978; 13

10. Liapis H. Electron microscopy inכִּליָהמחקר: לראות זה להאמין. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Strong ML, Evers P. הממד השלישי באבחון כליות. מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת של הכליות התקינות והלא תקינות. S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. הדמיה של מבנה האולטרה הנקבובי של חריץ הסינון האפיתל הגלומרולרי. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. וינקולין נדרש כדי לשמור על שלמות המחסום הגלומרולרי.כִּליָהאינט 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. תהליך מורפולוגי של התפתחות פודוציטים נחשף במיקרוסקופ אלקטרוני סריקת פנים בלוק. J Cell Sci 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. מיקרואנליזה של קרני רנטגן באמצעות אלקטרונים של הובלת יונים טרנספיתל. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. ריכוזי יסודות תוך תאיים בתאי צינורי כליה. ניתוח מיקרו פרוב אלקטרוני. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. טכניקות רומן in vivo להמחשהכִּליָהאנטומיה ותפקוד. כליות אינט 2015; 88: 44–51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. עירור מולטיפוטונים באורך גל ארוך הוא יתרון עבור intravitalכִּליָההַדמָיָה.כִּליָהInt 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. מעקב אחר גורלם של תאי אפיתל גלומרולריים in vivo באמצעות הדמיה מולטיפוטונים סדרתית בדגמי עכברים חדשים עם תגי שושלת פלורסנטיים. נת מד 2013; 19: 1661–1666

20. הול AM, Unwin RJ, Parker N, et al. הדמיה מולטיפוטונים חושפת הבדלים בתפקוד המיטוכונדריאלי בין מקטעי נפרון. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302