זיהוי של ESTים מגיבים למי חמצן המעורבים בביוסינתזה של פנילתנואיד גליקוזיד בתרבות תאי סיסטאנצ'ה סלסה

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

J. CHEN וחב'

תַקצִיר
מי חמצן הוא גורם אביוטי יעיל שיכול לגרום לביו-סינתזה של מטבוליטים משני בצמחים. אנו מראים כי בתרבית תרחיף תאים של צמח מרפא סובלני למלחCistancheסלסה, ייצור של רכיבים ביו-אקטיבייםפנילתנואידגליקוזידים(PeGs) גדל לאחר טיפול H2O2. לזהות גנים הקשורים ל-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה מושפעת מ-H2O2, בנינו ספריית הכלאה חיסורית של דיכוי של גנים מגיבים ל-H2O2 באמצעותCistancheסלסהשורת תאים וזיהתה 105 תגי רצף מבוטאים (EST) ו-85 גנים. ביאור פונקציונלי של ספריית EST וניתוח אונטולוגיה של גנים הראו גנים הקשורים לתגובות סטרס שונות, ביוסינתזה של מטבוליטים משניים וויסות שעתוק. ביניהם, זיהינו שני גנים הקשורים ל-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)מסלול ביוסינתזה (4-קו-אנזים A ligase coumarate ו-cinnamate 4-hydroxylase), ושני גורמי שעתוק מסוג WRKY. הביטויים של גנים נבחרים לאחר הטיפול ב-H2O2 נותחו על ידי RT-qPCR. שעתוק מוגבר מוקדם של PeG(פנילתנואידגליקוזידים)גנים של מסלול ביוסינתזה לאחר הטיפול חשפו ש-H2O2 גרם ל-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה באמצעות ויסות מעלה של הגנים המרכזיים שלה.
מילות מפתח נוספות: cinnamate-4-hydroxylase, 4-coumarate coenzyme A ligase, דיכוי הכלאה חיסור.Cistancheסלסה. פנילתנואידגליקוזידים.

מבוא

Cistancheסלסההוא טפיל צמחי רב שנתי על השורש של Haloxylos ammodendrun, והוא גדל באזור המדברי של מערב סין. במשך מאות שנים,Cistancheמינים שימשו כרפואת צמחים מסורתית (Wang et al. 2012). רכיבים ביו-אקטיביים הםפנילתנואידגליקוזידים(PeGs) שיש להם השפעה יוצאת דופן על פינוי מיני חמצן תגובתיים (ROS), הגנה מקרינה, שיפור חסינות ואנטי אייג'ינג (Nan et al. 2013). PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה בCistancheמופעל מפנילאלנין (איור 1 משלים) וחומצה קפאית מסונתזת עוברת גליקוזילציה נוספת ליצירת PeGs שונים(פנילתנואידגליקוזידים)(Wang et al. 2012). שלושה PeGs עיקריים(פנילתנואידגליקוזידים), echinacoside, acteoside ו-2'-acetylacteoside, נחשבים לרכיבים הפעילים ביותר בCistanche(Kobayashi et al. 1984). על מנת לשפר את התוכן שלהם בCistancheתרבית תאים, גורמים מעוררים שונים נבדקו כולל chitosan, putrescine, Ag plus ולחץ אוסמוטי (Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu and Cheng 2008). עם זאת, גנים המעורבים ב-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה בCistanche, בעיקר גנים של מסלולי חילוף החומרים של פנילאלנין, זוהו רק לעתים רחוקות. רק גן המקודד ל-phenylalanine ammonia-lyase (PAL) זוהה לאחרונה ב-Cistanche deserticola (Hu et al. 2011). גנים אחרים המקודדים, למשל, cinnamate-4-hydroxylase (C4H), שיכול לזרז את ההמרה של cinnamate לחומצה קומרית, ו-4-coumarate coenzyme A ligase (4CL), גן חיוני לליגנין ולפלבנואידים ביוסינתזות, לא נמצאו בCistanche.
השתמשנו בתרבית התא שלCistancheסלסהללמוד PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה וביטוי גנים קשורים. חקרנו גם את ההשפעה של מעורר יעיל H2O2 על PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה. יתר על כן, למצוא גנים מגיבים מוקדם המעורבים ב-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה, ביצענו הכלאה חיסורית של דיכוי (SSH) כדי לבנות ספריית cDNA של גנים מגיבים ל-H2O2-.

איור 1. ביטוי גנים יחסי שנקבע על ידי RT-qPCR לאחר טיפול H2O2. CsWRKY1 - גורם שעתוק WRKY (Contig07), CsC4H1 - cinnamate 4-hydroxylase (Contig09), Cs4CL1 - 4-coumarate: ligase (Contig03), CsHSP1 - הלם חום חלבון 70 kDa (Contig 01), ו-CsSOD1 - סופראוקסיד דיסמוטאז (Contig16). תאים טופלו ב-80 ug dm-3 H2O2 במדיום נוזלי במשך 2 שעות והביטויים הושוו עם ביקורת שטופלה במים. אמצעי פלוס - SD של שלוש חזרות ביולוגיות; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

חומרים ושיטות

קו התאים CS2001 הוקם מעלי כותרת שלCistancheסלסה(CA Mey.) בק אסף במחוז ניימנגו וצמח בתת-תרבות. שיטת התרבות הייתה דומה לפרוטוקול שפורסם בעבר (Liu et al. 2007). בדרך כלל, מדיום מוצק Murashige and Skoog (1962; MS) שימש עבור תת-תרבות ובמדיום נוזלי עבור PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה (זה היה המדיום המותאם של MS בתוספת של 30 גרם dm-3 גלוקוז ו-2.0 mg dm-3 אינדול-3-חומצה אצטית). לטיפול ב-H2O2, 5.0 ± 0.2 גרם של תאים בתקופת צמיחה מהירה, בדרך כלל 20 עד 30 ימים לאחר תרבותם המשנה במדיום המוצק, חוסן לתווך נוזלי בגודל 50 ס"מ"ב בבקבוק של 250 ס"מ של ארלנמייר ומתורבת בחושך עם או בלי ריכוזי H2O2 שונים. ה-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)תוכן לאחר אינדוקציה של 10 ד' על ידי H2O2 נותח על פי שיטה שפורסמה בעבר (Liu et al. 2007) המבוססת על כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה עם פליטת שיפוע מתנול.

התאים 2 שעות לאחר הטיפול ב-H2O2 נאספו מהמדיום על ידי נייר סינון באמצעות משפך של Büchner, ולאחר מכן הם הוקפאו בחנקן נוזלי ונטחנו לאבקה. כל 2 גרם אבקת תאים עברו ליטוש באמצעות תערובת של 1 cm3 של 2-מרקפטואתנול, 1 cm3 מתוך 200 גרם dm{{10}} sarcosyl, ו-8 סמ"ק של חיץ GTC (5 M guanidinium isothiocyanate, 62.5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6.25 mM EDTA, pH 8.0, 5 mM thiourea ו-10 mM dithiothreitol). לאחר מכן התאים הודגרו על קרח למשך 15 דקות, לאחר מכן הוסיפו 1/3 נפח של 8.5 M CH3COOK, pH 6.0, והתאים הודגרו על קרח למשך 15 דקות ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-15 000 g למשך 15 דקות . הסופרנטנט הוסף לנפח שווה של איזופרפנול כדי לזרז את ה-RNA הכולל. ה-RNA הכולל טוהר עוד יותר על ידי ערכת מיני RNeasy (Qiagen, Hilden, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. RNA Messenger בודד מ-RNA הכולל באמצעות ערכת midi של Oligotex mRNA (Qiagen).

פנילתנואידגליקוזידיםבCistancheסלסה

ספריית SSH נוצרה מבקרה ו-30% H2O2-הוציאו דגימות תאים 2 שעות לאחר ההפקה באמצעות ערכת חיסור cDNA בחר PCR (Clontech, Mountain View, ארה"ב). לבניית ספרייה, המוצרים טוהרו בנפרד באמצעות ערכת טיהור ג'ל (Qiagen) ושובטו לווקטור pGEM באמצעות ערכת שיבוט TA (Tiangen, בייג'ינג, סין). פלסמידים משיבוטים עצמאיים בודדו ורצפו באמצעות פריימר T7. כל רצפי תגית הרצף המפורשים (EST) מהספרייה (עם רצפי הווקטור הוסרו) שימשו להרכבה קונtig עם CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3). ה- ESTs קובצו ל-contigs ו- singletons; הם שימשו לחיפוש הומולוגיה באמצעות תוכנית BLASTx ב-NCBI (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). לאחר מכן נוספו רצפים, נותחו וסווגו לפי מונחי אונטולוגיה של גנים (GO) באמצעות Blast2GO (http://www. blast2go.com).
תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR) בוצעה על פי Bustin et al. (2009). דגימות cDNA סונתזו באמצעות ערכת ריאגנטים PrimeScript RT (Takara, Dalian, סין) מ-0.5 ug של RNA כולל. RT-qPCR בוצע באמצעות ערכות SYBR Premix Ex Taq II ו-ROX plus (Takara) על מערכת ABI 7300 בזמן אמת PCR (Applied Biosystems, Foster City, ארה"ב) עם שלושה שכפולים טכניים. פריימרים תוכננו באמצעות תוכנת Primer3 המקוונת לפי ההוראה שסופקה על ידי Takara; primers המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 1 Suppl. ביטויי הגנים נורמלו ל-18S RNA, שהביטוי שלו היה יציב בכל הדגימות.

התוצאות נותחו באמצעות R גרסה 3.1.1, מובהקות ההבדלים אומתה על ידי מבחן t של הסטודנט.

תוצאות

מי חמצן גרם לביו-סינתזה של כל שלושת ה-PEG העיקריים(פנילתנואידגליקוזידים)בCistancheסלסהתאי השעיה (טבלה 1) אך ללא השפעה ברורה על צמיחת התאים (איור S2). התוכן של echinacoside עלה כבר לאחר הטיפול של 10 ug dm-3 H2O2 (P < 0.05),="" עלייה="" גבוהה="" יותר="" נרשמה="" לאחר="" 20="" ug="" dm="" -3="" טיפול="" ב-h2o2="" (p=""><0.01), והעלייה="" הגבוהה="" ביותר="" הייתה="" לאחר="" הטיפולים="" של="" 40,="" 80="" ו-160="" ug="" dm-3="" h2o2.="" תוצאות="" דומות="" מוצגות="" עבור="" acteoside,="" אך="" התוכן="" שלו="" הגיע="" לשיא="" לאחר="" הטיפול="" ב-80="" ug="" dm-3="" h2o2.="" הביוסינתזה="" של="" 2'-אצטילקטאוזיד="" הייתה="" פחות="" רגישה="" לטיפול="" ב-h2o2;="" עלייה="" משמעותית="" בתכולתו="" (p="">< 0.05)="" הייתה="" בריכוזי="" h2o2="" מעל="" 40="" ug="" dm-3.="" לאחר="" הטיפול="" ב-80="" ug="" dm-3="" h2o2,="" הכמות="" של="" כל="" שלושת="" ה-peg="">(פנילתנואידגליקוזידים)גדל באופן משמעותי (P < 0.01)="" לעומת="" השליטה.="" לכן,="" ריכוז="" זה="" שימש="" בניסויים="">
כדי ליצור ספרייה מועשרת עבור גנים מגיבים מוקדמים המווסתים על ידי H2O2, השתמשנו ב-cDNA מCistancheסלסהתאי השעיה שטופלו ב-80 ug dm-3 H2O2 למשך 2 שעות. ריצוף יחיד של 129 שיבוטים רקומביננטיים בספריית SSH הניב 105 ESTים נקיים לאחר אי הכללת רצף וקטור. ESTים ברורים אלה שימשו להרכבה על ידי CAP3, ונוצרו 18 קונטיגים ו-67 יחידות (טבלה 2). לפיכך, 85 גנים בודדו בספרייה זו. האורך הממוצע של 105 ESTים נקיים היה 527 bp, וזה הולם לסיווג פונקציונלי מבוסס דמיון ברצף.

פנילתנואידגליקוזידיםבCistancheסלסה

כל 85 הגנים שהושגו בספרייה אוחזרו על ידי BLASTx כנגד מסד הנתונים של חלבונים לא מיותר GenBank לצורך דמיון רצף (E-value Less of שווה ל-0.001). עשרים ואחד גנים לא הראו התאמות במסד הנתונים, הם עשויים להיות ספציפייםCistancheסלסה. התוצאות עם BLASThits יובאו לתוכנת Blast2GO לניתוחי העשרת מסלולי GO ו-KEGG נוספים. מתוך 64 הגנים עם פגיעות BLAST, 50 סומנו על פי התיאור של גנים הומולוגיים ממינים אחרים. הגנים המוערים קיבלו את שמותיהם על פי התיאור של פגעי BLAST. ניתוח GO (איור 3 משלים) מראה שבין 50 הגנים הללו, היו 14 גנים המעורבים בתגובות לגירויים, ויותר מ-30 גנים הקשורים לתהליכים מטבוליים (טבלאות 1 ו-2). בין הגנים הללו, שני הומולוגים גנים של מסלול ביוסינתזה של PeG בודדו כצפוי: 4-קו-אנזים A ligase coumarate (ששמו Cs4CL1: Contig03) ו-cinnamate 4- הידרוקסילאז (ששמו CsC4H1: Contig14). בנוסף, RT-qPCR בוצע כדי לאשר ביטויים המושרים של גנים מהספרייה לאחר הטיפול ב-H2O2.

כדי לאשר שגנים חיוניים שזוהו מספריית SSH הגיבו לטיפול H2O2, הביטויים של שני PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)גנים הקשורים למסלול ביוסינתזה (Cs4CL1, CsC4H1), שני גנים המושרים על ידי ROS (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099), וגן אחד דמוי פקטור שעתוק של משפחת WRKY (CsWRKY1: Contig 07) נמדדו לאחר הטיפול ב-RT-qPCR עם H2O2 (איור 1). ביטויי CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 ו-CsWRKY1 היו מווסתים למעלה מפיפול 15-, קיפול 3-, קיפול 45- ו-4- קיפול, בהתאמה 2 שעות לאחר ה-H2O2 יַחַס. הביטוי של CsHSP1 השתנה רק פי 1.8 לאחר הטיפול ב-H2O2.
מהלך הזמן של הביטויים של CsWRKY1, CsC4H1 ו-Cs4CL1 לאחר הטיפול ב-H2O2 נותח עוד יותר על ידי RT-qPCR (איור 2). הביטויים CsC4H1 ו-Cs4CL1 גדלו מאוד (יותר מפי 80- ו-50- פי שניים, בהתאמה) לאחר הטיפול ב-16- שעות ולאחר מכן הווסטו למטה לאחר 32 שעות. הביטוי של CsWRKY1 היה מווסת למעלה מ-20-פיפול לאחר 4 שעות ולאחר מכן ירד מ-8 שעות לאחר מכן (איור 2).

איור 2. הביטוי היחסי של CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) ו-Cs4CL1 (C) בזמנים שונים לאחר טיפול ב-80 ug dm-3 H2O2. הביטויים נורמלו לפקד; (מטופל במים). אמצעי פלוס - SD של שלוש חזרות ביולוגיות; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

דִיוּן

מי חמצן הוא מעורר צמחים ידוע המראה השפעות שונות על צמחים. בדומה ל-ROS, הוא יכול לגרום למערכת ניקוי ה-ROS המורכבת מסופראוקסיד דיסמוטאז, קטלאז, פרוקסידאזות וכו', והיא משמשת כאות במורד הזרם של מלח, אוסמוטי והתייבשות.

מדגיש (Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). הוצע כי יצירת H2O2 בצמחים מלווה בביו-סינתזה משנית-מטבוליטים בצמחים.Cistancheסלסהתרבית תאים. כצפוי, התוצאות שלנו מגלות כי PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה בסלסת סיסטאנצ'התרבית תאים הושרה לאחר טיפול H2O2 (טבלה 1). התוכן של שלושה PeGs עיקריים(פנילתנואידגליקוזידים)גדל לאחר הטיפול ב-H2O2 המעיד על תפקידו המרכזי בביו-סינתזה של PeGs. גנים מועשרים בספריית SSH הציעו עוד יותר את השפעתו על PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)אינדוקציה של ביוסינתזה בסלסת סיסטאנצ'ה.

גנים רבים שמגיבים ל-H2O2-, כגון ascorbate peroxidase (CISTH069, Karyotou and Donaldson 2005), h-quinone oxidoreductase (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 2014), וגנים לתגובה עמידות למחלות (Contig10, Nanda, et al. 2010), הועשרו בספריית SSH (טבלה 3, טבלה 2 משלימה). חלק מהגנים הטיפוסיים הללו המגיבים ל-ROS עם ביטוי המושרה לאחר הטיפול ב-H2O2 אושרו עוד יותר על ידי RT-qPCR (איורים 1 ו-2) המצביעים על כך שנבנתה כאן ספריית SSH מוסמכת. שני גנים של מסלול ביוסינתזה של PeG, CsC4H1 ו-Cs4CL1, נמצאו גם בספרייה זו ושני ביטויי גנים אלה הושרה על ידי הטיפול ב-H2O2 באופן תלוי זמן (איור 2). זה מצביע על כך שהטיפול ב-H2O2 גרם ל-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה ברמה הגנטית באמצעות ויסות גנים של מסלול PAL. עם זאת, PAL וגנים אחרים של ביוסינתזה של PeGs במורד הזרם (Wang et al. 2012) לא זוהו בספריית SSH; ייתכן שהסיבה לכך היא שהספרייה לא עברה רצף מספיק. יש להבהיר קשר בין ביטויים המושרים על ידי CsC4H1 ו-Cs4CL1 וביוסינתזה מוגברת של PeGs לאחר הטיפול ב-H2O2 על ידי ניתוח נוסף.

בנוסף לגנים של מסלול ה-PAL המושרה על ידי הטיפול ב-H2O2, שני גורמי שעתוק ממשפחת WRKY (CsWRKY1, CsWRKY2) נמצאו בספריית SSH (טבלה 3 וטבלה 2 תוספות), וביטוי המושרה על ידי CsWRKY1 אושר על ידי RT-qPCR . הביטוי שלו היה מגיב לטיפול H2O2 מוקדם יותר מביטוי של שני גנים של מסלול PAL, Cs4CL1 ו-CsC4H1 (איור 2). ממחקרים קודמים, ביטוי משותף של כמה גורמי שעתוק WRKY וגנים של מסלול PAL נצפה באורז (Gupta et al. 2012). יתר על כן, ביטוי גן PAL מווסת למעלה במוטנט לביטוי יתר של OsWRKY03 (Liu et al. 2005). שני גורמי התמלול המשפחתיים של WRKY שהוזכרו לעיל עשויים להיות מעורבים גם ב-PEG(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה בCistancheסלסה. מעניין לציין כי ESTs הקשורים להתייבשות (CISTH067, CISTH064) נמצאו בספריית SSH, מה שעשוי להצביע על כך שהטיפול ב-H2O2 היה קשור לביטוי גנים מגיבים להתייבשות בCistancheסלסהכפי שנצפה בצמחים אחרים (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). גן אחד הקשור לאיתות ג'יברלין (GA), דמוי קולטן ג'יברלין gid1b (CISTH092), זוהה בספריית SSH מה שמרמז על הקשר של איתות GA וטיפול ב-H2O2 בCistancheסלסה, אשר דווח גם בשעורה (Bahin et al. 2011). עם זאת, יש צורך במחקרים נוספים כדי לאשר אם הגנים הללו קשורים ל-PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה. מלבד הגנים שהוזכרו לעיל, ספריית SSH שנבנתה כאן מציגה גם גנים עם או בלי פגעי BLAST. זה משפר את ההבנה שלנו לגבי השפעת H2O2 על C. salsa ובתחילה מספק את המידע של הגנים שלו המעורבים בביוסינתזה של PeGs.

לסיכום, הערכנו את ההשפעה של H2O2 על PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)אינדוקציה בCistancheסלסהתרבית תאים. ספריית SSH נבנתה לאחר הטיפול ב-H2O2, והביטוי של גנים נבחרים אושר על ידי RT-qPCR. זוהו שני גנים הקשורים למסלול ביוסינתזה של PeG וגנים אחרים המגיבים ל-H2O2-. ממצאים אלה ירחיבו את ההבנה שלנו לגבי PEGs המושרים על ידי H2O2-(פנילתנואידגליקוזידים)ביוסינתזה בCistancheסלסהלרמה המולקולרית, לספק את המידע למניפולציה גנטית שלCistancheסלסהתרביות תאים לשיפור PeGs(פנילתנואידגליקוזידים)הפקה.

מתוך: 'זיהוי ESTs המגיבים למי חמצן המעורבים בביו-סינתזה של גליקוזידים פנילתנואידים בתרבית תאי סלסה של Cistanche' על ידיJ. CHEN וחב'.

--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-y

הפניות

Bahin, E., Bailly, C., Sotta, B., Kranner, I., Corbineau, F., Leymarie, J.: דיבור צולב בין מיני חמצן תגובתיים ומסלולי איתות הורמונליים מסדיר את תרדמת הדגנים בשעורה. - סביבת תא צמחים. 34: 980-993, 2011.
Baruah, K., Norouzitallab, P., Linayati, L., Sorgeloos, P., Bossie,r P.: מיני חמצן תגובתיים הנוצרים על ידי מוצר מעורר הלם חום (Hsp) תורם לייצור Hsp70 ול-Hsp{{1} חסינות הגנה מתווכת ב-Artemia franciscana נגד ויבריות פתוגניות. - Dev. Comp. אימונול. 46: 470-479, 2014.
Bello, RI, Gomez-Diaz, C., Navarro, F., Alcain, FJ, Villalba, JM: ביטוי של NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 בתאי HeLa  תפקיד מי חמצן ושלב הצמיחה. - ג'יי ביול. Chem. 276: 44379-44384, 2001.
Bustin, SA, Vandesompele, J., Pfaffl, MW: סטנדרטיזציה של qPCR ו-RT-qPCR. - ג'נט. Eng. ביוטכנולוגיה. חדשות 29: 40-43, 2009.
Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., N, I W., Liu, CZ:Cistancheתרביות תרחיף תאי deserticola:פנילתנואידגליקוזידיםביוסינתזה ופעילות נוגדת חמצון. - תהליך ביוכימיה. 40: 3119-3124, 2005.
Cheng, XY, Zhou, HY, Cui, X., Ni, W., Liu, CZ שיפור שלפנילתנואידגליקוזידיםביוסינתזה בCistancheתרביות תרחיף תאי deserticola על ידי elicitor chitosan. - J. Biotechnol. 121: 253-260, 2006.
Furlan, A., Llanes, A., Luna, V., Castro, S.: חומצה אבסקיסית מתווכת ייצור מי חמצן בבוטנים הנגרמים מלחץ מים. - ביול. צמח. 57: 555-558, 2013.
Gupta, SK, Ra,i AK, Kanwar, SS, Chand, D., Singh, NK, Sharma, TR: הגן הפונקציונלי של התנגדות פיצוץ Pi54 מפעיל מנגנון הגנה מורכב באורז. - J. exp. בוט. 63: 757-772, 2012.
Hu, GS, Jia, JM, Hur, YJ, Chung, YS, Lee, JH, Yun, DJ, Chung, WS, Yi, GH, Kim, TH, Kim, DH: אפיון מולקולרי של גן פנילאלנין אמוניה-ליאזCistancheמדברית. - מול. ביול. נציג 38: 3741-3750, 2011.
Kar, RK: תגובות צמחים ללחץ מים: תפקידם של מיני חמצן תגובתיים. - Plant Signal Behavior 6: 1741-1745, 2011.
Karyotou, K., Donaldson, RP: Ascorbate peroxidase, שואב מי חמצן בקרומים גליאוקסיזומליים. - קשת ח. Biochem. ביופיס. 434: 248-257, 2005.
Kobayashi, H., Karasawa, H., Miyase, T., Fukushima, S.: מחקרים על המרכיבים שלcistancheהוא הרבה. 4. בידוד ומבנים של 2 גליקוזידים פנילפרופנואידים חדשים, cistanoside-C, ו-cistanoside-D. - Chem. פארם. שׁוֹר. 32: 3880-3885, 1984.

Liu, CZ, Cheng, XY: שיפור שלפנילתנואידגליקוזידיםביוסינתזה בתרביות תאים שלCistanchedeserticola על ידי מתח אוסמוטי. - Plant Cell Rep. 27: 357-362, 2008.
Liu, JY, Guo, ZG, Zeng, ZL: הצטברות משופרת שלפנילתנואידגליקוזידיםעל ידי האכלה מבשר לתרבות ההשעיה שלCistancheסלסה. - ביוכימיה. Eng. J. 33: 88-93, 2007.
Liu, XQ, Bai, XQ, Qian, Q., Wang, XJ, Chen, MS, Chu, CC: OsWRKY03, מפעיל שעתוק אורז שמתפקד במסלול איתות הגנה במעלה הזרם של OsNPR1. - Cell Res. 15: 593-603, 2005.
Murashige, T., Skoog, F.: מדיום מתוקן לצמיחה מהירה ובדיקות ביולוגיות עם תרביות רקמת טבק. - פיזיול. צמח. 15: 473-497, 1962.
Nan, ZD, Zeng, KW, Shi, SP, Zhao, MB, Jiang, Y., Tu, PF:פנילתנואידגליקוזידיםעם פעילויות אנטי דלקתיות מהגבעולים שלCistancheדזרטיקולה מתורבתת במדבר טארים. - Fitoterapia 89: 167-174, 2013.
Nanda, AK, Andrio, E., Marino, D., Pauly, N., Dunand, C.: מיני חמצן תגובתיים במהלך אינטראקציות מוקדמות בין צמח למיקרואורגניזם. - J. Integr. צמח ביול. 52: 195-204, 2010.
Ouyang, J., Wang, XD, Zhao, B., Wang, YC: ייצור משופר שלפנילתנואיד גליקוזידיםעל ידי הזנת מבשר לתרבית התאים שלCistancheמדברית. - תהליך ביוכימיה. 40: 3480-3484, 2005a.
Ouyang, J., Wang, XD, Zhao, B., Wang, YC: ייצור משופר שלפנילתנואידגליקוזידיםעל ידיCistancheתאי deserticola שתורבתו בביוריאקטור של לולאה פנימית עם מעלית מסננת. - אנזים מיקרוביול. טק. 36: 982-988, 2005ב.
Salcedo-Morales, G., Jimenez-Aparicio, AR, Cruz-Sosa, F., Trejo-Tapia, G.: אפיון אנטומי והיסטוכימי של האוסטוריה במבחנה משורשי Castilleja tenuiflora. - ביול. צמח. 58: 164-168, 2014.
Sathiyaraj, G., Srinivasan, S., Kim, YJ, Lee, OR, Parvin, S., Balusamy, SR, Khorolragchaa, A., Yang, DC: אקלום מי חמצן משפר את סבילות למלח על ידי הפעלת חלבונים הקשורים להגנה ב Panax ג'ינסנג CA Meyer. - מול. ביול. נציג 41: 3761-3771, 2014.
שמידט, R., Mieelt, D., Hubberten, HM, Obata, T., Hoefgen, R., Fernie, AR, Fisahn, J., Segundo, BS, Guiderdoni, E., Schippers, JHM, Mueller-Roeber, ב.: SALTRESPONSIVE ERF1 מווסת איתות התלוי במין חמצן תגובתי במהלך התגובה הראשונית ללחץ המלח
באורז. - תא צמח 25: 2115-2131, 2013.
Wang, T., Zhang, XY, Xie, WY:Cistanchedeserticola YC Ma, "ג'ינסנג במדבר": סקירה. - עאמר. ג'יי סנטר. Med. 40: 1123-1141, 2012.
Wi, SG, Chung, BY, Kim, JH, Lee, KS, Kim, JS דפוס שיקוע של מי חמצן במעטפת העלים של אורז תחת לחץ מלח. - ביול. צמח. 50: 469-472, 2006.
Zhou, XF, Jin, YH, Yoo, CY, Lin, XL, Kim, WY, Yun, DJ, Bressan, RA, Hasegawa, PM, Jin, JB: CYCLIN H1 מווסת את תגובות הלחץ לבצורת ופתיחת הסטומטית הנגרמת על ידי אור כחול על ידי עיכוב הצטברות מיני חמצן תגובתיים בארבידופסיס. - פיזיול צמחי. 162: 1030-1041, 2013.