איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

שיפור ייצור גליקוזידים של פנילאתנואידים על ידי מעורר פטרייתי בתרבית תרחיף תאים של Cistanche deserticola

קואי-טאו לו¹,∗ & Xing-guo Mei²

מילות מפתח Cistanche deserticola, מעורר פטריות,פנילתנואיד גליקוזיד, תרבית תאי צמחים

תַקצִיר
כאשר, ביום ה-15 של הצמיחה, מעלה מFusarium solaniהוספה ב-40 מ"ג ליטר^-1 לCistanche deserticolaתרביות תרחיף תאים, התוכן של אכינאקוסיד, אקטאוזיד וסך הכלפנילתנואידים גליקוזידים(PeGs) בתאים מתורבתים גדלו כולם במהלך 27 הימים הבאים בלמעלה מ-100 אחוז ל-15 מ"ג גרם^-1משקל יבש, 9 מ"ג גרם-1 משקל יבש ו-57 מ"ג גרם^-1 wt יבש, בהתאמה. הביומסה הסופית (1.3 מ"ג משקל יבש מ"ל^-1) לא הושפע.

Cistanche deserticola

מבוא

Cistanche deserticolaאִמָא. (Orobanchaceae), עשב יליד סין נמצא בשימוש נרחב ברפואה המסורתית לטיפולים שונים כולל שימוש כחומר הרגעה או כמגביר תגובה חיסונית (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).פנילתנואידים גליקוזידים(PeGs) הם המטבוליטים הביו-אקטיביים העיקריים בCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) והם מורכבים ממרכיבים רבים כגון echinacoside, acteoside, cisacteoside, isoacteoside, 2-acetylacteoside, cistanoside A ואוסמאנטוסיד B (Wang et al. 2000). עם הביקוש הגובר למוצרים אלה והירידה המהירה בCistanche deserticolaצמחים, תרבית תאים תהיה אמצעי ייצור חלופי אטרקטיבי. מעוררים רבים (במיוחד מעוררי פטריות) יכולים לשפר את ייצור המטבוליטים בתרבית תאי צמחים (Wang et al. 2001). לי וחב'. (1998) מצא כי מעורר פטרייתי של Fusarium solani מבודד ממערכות השורשים של שתיהןCistanche deserticolaוהמארח שלו, Halaxylon ammodendron, יכול לשפר את תכולת חומצות האמינו בקאלי שלCistanche deserticolaאבל השינויים בתוכן ה-PeGs בקו הקאלוס הזה לא הוזכרו במחקר שלהם. במאמר זה, נחקרו ההשפעות של מעורר מ-F. solani על הביוסינתזה של סך ה-PeG ושני ה-PeGs הביו-אקטיביים (echinacoside ו-acteoside), ועל השינויים של צמיחת תאים בתרבית ההשעיה שלCistanche deserticola.

חומרים ושיטות

תרביות תאי צמחים
הקאלוס הושרה מסולמות שלCistanche deserticolaונשמר על מדיום B5 של גמבורג (1968) בתוספת 0.5 מ"ג אינדול-3-חומצה אצטית l^-1, 2 מ"ג קינטין ל^-1,ו-1 גרם הידרוליזט של קזאין l^-1. ה-pH הותאם ל-6 לפני העיקור. כל הניסויים בוצעו בצלוחיות שייק של 250 מ"ל, שכל אחת מהן מכילה 100 מ"ל מדיום על שייקר סיבובי (120 סל"ד ו-25 מעלות) בחושך. החיסון היה כ-100 גרם טרי wt l^-1.

תוכן יעיל של cistanche deserticola--פנילתנואיד גליקוזיד

הכנת מעורר פטריות

הפרדת זן הפטרייה, Fusarium solani, והכנת מעורר פטריות בוצעו כמתואר קודם (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). כמויות שונות (שוות ערך לפחמימות) של מעורר פטרייתי נוספו לתרביות בקבוק הניעור ביום ה-15 (תקופת התרבית הכוללת הייתה 42 ד').

בדיקת הצטברות ביומסה וכדאיות
תאים מבקבוק ניעור נשטפו במים מזוקקים ויובשו בהקפאה למשקל קבוע. כך נקבעה המשקל היבש. כדאיות התא (אחוז תאים חיים באוכלוסיית תאים) נקבעה על ידי הפחתה של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (Towill & Mazur 1975).

פנילתנואיד גליקוזידשֶׁלcistanche deserticola

קביעת תכולת האכינאקוסיד, אקטאוזיד וטוטאלפנילתנואידים גליקוזידים(PeGs)
מיצוי של PeGs בוצע על פי השיטה של ​​Du & Liu (1993). מוקפא בייבושCistanche deserticolaתאים חולצו עם 70 אחוז (v/v) אתנול. חלק האתנול רוכז, הוסר שומנים באתיל אצטט רווי מים, ולאחר מכן הושטף עם n-בוטנול רווי במים. חלק ה-n-בוטנול רוכז, מומס במים, הוטען בעמודת שרף מקרופורית (AB-8, תוצר כימי של אוניברסיטת ננקאי, טיאנג'ין, סין), ונפלט עם מים ומתנול, ברציפות. חלק מתנול נאסף ותכולת ה-PeGs הכוללת נקבעה על ידי שימוש באכינאקוסיד כסטנדרט ב-334 ננומטר. Echinacoside ו-acteoside נקבעו באמצעות עמודת Nova Pak C18 (250 × 4.6 מ"מ) במערכת HPLC (מים) עם גלאי UV (334 ננומטר).

תוצאות

ההשפעה של מעורר פטריות על הצטברות ביומסה ועל ביוסינתזה של PeGs הכוללת השפעות של מעורר פטריות על ביומסה של התא ועל הצטברות PeGs הכוללת הייתה תלויה במינון שנוסף (מקבילות לפחמימות). כפי שמוצג באיור 1, מינונים נמוכים יותר של elicitor היו טובים ל-wt היבש שלCistanche deserticolaתאים. השיא היה עם המוציא ב-20 מ"ג ליטר^-1(נותן 1.76 מ"ג משקל יבש מ"ל^-1).
הצטברות PeGs הכוללת הוגברה באופן משמעותי על ידי מעורר הפטרייתי ב-20 מ"ג ליטר^-1ו-80 מ"ג ליטר^-1. Elicitor ב-40 מ"ג ל-1 השיג את התשואה הגבוהה ביותר (57 מ"ג גרם^-1), שהיה מעל פי שניים מזה שהושג בתרבות השליטה הלא-מעוררת. הניסוי הנוסף השתמש בגורם הפטרייתי ב-40 mg1^-1.

איור 1. משקל תאים יבשים והצטברות PeGs הכוללת בתרבית תאי ההשעיה שלCistanche deserticolaבתגובה למינונים שונים של מעורר פטריות. מעורר פטריות נוסף למדיום ב-15. דגימות נלקחו לאחר 27 ד' נוספים. ▲, משקל תא יבש סופי; ◆, התוכן הכולל של PeG. ערכים הם אמצעים לתוצאות משולשות ופסי שגיאה מייצגים סטיות תקן.

מהלך הזמן של צמיחת תאים וביוסינתזה של PeGs
איור 2 מציג את מהלך הזמן של חיוניות התא וביוסינתזה של PeGs (echinacoside ו-acteoside) של תאי השעיה לאחר שתרביות הועברו ל-40 מ"ג ליטר.^-1מעורר פטריות ביום ה-15. ב-27 הימים שלאחר מכן של תרבית, אכינאקוסיד ואקטאוזיד, שני ה-PEG הביולוגיים העיקריים בCistanche deserticola, שניהם עלו במידה ניכרת. ביום ה-39 הושגו הצטברויות מקסימליות שניהם, והגיעו ל-14.7 מ"ג גרם^-1משקל יבש ו-8.9 מ"ג גרם^-1 wt יבש, בהתאמה. הבדל משמעותי בכדאיות התא בין התרבויות שטופלו ב-elicitor לבין הביקורת לא נצפה.

איור 2. כדאיות תאים וביוסינתזה של אכינאקוסיד ואקטאוזיד בתרבות תאי ההשעיה שלCistanche deserticolaלאחר טיפול ב-40 מ"ג ליטר^-1מעורר פטריות. מעורר פטרייתי התווסף לתווך ביום ה-15. ◇, בקרת אכינאקוסייד; ●, מטופל באקטאוזיד עם elicitor;○,

בקרת אקטאוזיד; ▲, תאים מטופלים עם elicitor; △ , בקרת כושר תאים. ערכים הם אמצעים לתוצאות משולשות ופסי שגיאה מייצגים סטיות תקן.

דִיוּן

רכיבים רבים שמקורם בפטריות (שברי דופן תאים, פוליסכרידים, אוליגוסכרידים, גליקופרוטאינים וכו') שימשו כמעוררי פטריות שונים בייצור מטבוליטים משני עם מיני תאי צמחים רבים. במאמר זה, ההומוגנט (המורכב בעיקר מפוליסכרידים) מזן פטריות Fusarium solani מבודד ממערכות שורשים שלCistanche deserticolaו- Halaxylon ammodendron הוכח כגורם יעיל לביוסינתזה של PeGs בתרבית תאים שלCistanche deserticola. השימוש במעורר זה כדי לעורר סינתזה של PeGs בתאים לא רק היה משמעותי אלא גם הוצג זמן קצר לאחר הגירוי. מסקנה זו הסכימה עם כמה מחקרים קודמים על תרבית תאי צמחים (Wang et al. 2001).

במחקר הקודם של Li et al. (1998), כאשר הוסף גורם פטרייתי מ-F. solani למצע התרבות, מחלת הקאלוס המושרה מזרעים שלCistanche deserticolaיכול להישאר בחיים בתת התרבות ארוכת הטווח שלאחר מכן, וניתן לשפר את ייצור האירידואידים. זה הצביע על כך שתאים מתורבתים יכולים לסנתז מטבוליטים משניים של עמידות למחלות כאשר הם מותקפים על ידי מיקרואורגניזמים. למרות שאירידואידים לא נקבעו בניסוי שלנו, הראינו שפוליסכרידים מ-F. solani יכולים לשמש כמעוררי פטריות יעילים בייצור של PeGs עםCistanche deserticolaתאים.

תוכן יעיל של cistanche deserticola--פנילתנואיד גליקוזיד

מתוך: 'שיפור שלפנילתנואידים גליקוזידיםייצור על ידי גורם פטרייתי בתרבית תרחיף תאים שלCistanche deserticola' מאת Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. נדפס בהולנד.

הפניות

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) מחקר על ההשפעות החזקות שלCistanche deserticolaMa., Cistanche Salsa (CA Mey) G. Beck. ו- Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. צ'יינה ג'יי צ'ין. מאטר. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) קביעתפנילתנואידים גליקוזידיםבCistanche deserticolaעל ידי ספקטרופוטומטריית שרף מקרוווזיקולרית. נאט. לְדַרבֵּן. מילון לְפַתֵחַ. 5:30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) דרישות תזונתיות של תרביות השעיה של תאי שורש סויה. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) מחקר של המרכיבים הכימיים וההשפעות הפרמקולוגיות שלCistanche deserticolaאִמָא. וסלסה Cistanche (CA Mey) G. Beck. סַנְטֵר. מסורת. עֵשֶׂב. סמים 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) השפעת המעורר של Fusarium solani על תכולת חומצות האמינו שלCistanche deserticolaיַבֶּלֶת. צ'יינה ג'יי נורת'ווסט פארם. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) מחקרים על הפחתת 2,3,5-triphenyltrazolium chloride כמבחן כדאיות לתרביות רקמות צמחיות. פחית. ג'יי בוט. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) שיפור הייצור וההפרשה של טקסול בתרבית תאי Taxus Chinensis על ידי העלאת פטריות וחידוש בינוני. יישום מיקרוביול. ביוטכנולוגיה. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) ניתוח שלפנילתנואיד גליקוזידבתמצית עשבי תיבול Cistanchis של LC/ESI- MS/MS. אקטה פארם. חטא. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) עיכוב של תחמוצת החנקן על ידי phenylethanoids במקרופאגים פעילים. יורו ג'יי פארם. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) השפעות של חומצה סליצילית על חמצון ממברנה-ליפידים הנגרמת על ידי פטריות וייצור Taxol בתרביות תרחיף תאים של Taxus Chinensis. פרוק. Biochem. 37: 477–482.