כיצד למנוע ולהפחית את היווצרות של אבן כליה?

לעוד information:ali.ma@wecistanche.com

חלק I. II.:P הוספטידיל-סרין אוורסיה מווסתת על ידי מערבולת פוספוליפידים המופעלת על ידי איתות TGF-β1/Smad בשלב המוקדם של היווצרות אבנים בכליות

שיו גואו גאן1 · האי טאו שו1 · זי האו וואנג

לעוד information:ali.ma@wecistanche.com

מבוא

אורוליתיאזיס היא אחת המחלות הנפוצות ביותר המשפיעות על בני אדם, והיא קשורה לסיבוכים אורולוגיים מרובים [1]. על פי הדיווחים, סידן אוקסלט(CaOx) פוגע בתאי צינורית כלייתיים בתרבית, ולאחר מכן פוספטידיל-סרין (PS) של קרום התא מתהפך מהשכבה הפנימית לשכבה החיצונית במבחנה כדי למלא תפקידים חשובים באבן כליההיווצרות [2]. ממצאים דומים דווחו במחקרים שונים [3-6] שנערכו ברמת התא. עם זאת, המנגנון העומד בבסיס החצנת PS בתאי צינוריות הכליה הנגרמת על ידי נזק בתיווך CaOx עדיין אינו ברור. מחקרים קודמים הראו שריכוז גבוה של סידן אוקסלט מוביל לייצור יתר של מיני חמצן תגובתי(ROS)[7], מה שתורם לאחר מכן להחצנת PS בתאי צינוריות הכליה כדי לגרום לנוקלאציה ולצמיחה של גבישי CaOx [8]. חמצון ROS ושומנים מפעילים מאוד את הפוספוליפידים(PLSCR)[9], בעוד שחשיפה לנבלות ROS, כגון גלוטתיון, קו-אנזים Q10 או אידבנון (הומולוג סינתטי של קו-אנזים Q10), מפחיתה את ההפעלה של PLSCR במחלת כליות פוליציסטית [10]. PLSCR, המעוגן לקרום התא[11], מתפקד כאחד משלושת האנזימים ההופכים פוספוליפידים המסוגלים לזרז את התנועה הדו-כיוונית המהירה של PS משני צידי הממברנה לאורך שיפוע ריכוז [12]. בתנאים פיזיולוגיים, קרום התא נמצא במצב אסימטרי, ול-PLSCR אין השפעה על הממברנה [13]. עם זאת, בעקבות פגיעה בתאים אאוקריוטים, PLSCR מופעל ומעביר PS מהשכבה הפנימית לשכבה החיצונית[14,15]. בנוסף, ביטוי יתר של תאי השחלות של אוגרים סיניים PLSCRin K1 מעורר על פי הדיווחים החצנת PS, ומשפר את התנועה החוצה של PS אל פני השטח של התא במהלך אפופטוזיס [16]. לכן, שיערנו כי PLSCR מעורב גם בהחצנת PS בקרום תאי צינורית הכליה באמצעות הפעלה של ROS.

מנגנון מולקולרי פוטנציאלי של ייצור ROS המושרה על ידי אוקסלט מתרחש באמצעות אינדוקציה של איתות TGF-β1/Smad, שעשוי למלא תפקיד בייצור ROS [17,18]. ואכן, על פי דיווחים, איתות TGF-β1/Smad מעורב בשלל מחלות כליות, כגון גלומרולונפריטיס, פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי ונפרוליתיאזיס[19]. יתר על כן, תאים חד-גרעיניים המטופלים ב-TGF-β1 מציגים PSexternalization בקרום התא על-ידי גרימת היפוך-פינג של PS מהשכבה הפנימית לשכבה החיצונית [20]. עם זאת, למיטב ידיעתנו, הקשר בין איתות TGF-β1/Smad לבין PSeversion בקרום תאי צינורית הכליה עדיין אינו ידוע. שיערנו כי TGF-β1 משתתף ב- PS eversion בקרום תאי צינורית הכליה על ידי הפעלת PLSCR בשלב המוקדם של החולדהאבן כליההיווצרות בתיווך ROS.

לכן, חקרנו אם איתות TGF-β1/Smad מגרה החצנת PS באמצעות הפעלת ROS והאם TGF מפעיל את PLSCR בקרום תאי צינורית הכליה בשלב המוקדם שלאבן כליההתפתחות במבחנה וב-in vivo, ובכך מניחה בסיס תיאורטי לאטיולוגיה שלאבן כליההיווצרות.

לחץ אל Cistanche DHT למחלת כליות

חומרים ושיטות

מודל חולדה של היווצרות אבנים בכליות CaOx בשלב מוקדם

60 חולדות Wistar זכרות נקיות בנות 3 חודשים במשקל 200±20 גרם סופקו על ידי המרכז הניסיוני לחיות של האוניברסיטה הרפואית חרבין ושוכנו בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס±2 מעלות צלזיוס) ולחות של 50-70%. לאחר 3 ימים של רבייה מסתגלת, הם חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות (20 חולדות/קבוצה) – שליטה,אבן כליהואבן כליה+SB431542(מעכב מסלול איתות TGF-β1/Smad).

אבן כליההיווצרות מתחילה כשינוי פתולוגי מוקדם לאחר פגיעה בתאי צינוריות הכליה [21,22]. כדי לחקור את תהליך הפציעה הזה, מודל חולדה של שלב מוקדםאבן כליההיווצרות הוקמה, שכן גישה סטנדרטית טרם דווחה. כדי לבחון את השינויים המוקדמים לאחר פגיעה בתאי צינוריות הכליה, יישמנו את השיטה שעליה דיווחה ליט אל.[23]. בקצרה, החולדות בקבוצת הביקורת קיבלו 2 מ"ל של מים מזוקקים מדי יום באמצעות גאבאג' דרך הפה, ואילו החולדות באבן כליההקבוצה ניתנה 2 מ"ל של תמיסת אתילן גליקול של 1% ו-1% תמיסת NHCl מדי יום באמצעות גאבאג' אוראלי. החולדות באבן כליהלקבוצת +SB431542 הוזרק באופן תוך-צפקי SB431542 ממס משותף(5 מ"ג/ק"ג, S1067; סלקצ'ם, שנחאי, סין)כל 7 ימים [24]. מזון ומים סופקו עד ליביטום. ביום ה-14, החולדות הומתו על ידי מנת יתר של הרדמה (נתרן פנטוברביטלי, 200 מ"ג/ק"ג, באמצעות הזרקה תוך-צפקית) והכליות שלהן נכרתו. הכליות השמאליות השתמרו מיד בחנקן נוזלי לצורך גילוי החלבון שלאחר מכן. הכליות הימניות היו קבועות, ולאחר מכן התייבשו והוטמעו בשעווה פרפין. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן. הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בניסויים בבעלי חיים של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית חרבין (מספר אישור: 2020005, חרבין, סין).

היווצרות גבישים ברקמת הכליה

דגימות הרקמה הוכתמו בשיטת Pizzolato [23] וגבישי CaOx נצפו תחת מיקרוסקופ אופטי של אור מקוטב (Sinico Optical Instrument Co., שנזן, סין). אזורים חיוביים לפיזולאטו נמדדו והתבטאו כגילי פרמיל של שטח הרקמה הכולל של חתכים באמצעות ImageJ 1.49v (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב).

זיהוי PS בקרום התא הצינורי הכליתי in vivo על ידי ציטומטריית זרימה

החשיפה ל-PS של תאי אפיתל כלייתיים הוערכה באמצעות בדיקת צביעת איזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) עם התווית Annexin V, כפי שתואר קודם לכן [2]. התאים נצפו (בכל קבוצה) תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (אולימפוס, טוקיו, יפן). כמות החצנת PS נקבעה כאחוז התאים החיוביים של Annexin V. פלואורסצנציה של נספחין V של הדגימות נמדדה באמצעות ציטומטר זרימה (488 ננומטר עירור/פליטה של 530 ננומטר; בקמן קולטר, בריה, קליפורניה, ארה"ב).

מדידת רמות TGF-β1 ו-Smad7 בקרום התא הצינורי הכלייתי על ידי כתם מערבי

לאחר התאוששות דגימות הרקמה הקפואה, החלבון הופק באמצעות ערכת מיצוי חלבון הממברנה הטבעית ProteoExtract(M-PEK)(M-PEK)(MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA), וריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת בדיקה של חלבון Bio-Rad (הרקולס, קליפורניה, ארה"ב) על פי הוראות היצרן. לאחר מכן, 40ug של חלבון הועמס על ג'ל 8% SDS-polyacrylamide (ערימת ג'ל 100 V, פתרון ג'ל 200 V) במשך שעה אחת בזרם קבוע אלקטרודה של 300mA. החלבונים בג'ל הועברו על קרום ניטרוצלולוז (Kexing Co., בייג'ינג, סין), נחסמו למשך שעה אחת באבקת חלב רזה של 37°Cin 5%, והודגמו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °CC עם כבשים נגד חולדה TGFβ1 (ab208466; Abcam, קיימברידג', בריטניה) ו-Smad7 (66,478; נוגדנים של פרוטאינטק, ווהאן, סין [25]. נוסף נוגדן משני נגד כבשים(1:400) שכותרתו "ארנב נגד כבשים"; Nakasugi Jinqiao ושות', בייג'ינג, סין)ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. האות זוהה באמצעות ריאגנט chemiluminescence משופר (Abcam). פסים חיוביים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח צפיפות אופטית של ג'ל 4.0 Gel-Pro, ונמדדה הצפיפות האופטית המצטברת (ערך IOD), כאשר ערך ה-R מייצג את תכולת החלבון היחסית באופן הבא: ערך R=ייחוס IOD של PLSCR(יעד)/ערך IOD ייחוס של GAPDH (חלבון ייחוס).

תרבית תאים והפרעה לרנ"א

קו תאי אפיתל כלייתי (תאי MDCK, CCL34, מעברים 53-90; ATCC, Manassas, VA, ארה"ב) גודל במדיום הנשר המהונדס של דולבקו בתוספת אנטיביוטיקה (100 פניצילין U/mL, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין; לייף טכנולוגיות, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) ו-10% סרום בקר עוברי (Life Technologies Co.) ב 37°Cin a 5% CO, אטמוספירה ותת-תרבות עם 0.25% טריפסין ו 1 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (Life Technologies Co., CA, ארה"ב). התאים טופלו ב-CaOx (0.5 mM; Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) למשך שעתיים ועם 0.5 mM CaOx ו-100 מיקרוגרם/מ"ל המנטרלים נוגדן נגד TGF-β1 (מערכות מו"פ, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב) למשך שעתיים. כל הניסויים בוצעו במשולש.

כדי לקבוע את התפקיד של ה-PLSCRin PS eversion, תאי אפיתל צינוריים כלייתיים עברו טרנספקציה עם PLSCR siRNA [26]. siRNA תוכנן וסונתז על ידי המערכת הביולוגית הכללית של אנחווי (אנחווי, סין; ראו טבלה 1). LipofectamineTM 2000 (סאנשיין ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, שנגחאי, סין) שימש עבור transfection על פי הוראות היצרן. לאחר 24 שעות של טרנספקציה, התאים עוכלו עם טריפסין, צנטריפוגה ב 1000× גרם במשך 5 דקות, נשטפו פעמיים עם PBS וצנטריפוגה שוב. הסופרנטנט הושלך, והכדור הושעה ב-PBS כדי ליצור תרחיף של תא יחיד בצפיפות של 1×10°10°cell/mL. השיעור החיובי של ביטוי FAM (carboxyfluorescein) היה 93% ±5% כפי שנקבע על ידי ציטומטריה של זרימה. כדי להעריך עוד יותר את הקשר בין TGFβ1 ל-PLSCR, התאים טופלו ב-CaOx של 0.5 mM או ב-10ng/mL TGF-β1 למשך שעתיים ולאחר מכן הועברו ל-PLSCR siRNA.

מדידת רמת PLSCR בקרום תאי צינוריות הכליה על ידי כתם מערבי

החלבון הופק באמצעות ערכת מיצוי חלבוני ממברנה טבעית ProteoExtract (Chemical Book Co., בייג'ינג, סין), וריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad (Noble-Ryder Co., בייג'ינג, סין). לאחר מכן, 40 מ"ג של חלבון הועמסו על ג'ל 8% SDS-polyacrylamide (ערימת ג'ל 100 V, פתרון ג'ל 200 V) במשך שעה אחת בזרם קבוע של 300 mA. חלבונים בג'ל הועברו על קרום ניטרוצלולוז (Kexing Co., שנזן, סין) ונחסמו עם 5% חלב רזה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ודגירו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן חד שבטי PLSCR נגד חולדות כבשים(1:200, PAB781HuO1; אבקאם, גואנגג'ואו, סין). לאחר מכן נוסף נוגדן משני נגד כבשים של ארנב עם תווית של חזרת(1:400) והתערובת דוגרה בטמפרטורה של 37°CC למשך שעה. לאחר שטיפת הממברנה, האות זוהה עם מגיב chemiluminescence משופר (Abcam, גואנג-ג'ואו, סין). פסים חיוביים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח צפיפות אופטית Gel-Pro 4.0gel, וערך ה- IOD נמדד, כאשר ערך ה- R מייצג את תכולת החלבון היחסית כמתואר לעיל.

טבלה 1 רצפי siRNA עבור PLSCR

מדידת התפלגות פוספטידיל-סרין ממברנה

כמות ה-PS של קרום התא נקבעה באמצעות שיטת מרווה פלואורסצנטית שתוארה על ידי Kim et al.[27] וצוות המחקר שלנו [2], עם nitrobenzene-2-oxa-1,3-diazole(NBD, שנגחאי, סין) כגשושית הפלואורסצנטית. לאחר תיוג ה-PS בשכבה החיצונית של קרום התא עם NBD, התאים עברו תרבית ב-PBS המכיל 5 mM diisopropylfluorophosphate. לאחר מכן נוספה PBS המכילה סידן אוקסלט(1.0 mM) והתאים דוגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כמות שווה של השעיית תאים שוחררה כל 10 דקות, ועוצמת הפלואורסצנציה נרשמה באמצעות ספקטרופלומטר RF-5000 (שימאדזו, קיוטו, יפן). ההגדרות של הספקטרופלואורומטר היו כדלקמן: רוחב חריץ של 10 ננומטר עבור אורך גל פליטה של 530 ננומטר; ורוחב חריץ של 5 ננומטר עבור אורך גל עירור של 470 ננומטר. לאחר מכן, הערך הפלואורסצנטי הממוצע (FT) נרשם במהלך שנות ה -50. עוצמת הפלואורסצנציה המופחתת הממוצעת (FD) נרשמה גם לאחר שימוש בתמיסת דיתיוניט כדי להרוות את הפלואורסצנציה NBD מהשכבה החיצונית של התא. לאחר מכן נוספו 1%(w/v)טריטון X-100 כדי לחלחל את קרום התא. לאחר מכן הודבקה הפלואורסצנציה NBD מהשכבה הפנימית של קרום התא, ועוצמת הפלואורסצנציה (FO) נרשמה. אחוז ה-NBD-PS באונות הפנימיות חושב מאוחר יותר באמצעות המשוואה הבאה: גיל האחוזים של NBD-PS=100× המופנם[(FD-FO)/(FT-FO)].

אחוז החצנת PS נקבע על פי העיקרון ששימש למדידת הפנמה של NBD-PS. אחוז ה-NBD-PS באונות החיצוניות חושב גם הוא באמצעות המשוואה הבאה: אחוז ה-NBD-PS באונות חיצוניות=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

ניתוח סטטיסטי

משתנים רציפים מבוטאים כסטייה ממוצעת±סטנדרדית. נעשה שימוש במבחן סכום דרגה זוגי שאינו פרמטרי, מבחן t ומבחן צ'י-ריבועי. כל הניתוחים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS 19.0 (SPSS, Inc., שיקגו, אילינוי, ארה"ב). תוצאות עם P<0.05 were="" considered="" statistically="">

תוצאות

איתות TGF-β1/Smad מגרה החצנת PS in vivo

היווצרות גבישים ברקמת הכליה של מודל החולדה

כדי להקים מודל חולדה של שלב מוקדםאבן כליההיווצרות, אתילן גליקול ו אמוניום כלוריד ניתנו לקיבה של חולדות במשך שבועיים, ולאחר מכן כל חתך כליות נבדק עם מיקרוסקופ דיגיטלי. בדגימות של קבוצת הביקורת נצפו מבנים צינוריים כלייתיים רגילים ללא היווצרות גבישים ביום ה-14 (איור 1A). כאשר רקמת הכליה מתוךאבן כליההקבוצה נצפתה על ידי מיקרוסקופיה, צינוריות הכליה נראו מורחבות עם מיקרוקריסטלים גלויים; הצטברות מזדמנת של גבישי CaOx נצפתה בכמה צינוריות כלייתיות, מה שמעיד על התבססות מוצלחת של מודל חולדה של שלב מוקדםאבן כליההיווצרות ויצירת פגיעה בתאי צינורית הכליה.

נוכחות של PS בקרום התא הצינורי הכליתי

Annexin V-FITC, מולקולה פלואורסצנטית הנקשרת ל-PS על פני התא, נמצאת בשימוש נרחב כדי לזהות חלוקה מחדש של PS. במחקר שלנו, תאי MDCK בבקרה הרגילה,אבן כליהואבן כליהקבוצות +SB431542 נצפו תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (איור 1B). קצב ה-PS-eversion עלה באבן כליהקבוצה בהשוואה לזו שבקבוצת הביקורת(P)<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">אבן כליהקבוצת +SB431542 הראתה רמה בסיסית נמוכה יותר של החצנת PS מאשר אלה שבכליהאבןקבוצה (P<0.05, fig.="" 1c,="">

מדידה של רמות TGF-β1 ו-Smad7

רמת TGF-β1 באבן כליההקבוצה כומתה על ידי כתם מערבי. כתם מערבי טיפוסי מוצג באיור 2A יחד עם הניתוח הצפיפותי של רמת TGF-β1. הערכים נורמלו לאלה של הבקרה והתבטאו כיחס בין TGF-β1 לטובולין. התוספת של אתילן גליקול ו-NH Cl העלתה באופן משמעותי את רמת ה-TGF-β1 והפחיתה את רמת ה-Smad7 בהשוואה לאלו שבתאי הבקרה (איור 2A); עם זאת, הטיפול ב-SB431542+אתילן גליקול ו-NH נקרא לירידה משמעותית ברמת TGF-β1 והגביר את רמת Smad7 בהשוואה לאלה שטופלו באתילן גליקול ו-NH, Cl.

TGF מפעיל את פעילות PLSCR בקרום תאי צינורית הכליה במבחנה

PLSCR

רמת PLSCR הוערכה על ידי כתם מערבי. התאים טופלו ב-CaOx במשך 2 שעות. רמת ה-PLSCR הייתה זניחה בתאי הביקורת אך עלתה משמעותית בקבוצת CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

פגיעה בתנועה פנימה של NBD-PS

קבענו את התנועות הפנימיות והחיצוניות של PS בקרום תאי האפיתל הצינוריים הכלייתיים כדי להעריך את פעילות ה-PLSCR. כדי להעריך אם PLSCR משפיע על תנועת PS מהעלון החיצוני אל העלון הפנימי של קרום הפלזמה, שילבנו PS (NBD-PS) המסומן באופן פלואורסצנטי בעלון החיצוני של קרום הפלזמה ועקבנו אחר הפנמתו (איור 3). כמות ה-NBD-PS שהופנמנה על ידי תאי MDCK בקבוצות הבקרה וה-CaOx הייתה כ-46.2% ו-17.8%, בהתאמה. לפיכך, קצב הפנמה של PS בתאי קבוצת CaOx היה נמוך משמעותית מזה שבתאי קבוצת הביקורת (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

איור 1 היווצרות גבישים והחצנת PS נצפו בקבוצות הבקרה, אבן הכליה ואבן הכליה+SB431542.

(א) היווצרות גבישים ברקמת הכליה ביום ה-14; חץ מציין מבנים מיקרו-קריסטליים. (B) תאי MDCK נצפו על ידי מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית.

(C) חלקות ציטומטריות של זרימה של קצב נצחים. (ד) שיעור הנצחה (%). משולש מציין P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">אבן כליהקבוצה

תנועה משופרת של NBD-PS כלפי חוץ

כדי לקבוע אם הובלת PS החוצה מושפעת מאוקסלט, תאי MDCK סומנו באופן תוך-תאי ב-NBD-PS, ומידת תנועתם לעלון ה-examples-mic נקבעה. מדיום הדגירה הכיל אלבומין בסרום בקר (1% w/v), אשר חילץ במהירות NBD-PS בעל ביטוי פני השטח. כ-34.5% מה-NBD-PS נדדו אל העלון החיצוני בתאי הביקורת, בעוד שקצב העברת ה-PS החוצה בתאי קבוצת CaOx הוגדל ל-75.3% בהשוואה לזה של סך ה-NBD-PS המסומן הפנימי, שהיה גדול משמעותית מזה שבתאי קבוצת הביקורת (P)<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

איור 2 TGF-β1/Smad ביטוי בקבוצות הביקורת, אבן הכליה ואבן הכליה+SB431542, וביטוי PLSCR בקרום תאי צינורית הכליה.

(א) TGF-β1/Smad expression. (ב) רמות יחסיות של פוספוליפידים קשקשים (PLSCR) וכתם מייצג עם ביטוי מנורמל לזה של GAPDH. P<>

משולש מציין P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

לחצו כאן לחלק ב'.