מעבר אפיתל-למזנכימלי המושרה על ידי היפוקסיה בתאי אפיתל פרוקסימליים צינוריים דרך MiR-545-3p–TNFSF10

מיי-צ'ואן קואו ¹, ווי-אן צ'אנג ^2,3et al

תַקצִיר:היפוקסיה נחשבת לאחד המנגנונים הפתופיזיולוגיים של פגיעה בכליות והתקדמות נוספת לאי ספיקת כליות. מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) באבוביות בכליות הוא תהליך קריטי של פיברוזיס בכליות. מחקר זה השתמש בניתוח תעתיקים כדי לחקור EMT המושרה בהיפוקסיה באמצעות EMT מווסת מיקרו-RNA (miRNA) בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים (PTECs). ריצוף RNA גילה שמונה miRNAs היו מווסתים למעלה ושלושה miRNAs היו מווסתים ב-PTECs שהורכבו תחת היפוקסיה בהשוואה לנורמוקסיה. מבין 11 ה-miRNAs, ל-miR-545-3p יש את הביטוי הגבוה ביותר ב-PTECs שנחשפו להיפוקסיה, ו-miR-545-3p דיכא ביטוי ליגנד מעורר אפופטוזיס (TRAIL/TNFSF10) הקשור לגורם נמק של גידול. EMT המושרה בהיפוקסיה ב-PTECs באמצעות אפנון miR-545-3p-TNFSF10, ו-TNFSF10-מוחלש EMT כתוצאה מהיפוקסיה או miR-545-3p מחקות טרנספקציה. ממצאים אלה סיפקו תפיסות חדשות לגבי הרגולציה הייחודית של האינטראקציה miR-545-3p-TNFSF10 והשפעות הטיפוליות הפוטנציאליות שלהם על פגיעה בכליות הנגרמת כתוצאה מהיפוקסיה.

מילות מפתח: היפוקסיה; miR-545-3p; TNFSF10; מעבר אפיתל למזנכימלי; תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים; ניתוח טרנסקריפטום

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

הטבות cistanche במדבר: לשפר את תפקוד הכליות ולהקל על פגיעה בכליות

1. הקדמה

מחלת כליותהוא נושא בריאותי עולמי, שמגביר את התחלואה והתמותה ומחמיר עוד יותר את הנטל הכלכלי הכבד ברחבי העולם. פיברוזיס בכליות היה נקודת ציון של התקדמות לקויה של מחלות כליה שונות, מה שהוביל למחלת כליות סופנית [1].

היפוקסיה משחקת תפקיד קריטי ברקמת כליה פציעהוהתקדמות נוספת לפיברוזיס בכליות [2]. היפוקסיה היא מווסת חזק של תהליכים תאיים מרובים, כולל חילוף חומרים, גדילה והישרדות תאים באמצעות מנגנוני חישת חמצן [3]. תגובות התעתיק למחסור בחמצן מתווך בעיקר על ידי גורמים הגורמים להיפוקסיה (HIF), הפועלים במהלך התפתחות תקינה ובתהליכים פתולוגיים בשילוב עם ירידה בזמינות החמצן [4]. היפוקסיה כרונית יכולה לעורר תגובה של נזק לכליות ולגרום לטרנספורמציה של פנוטיפ בלתי הפיך בתאי אפיתל צינורי, מה שגורם לפיברוזיס כליות [5,6]. מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) הוא תהליך קריטי של פיברוזיס בכליות שבאמצעותו תאי אפיתל מאבדים את מאפייני האפיתל שלהם ורוכשים את התכונות המזנכימליות [7,8]. ההפעלה של איתות HIF בתאי אפיתל כליות עשויה לקדם פיברוגנזה על ידי הקלת EMT [9]. שינוי ברמות החמצן והפעלת איתות היפוקסי באמצעות HIF מופיעים כטריגרים ומאפננים חשובים של EMT [10]. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ה-EMT ופיברוזיס הגורמים להיפוקסיה אינם מובנים במלואם.

MicroRNAs (miRNAs), כגורמים מווסתים שלאחר שעתוק, נחשבים למווסתים רבי עוצמה של ביטוי גנים ופנוטיפים תאיים. עדויות מצטברות מראות שהיפוקסיה מווסתת את הביוגנזה והפעילות של miRNAs [11]. כמה מחקרים דיווחו על ביטויים שונים של miRNAs והשפעותיהם על התפתחות EMT ופיברוזיס בכליות תחת היפוקסיה [12-14]. דו וחב'. הציע כי הורדת ויסות של miR-34מקדם EMT בתאי אפיתל צינוריים [13]. Xie et al. הצביע על כך ש-upregulation של miR-155 הביא לפיברוזיס באבוביות הפרוקסימליות [14]. עם זאת, האם miRNAs מתווך את מסלול האיתות הפתוגנטי של EMT המושרה בהיפוקסיה בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים (PTECs) לא נחקר היטב על ידי שימוש בניתוח טרנסקריפטום.

לפיכך, במחקר זה, השתמשנו בניתוח רצף RNA קטן של PTECs בתנאי נורמוקסיה והיפוקסיה כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של ויסות מסלולי האיתות בתיווך היפוקסיה של פגיעה בכליות.

cistanche tcmטוב למחלת כליות כורית

2. חומרים ושיטות

2.1. תצפית תרבות תאים ומורפולוגיה

PTECs אנושיים (ATCC PCS{{0}}) תורבו במדיום בסיסי של תאי אפיתל כליות (ATCC PCS400030™) בתוספת 0.5 אחוז נסיוב בקר עוברי (FBS), לפי הצעת היצרן. תאי HK-2 נרכשו מאוסף American Type Culture Collection (מנאסס, VA, ארה"ב). תאי HK-2 תורבו ב-Keratinocyte-SFM (GIBCO) עם תוספת של 2 אחוז FBS. תאים תורבו תחת נורמוקסיה (O2, 21 אחוז) והיפוקסיה (O2, 1 אחוז).

המאפיינים של EMT ב-PTECs אנושיים זוהו על ידי תצפיות סדרתיות של השינויים המורפולוגיים שלהם באמצעות מיקרוסקופ אור (Nikon ECLIPSE TE20000-S, Nikon, Tokyo, Japan).

2.2. Western Blot Analysis

החלבון הכולל של תאי HK-2 הופץ באמצעות חיץ תמוגה (EMD Millipore, Burlington, MA, USA). החלבון הדנטורטי הופרד על ידי 9-11 אחוזים של אלקטרופורזה SDS-PAGE ולאחר מכן הועבר לממברנת PVDF בעקבות חסימה ואימונובלוטינג על ידי נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים.

נוגדנים נגד HIF-1 (קטלוג #nb100-105, Novus), HIF-2 (קטלוג מס' 7096s, Cell Signaling), N-cadherin (קטלוג מס' 610921, BD Biosciences), vimentin ( נעשה שימוש בקטלוג מס' 550513, BD Biosciences), E-cadherin (קטלוג מס' 610182, BD Biosciences), שבלול (קטלוג מס' 9585s, Cell Signaling), ו-GAPDH (קטלוג מס' MAB374, EMD Millipore). האותות של הכתם נתפסו באמצעות מערכת Proteinsimple plus Fluorchem Q (Alpha Innotech, San Leandro, CA, ארה"ב). דנסיטומטריה של הכתם חושבה באמצעות תוכנת Image J (Bethesda, MD, ארה"ב).

2.3. רצף RNA קטן

HK-2 cells were cultured under hypoxia or normoxia conditions for 48 h. NGS was performed to examine the miRNA profiles of HK-2 cells. Trizol® Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA) was utilized to extract total RNA from the harvested cells, which were isolated for further RNA preparation and small RNA-seq by Welgene Biotechnology Company (Welgene, Taipei, Taiwan). The quality of the extracted RNA was evaluated by an RNA integrity number (RIN), which was measured using an Agilent Bioanalyzer (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Samples were prepared to manufacture the small RNA library and then to execute deep sequencing by the Illumina sample preparation kit. PCR amplification was performed to ligate total RNA with 30 and 50 adaptors and to reverse￾transcription into cDNA. cDNA constructs were separated using 6% polyacrylamide gel Biomolecules 2021, 11, 1032 3 of 14 electrophoreses, and 18–40 nucleotide RNA fragments (140–155 nucleotide in length with both adapters) were extracted. The sequencing of the libraries was performed using an Illumina GAIIx instrument (50 cycle single read) and then the results were processed by the Illumina software. The differentially expressed miRNAs between HK-2 cells treated with normoxia or hypoxia were defined at >2-fold change and >10 קריאות למיליון.

2.4. זמינות נתונים

נתוני רצף ה-RNA שנוצרו בפרסום זה הופקדו ב-GEO תחת ההצטרפות GSE178810.

2.5. בידוד RNA, שעתוק הפוך ו-PCR כמותי בזמן אמת (Q-PCR)

סך ה-RNA מתאי תרבית בתנאי נורמוקסיה או היפוקסיה או שטופלו במעכבי HIF-1 (CAY10585, (3-(2-(4-Adamantane-1-yl-phenoxy )-acetylamino)-4-hydroxybenzoic acid methyl ester) למשך 48 שעות (10 uM, קטלוג מס' 400092, Calbiochem) בודד באמצעות TRIzol ו-TRIzolLS Reagent (Life Technologies), בהתאמה. miRNAs הועתקו לאחור באמצעות Mir-X ערכת סינתזה ™ miRNA First-Strand (קטלוג מס' 638313 Takara, יפן). SYBR Green שימש לניתוח ה-miRNA הכמותי עם מערכת QuantStudio 3Q-PCR (ThermoFisher Scientific, Foster City, CA, ארה"ב). רמות ביטוי יחסי של ה-miRNA ו-RNA בתאים נורמלו לבקרה הפנימית U6 או GAPDH, בהתאמה. ביטויים יחסיים הוצגו בשיטת 2−∆∆Ct. הפריימרים בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה S1.

2.6. כלי ניתוח ביואינפורמטיקה

המטרות של miRNAs ספציפיות נחזו באמצעות שני אתרי ביואינפורמטיקה, מסדי הנתונים miRmap [15] ו- TargetScan [16], שיכולים לספק תחזיות יעד של miRNA עבור אורגניזמים שונים. הן תוכנת miRmap והן תוכנת TargetScan מסווגת יעדי miRNA פוטנציאליים ומציינת את חוזק ההדחקה של יעד miRNA בהתבסס על ציוני miRmap ואחוזונים של ציון Context plus plus [17].

הפונקציות הביולוגיות של יעדי ה-miRNA שנבחרו נותחו באמצעות תוכנת IPA (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, ארה"ב), המספקת "ניתוח ליבה" של הגנים/חלבונים. ניתן להשתמש ברשימות מסלולים, רשתות ורעילות קנוניות המתקבלות מניתוח הליבה כדי לזהות את הפתוגנזה הפוטנציאלית של הגנים/חלבונים [18].

2.7. טרנספקציה חולפת

חיקוי miR-545-3p (200 ננומטר) ובקרה שלילית של המימיקה (miR-NC, 200 ננומטר) (GE Healthcare, ארה"ב) הועברו לתאים באמצעות ריאגנט ההעברה Lipofectamine™ RNAiMAX (קטלוג מס' 13778075 , ThermoFisher Scientific, ארה"ב) בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. הרצף של חיקויי miR-545-3p בשימוש מופיע בטבלה משלימה S1.

2.8. Assay Immunosorbent מקושר אנזים (ELISA)

ריכוזי TNFSF10 של הסופרנטנטים של תאי HK-2 שהתרביתו תחת נורמוקסיה, היפוקסיה או לאחר טרנספקציה עם חיקוי miR-545-3p בתנאי היפוקסיה למשך 48 שעות נמדדו עם ערכת ה-Quantikine1 ELISA הזמינה מסחרית ( קטלוג #DTRL00, מערכות מו"פ) לפי הוראות היצרן, כמו קודם לכן

מְתוּאָר.

2.9. ניתוח סטטיסטי

המשתנים הרציפים הובאו כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) או חציון (אחוזון 25 ו-75) לפי העניין, בעוד שמשתנים קטגוריים הובאו באחוזים. המתאם בין משתנים רציפים נבדק על ידי מתאם ספירמן. המשמעות של ההבדלים במשתנים רציפים בין קבוצות נבדקה באמצעות מבחן t של Student או אנליזה חד כיוונית של שונות (ANOVA), ולאחר מכן המבחן הפוסט-הוק מותאם עם תיקון Tukey בהתאם לצורך. ביומולקולות סטטיסטיות 2021, 11, 1032 4 מתוך 14 ניתוחים נערכו באמצעות GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). מובהקות סטטיסטית נקבעה לערך p דו צדדי של<>

אבקת costanche herbaיש השפעה מתקנת טובה עלנזק כלייתי

3. תוצאות

3.1. היפוקסיה גורמת ל-EMT ב-PTECs

דווח כי היפוקסיה משתתפת במנגנונים פתופיזיולוגיים שלפגיעה בכליות[9]. כדי לחקור את השינוי הפנוטיפי של תאי PTEC של כליות אנושיים (RPTECs) ו-HK-2 בתנאי היפוקסיה, תאים תורבו בתנאי נורמוקסיה (O2, 21 אחוז) והיפוקסיה (O2, 1 אחוז) במשך 48 שעות. מצאנו שביטויי HIF-1 ו-HIF-2 היו מוגברים בתאי RPTEC ו-HK-2 בתנאי היפוקסיה במשך 6 שעות (איור 1A). מורפולוגיות התא נצפו ושונו מצורה עגולה לפנוטיפ מוארך ותנועתי בתנאי היפוקסיה בהשוואה לתנאי נורמוקסיה (איור 1B).

נעשה שימוש ב-Western blotting להערכת EMT ב-PTECs בתנאי נורמוקסיה או היפוקסיה. היפוקסיה העלתה ביטוי N-cadherin ווימנטין והפחתת ביטוי E-cadherin בתאי PTECs אנושיים (איור 1C) ו-HK-2 (איור 1D) לאחר תקופת דגירה של 48-שעות. לכן, היפוקסיה גורמת ל-EMT ב-PTECs.

3.2. זיהוי של miR-545-3p המשתתף ב-EMT המושרה על ידי היפוקסיה ב-PTECs

תרשים הזרימה של חקר מירנאים פוטנציאליים המושרים על ידי היפוקסיה מוצג באיור 2A. הפרופיל של RNAs קטנים מתאי HK-2 שתורבתו תחת נורמוקסיה או היפוקסיה במשך 24 שעות טופלו על ידי NGS. 21 miRNAs עם שינוי משמעותי של פי 2- נמצאו בתאי HK-2 שנחשפו להיפוקסיה בהשוואה לאלו שהתרבית תחת נורמוקסיה.

מתוך 21 miRNAs, 10 miRNAs היו מווסתים ו-11 miRNAs היו מווסתים. לאחר אי הכללת ה-miRNAs עם ספירת קריאה גולמית של פחות או שווה ל-10, הוצגו 11 miRNAs משמעותיים (8 מווסתים ו-3 מטה בתנאי היפוקסיה) הוצגו על ידי מיפוי חום (איור 2B וטבלה S1). השתמשנו ב-RT-Q-PCR כדי לאמת את הביטוי של miRNAs אלה בשני מודלים במבחנה, כולל RPTECs אנושיים ותאי HK-2 בתנאי נורמוקסיה והיפוקסיה. בין 11 ה-miRNA, לא ניתן היה לזהות miR-190a-3p ו-miR-1277-3p באמצעות qT-PCR, והביטוי הבלתי עקבי של miR-1269a, miR{ נמצאו {18}}p, miR- 33b-5p, miR-33a-5p ו-miR-219a-5p בתאי PTEC ו-HK-2 אנושיים לאחר טיפול בהיפוקסיה (איור 2C-G). רמות miR-1266-5p, miR-4474-3p ו-miR-5579-3p ירדו הן בתאי PTEC אנושיים והן בתאי HK-2 בתנאי היפוקסיה (איור 2H–J). ביטוי miR-545-3p לא רק היה הגבוה ביותר מבין 11 ה-miRNAs בתאי HK-2 שנחשפו להיפוקסיה בהשוואה לאלו שטופלו בנורמוקסיה, אלא גם היה מוגבר ב-PTECs אנושיים בתנאי היפוקסיה (איור 2K). עוד בדקנו האם HIF-1 מעורב בוויסות של ביטוי miR-545-3p (איור S1), ומצאנו כי מעכב HIF-1 דיכא את עליית miR-545-3p ב-HK -2 תאים המושרים על ידי היפוקסיה (איור 2L). הממצאים לעיל הצביעו על כך ש-HIF-1 מווסת את ביטוי ה-miR-545-3p בצינוריות הפרוקסימליות בתנאי היפוקסיה.

לפי הביטוי הגבוה ביותר של miR-545-3p מבין 11 ה-miRNAs בתאי HK-2 שנחשפו להיפוקסיה, התפקוד הפתופיזיולוגי של היעדים הפוטנציאליים המבוססים על miR-545-3p, עם ציון miRmap > 90 לפי מסד הנתונים miRmap, נותחו באמצעות ניתוח ליבה של מסד הנתונים של IPA. עשרת המסלולים הקנוניים של ניתוח IPA חשפו שהתפקוד הפתופיזיולוגי של miR-545-3p כלל ויסות של EMT על ידי גורמי גדילה (איור 3A). ניתוח רשימת הרעלים הצביע על כך ש-miR-545-3p נמצא בקורלציה עם פגיעה כלייתית ותגובת מתח חמצוני (איור 3B). בהתבסס על התוצאות של ניתוח ביואינפורמטיקה, היפוקסיה עשויה לגרום ל-EMT ב-PTECs באמצעות אפנון miR-545-3p.

בנוסף, ניתוח רשת של היעדים הפוטנציאליים של miR-545-3p הראה כי miR-545-3p ו-TNFSF10, כיעדים המווסתים על ידי miR-545-3p, היו מעורבים גם בשגשוג הסלולרי ובתא מחזור (טבלה 3).

miRmap ו-TargetScan (גרסה 7.1) שימשו לביצוע תחזיות ביו-אינפורמטיות, שהצביעו על כך שה-3/ UTR של TNFSF10 מכיל את רצף הזרעים היעד לקישור של miR-545-3p. ציוני mipmap ההסתברותיים מצביעים על ההסתברות של גני המטרה החזויים של miR -545-3p (איור 3C). רצף הזרעים של miR-545-3p ב-3/ UTR של TRAIL מוצג באיור 3D. טיפול בהיפוקסיה הוריד את רמת ה-MRNA TNFSF10 של תאי PTEC אנושיים (איור 3E) ו-HK-2 (איור 3F). חוץ מזה, נמצאה ירידה ברמת mRNA TNFSF10 בסופרנטנטים שמקורם בתאי HK-2 תחת היפוקסיה בהשוואה לנורמוקסיה (איור 3G). יתר על כן, טרנספקציה של ה-miR-545-3p חיקה את ביטוי ה-mRNA של TNFSF10 בסופרנטנט של תאי HK-2 (איור 3H). מעכב HIF-1 הפך את הירידה בביטוי ה-TNFSF10 mRNA בתאי HK-2 המושרה על ידי היפוקסיה (איור 3I). לפיכך, היפוקסיה מווסתת את הביטוי של miR-545, אשר לאחר מכן הפחיתה את ביטוי TNFSF10, ו-HIF-1 עשוי לשנות את מסלול miR-545-3p-TNFSF10.

3.4. היפוקסיה משרה EMT בתאי HK על ידי מודולציה של miR-545-3p–TNFSF10

כדי להעריך אם miR-545-3p מווסת EMT משרה היפוקסיה באבובית הפרוקסימלית, הערכנו את ההשפעות הביולוגיות של miR-545-3p ו-TNFSF10 בתאי HK-2. ראשית, טיפול ב-TNFSF10 (20 ng/mL) לא השפיע על כדאיות התא של תאי HK-2 (איור 4A). עוד בחנו את ביטוי שבלול, כאחד מגורמי התעתוק לוויסות EMT. ביטוי שבלול גדל בתאי HK-2 לאחר טרנספקציה עם miR-545-3p (איור 4B) ודוכא בתאי HK-2 שטופלו ב-TNFSF10 (איור 4C) בתנאי נורמוקסיה. לאחר טרנספקציה של חיקוי miR-545-3p, ביטוי E-cadherin היה מווסת למטה, וביטוי N-cadherin ו-vimentin היה מווסת למעלה בתאי HK-2 בתנאי נורמוקסיה (איור 4D). עם זאת, TNFSF10 הפך את ההשפעה של miR-545-3p בהשראת EMT בתאי HK-2. בנוסף, טיפול ב-TNFSF10 (20 ng/mL) מנע הורדת ויסות E-cadherin ודיכא את ה-N-cadherin ו-vimentin upregulation, והפך EMT בתאי HK-2 המושרה על ידי היפוקסיה בתאי HK-2 (איור 4E). ממצאים אלו הביאו לכך שהיפוקסיה תרמה ל-EMT ב-PTECs באמצעות אפנון של מסלול miR-545-3p– TNFSF10, ו-TNFSF10 יכול להחליש את EMT ב-PTECs המושרה על ידי היפוקסיה ו-miR-545-3p.

4. דיון

היפוקסיה גורמת לחוסר תפקוד מורפולוגי ופתופיזיולוגי שלכִּליָה, מה שמוביל לירידה מהירה בתפקוד כליות[16]. מחקר זה השתמש בניתוח תעתיקים כדי לחקור את ה-miRNAs הפוטנציאליים המשתתפים בתהליך ה-EMT המושרה בהיפוקסיה ב-PTEC, והוכיח כי miR-545-3p היה מווסת מוגברת ב-PTECs שטופלו בהיפוקסיה, ו-HIF-1 מווסת miR{{ 4}}p וביטוי TNFSF10. הגברה של miR-545-3p הובילה ל-EMT ב-PTECs תחת היפוקסיה. יתר על כן, TNFSF10 שיפר את ה-EMT ב-PTECs שטופלו בהיפוקסיה. לכן, השגנו תפיסות חדשות על ידי מימוש הרגולציה הייחודית של miR-545-3p–TNFSF10, שממנה נוכל לפרש את התקדמות מחלת הכליות (איור 5).

הממצאים שלנו הדגימו ביטוי miR-545-3p מווסת היפוקסיה בצינוריות פרוקסימליות. ידוע כי miRNAs ממלאים תפקיד קריטי באפנון של ביטוי או פעילות גנים ומווסתים עוד יותר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של הופעת מחלות או התקדמותן [19]. מחקרים קודמים גילו כי miR-545 שימש כמקדם גידול, אשר מווסת את התפשטות התאים, הפלישה והנדידה, והביאו עוד יותר לקרצינומה כבדית [20,21]. miR-545 גרמה לתהליך דלקת ותרמה לשחמת כבד הקשורה להפטיטיס B באמצעות מיקוד ל-Tim-3 [22]. לעומת זאת, miR-545-3p חסם חלקית את lncRNA XIST ושיפר את האפופטוזיס של מיובלסטים לבביים שנגרמו על ידי היפוקסיה/חמצן מחדש [23]. עם זאת, האם miR-545 משתתף בפתוגנזה של מחלות כליה לא נחקר היטב. מספר מחקרים הראו ש-miR-545-3p השתתפה בפגיעה חריפה בכליות הקשורה לאלח דם [24,25]. Tan et al. דיווח כי circ_0091702 משמש כספוג של miR-545-3p לדיכוי אפופטוזיס של תאי HK-2 המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות וויסות תרומבוספונדין 2 [24]. הו ואח'. מצא שביטוי-יתר של רגישות לסרטן 2 לא מקודדת הקלה על אפופטוזיס המושרה על ידי LPS בתאי HK-2 באמצעות ויסות ציר הקולטן המופעל על ידי miR-545-3p/peroxisome proliferator [25]. שי ואח'. הצביע על כך ש-circPRKCI הצילה פציעה דלקתית שנגרמה על ידי LPS בתאי HK-2 על ידי דיכוי ה-miR-545/אצבע אבץ E-box-binder homeobox 2 [26]. מחקר הנוכחי הזה הצביע לראשונה על ההשפעה של miR-545-3p על EMT המושרה בהיפוקסיה בכליה. היפוקסיה העלתה את רמות miR-545-3p, ו-HIF-1 מווסת את ביטוי ה-miR-545-3p ב-PTECs. miR-545-3p גרמה להעלאת שבלול וקידמה עוד יותר EMT, כולל דיכוי של ביטוי miR-545-3p E-cadherin ושיפור של ביטוי N-cadherin ווימנטין ב-PTECs. הדגמנו מסלול אות חדש של אפנון תהליך EMT בצינוריות פרוקסימליות תחת היפוקסיה.

כמו כן, דווח כי היפוקסיה מווסתת את ביטוי TNFSF10 ואת התהליך הפיזיולוגי [27,28]. פאנג וחב'. הציע כי HIF-1 הגביר TNFSF10-השראת אפופטוזיס באמצעות הגדלת ביטוי TNFSF10 קולטן פיתוי 1 (DcR1) בפגיעה מוחית טראומטית [27]. חרשימה ואח'. הצביע על כך ש-HIF-2 הגבירה את הרגישות של תאי סרטן הלבלב ל-TNFSF10 בתנאי היפוקסיה [28]. עם זאת, לא ברור כיצד לווסת את TNFSF10 באמצעות תעתיק של מיRNA, במיוחד בפגיעה בכליות הנגרמת על ידי היפוקסיה. הממצאים שלנו מספקים תובנה חדשה בכך שהיפוקסיה מווסתת את ביטוי TNFSF10 בצינוריות הפרוקסימליות באמצעות miR-545-3p. היפוקסיה הגבירה את רמות ה-miR-545-3p, ובתמורה, דיכאה את ביטוי TNFSF10 ב-PTECs והסופרנטנטים שלהם כדי לגרום לתהליך EMT. בנוסף, מצאנו גם שהיפוקסיה מווסתת את מסלול miR-545-3p–TNFSF10 בצינוריות פרוקסימליות דרך HIF-1. עם זאת, האם HIF-2 מווסת את המסלול הזה בכליה בסביבה של היפוקסיה לא ברור. יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את ההשפעה של תת-הסוגים של גורמי שעתוק HIF על ויסות miR-545-3p-TNFSF10 בפגיעה בכליות.

עדויות מצטברות מראות שבני משפחת העל של TNF מעורבים באופן פעיל בפתופיזיולוגיה של התפתחות והתקדמות של מחלות כליה [29]. חברי משפחת העל של TNF מווסתים את ביצועי התא, כגון התמיינות, שגשוג, נמק, אפופטוזיס או פיברוזיס, בהתאם לשלבים השונים של נזק לכליות [30,31]. TNFSF10, כסוכן טיפולי פוטנציאלי אנטי-סרטני, יכול לעכב את צמיחת התאים ולשפר את אפופטוזיס התא באמצעות קישור לקולטני מוות טרנסממברניים מסוג I ספציפיים, ובכך לסייע ביעילות הטיפול הכימותרפי בסוגי סרטן שונים [29,32]. מחקרים אחרונים מצאו קשר שלילי בין TNFSF10 בסרום לבין תוצאות קליניות במחלות שאינן סרטניות [33,34]. עם זאת, תפקידו של TNFSF10 במחלות כליה לא נחקר במלואו. ביטוי מוגבר של TRAIL במחזור הדם נמצא בחולים עם מחלות כליה מסוימות, כגון מחלת כליות סוכרתית ומחלת מיני-מאל שינוי [35,36]. עיכוב של נזקים מוחלשים של TNFSF10 במודל in vivo של כליות איסכמיה-רפרפוזיה [37]. לעומת זאת, TNFSF10 במחזור הדם ירד בחולים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית בהשוואה לאנשים נורמליים [38]. אחרת, דווחו גם ההשפעות הבלתי עקביות של TNFSF10 על מחלות כליה. בניגוד להשפעה האפופטוטית על PTECs בנפרופתיה סוכרתית[30], Nguyen et al. דיווח כי TNFSF10 הפעיל תגובה דלקתית ושגשוג תאים בזאבת נפריטיס [39]. הצהרות סותרות אלו עשויות להיות קשורות לתקנות שונות של TNFSF10 בין סוגים ושלבים שונים של מחלות כליה. עד היום, עדיין קשה להסיק לגבי התפקיד האמיתי של TNFSF10 בהתפתחות והתקדמות של מחלות כליה. מחקר הנוכחי מצא כי TNFSF10 לא השפיע על כדאיות PTEC, מה שמרמז על כך שהוא לא גרם לאפופטוזיס בסוג זה של תאים. ביטוי יתר של TNFSF10 יכול לשפר את ה-EMT המושרה על ידי היפוקסיה באבוביות פרוקסימליות, מה שמרמז על ההשפעה הטיפולית הפוטנציאלית של miR-545-3p-TNFSF10 בפגיעה בכליות הקשורה להיפוקסיה.

5. מסקנות

מחקר זה הראה שהיפוקסיה תרמה ל-EMT באמצעות אפנון miR-545-3p– TNFSF10, ועיכוב miR-545-3p ו-TNFSF10 היפוקסיה היפוכה EMT ב-PTECs. לכן, ממצאים אלה מספקים תובנות חדשות לגבי הרגולציה הייחודית של miR-545-3p-TNFSF10 והשפעתם הטיפולית הפוטנציאלית בפגיעה בכליות הנגרמת כתוצאה מהיפוקסיה.

סוטהיכול לווסת כרונימחלת כליות, לחץ כאן בשביל ללמוד עוד

הפניות

1. ליו, מ.; ליו, ל.; באי, מ.; ג'אנג, ל.; מא, פ.; יאנג, X.; Sun, S. הפעלה הנגרמת על ידי היפוקסיה של ציר Twist/miR-214/E-cadherin מעודדת מעבר מזונכימלי של תאי אפיתל צינורי כליות ופיברוזיס כלייתי. Biochem. ביופיס. מילון Commun. 2018, 495, 2324–2330.

2. היימן, SN; חמאיסי, מ.; רוזן, ש.; Rosenberger, C. Renal parenchymal hypoxia, היפוקסיה תגובה והתקדמות של מחלת כליות כרונית. אמ. J. Nephrol. 2008, 28, 998–1006.

3. Giaccia, AJ; סיימון, MC; ג'ונסון, ר. הביולוגיה של היפוקסיה: תפקידה של חישת חמצן בהתפתחות, תפקוד תקין ומחלה. Genes Dev. 2004, 18, 2183–2194.

4. Movafagh, S.; קרוק, ש.; Vo, K. ויסות של גורם הגורם להיפוקסיה-1a על ידי מיני חמצן תגובתיים: התפתחויות חדשות בדיון ישן. J. Cell Biochem. 2015, 116, 696–703.

5. מנותם, ק.; טנאקה, ט.; מטסומוטו, מ.; אושה, ט.; אינאגי, ר.; מיאטה, ט; Kurokawa, K.; פוג'יטה, ט.; אינגלפינגר, JR; Nangaku, M. Transdifferentiation של תאים צינוריים מתורבתים המושרה על ידי היפוקסיה. כליות אינט. 2004, 65, 871–880.

6. בסדר, LG; Bandyopadhyay, D.; נורמן, JT האם יש מנגנון משותף להתקדמות של סוגים שונים של מחלות כליה מלבד פרוטאינוריה? לקראת הנושא המאחד של היפוקסיה כרונית. כליות אינט. Suppl. 2000, 75, S22–S26.

7. לי, י.; קאנג, י"ש; דאי, ג; נשיקה, LP; וון, X.; Liu, Y. מעבר אפיתל למזנכימלי הוא מסלול פוטנציאלי המוביל לתפקוד לקוי של פודוציטים ולפרוטאינוריה. אמ. ג'יי פאתול. 2008, 172, 299–308.

8. יאמאגוצ'י, י.; איוואנו, מ.; סוזוקי, ד.; נקאטאני, ק.; קימורה, ק.; חראדה, ק.; קובו, א.; אקאי, י.; טויודה, מ.; קוואגוצ'י, מ.; et al. מעבר אפיתל-מזנכימלי כהסבר פוטנציאלי לדלדול פודוציטים בנפרופתיה סוכרתית. אמ. J. Kidney Dis. 2009, 54, 653–664.

9. היגינס, DF; קימורה, ק.; ברנהרדט, WM; שרימנקר, נ.; אקאי, י.; הוהנשטיין, ב.; סאיטו, י.; ג'ונסון, ארס; קרצלר, מ.; כהן, תקליטור; et al. היפוקסיה מקדמת פיברוגנזה in vivo באמצעות גירוי HIF-1 של מעבר אפיתל למזנכימלי. ג'יי קלין. תחקור. 2007, 117, 3810–3820.

10. Haase, VH Oxygen מווסת את המעבר בין אפיתל למזנכימלי: תובנות לגבי מנגנונים מולקולריים ורלוונטיות למחלה. כליות אינט. 2009, 76, 492–499.

11. נאלמשטי, ש.; צ'אן, SY; Loscalzo, J. Hypoxia: מווסת מאסטר של ביוגנזה ופעילות של מיקרו-RNA. רדיק חופשי. ביול. Med. 2013, 64, 20–30.

12. צל, ש.; שמיט, ר.; וויטינג, ש; קרייפה, ח"ה; חוסיין, ק.; Becker, JU Hypoxia גורם לביטוי גנים Mesenchymal in Renal Tubular Epithelial Cells: An in vitro Model of Kidney Transplant Fibrosis. Nephron Extra 2013, 3, 50–58.

13. דו, ר.; Sun, W.; שיה, ל.; זאו, א.; יו, י.; זאו, ל.; וואנג, ה.; Huang, C.; Sun, S. ויסות מטה של ​​microRNA-34 הנגרמת על ידי היפוקסיה מקדם EMT על ידי מיקוד למסלול האיתות Notch בתאי אפיתל צינוריים. PLoS ONE 2012, 7, e30771.

14. שי, ש.; חן, ח.; לי, פ.; וואנג, ס.; Guo, J. microRNA המושרה על ידי היפוקסיה-155 מעודד פיברוזיס בתאי אבובות פרוקסימליים. מול. Med. נציג 2015, 11, 4555–4560.

15. זמין באינטרנט:

16. זמין באינטרנט:

17. Tsai, YC; Kuo, MC; הונג, WW; וו, LY; וו, PH; צ'אנג, וושינגטון; Kuo, PL; Hsu, YL גלוקוז גבוה גורם לאפופטוזיס של תאי Mesangial באמצעות miR-15b-5p ומקדם נפרופתיה סוכרתית על ידי מתן שלפוחית ​​חוץ תאית. מול. ת'ר. 2020, 28, 963–974.

18. לוינגטון, AJ; Cerda, J.; Mehta, RL העלאת המודעות לפגיעה חריפה בכליות: פרספקטיבה גלובלית של רוצח שקט. כליות אינט. 2013, 84, 457–467.

19. צ'יטווד, ד"ה; Timmermans, MC Target מחקה לווסת miRNAs. נאט. ג'נט. 2007, 39, 935–936.

20. Changjun, L.; Feizhou, H.; Dezhen, P.; זאו, ל.; Xianhai, M. MiR ציר -545-3p/MT1M מווסת את התפשטות התאים, הפלישה והנדידה בקרצינומה של הכבד. ביומד. פרמקוטר. 2018, 108, 347–354.