היפופרמיה בתיווך הפצידין משבשת את התגובות החיסוניות לחיסון וזיהום חלק 2

דִיוּן

ברזל ואימונומטבוליזם

היפופרמיה הנגרמת על ידי הפצידין היא מרכיב שמור היטב של התגובה החיסונית המולדת בבעלי חוליות.8 אנו מדגימים כי היפופרמיה עלולה לפגוע במספר היבטים של חסינות אדפטיבית אם היא מתרחשת במהלך תקופת התרחבות הלימפוציטים, עם פוטנציאל לעיכוב ארוך טווח לאחר מכן של זיכרון תאי T גם לאחר שהיפופרמיה חלפה. אנו מראים כי ויסות מתאים של ספיגת ברזל תאית הנשלט על ידי IRP1/2 חיוני לתפקודים של משפיענים של תאי T, ורכישת ברזל בתיווך TFRC נדרשת באופן מהותי לתגובות תאי B ו-T in vivo.

העלייה המדהימה בביטוי של TFRC על ידי תאי T מופעלים, גדלה בכמיליון עותקים של חלבון לתא תוך 24 שעות, יחד עם עליות ביבואני ברזל טרנסממברניים, מצביעים על התעצמות משמעותית במאמצים לרכוש ברזל ממקורות תאיים. למרות שהראינו שמחקרי חילוף חומרים חמצוני וסינתזת DNA הם שני תהליכים תלויי ברזל המעוכבים בתאי T על ידי זמינות נמוכה של ברזל, מסלולים תאיים רבים אחרים החשובים בביולוגיה של תאי T, כולל תכנות מחדש אפיגנטי וחישת היפוקסיה, דורשים גם ברזל ויש לחקור אותם.

יתר על כן, ביטוי CD25 מופחת ואי תחושת IL-2 עלולים לתרום לאיכות הירודה יותר של תאי CD8 T effektor/זיכרון שנצפו במחסור בברזל.27 מכיוון שהפעילות המטבולית המואצת של לימפוציטים פעילים רגישה במיוחד לזמינות הברזל, פיזיולוגית שינויים בריכוזי ברזל משפיעים מאוד על התגובות החיסוניות. לכן, ברזל עשוי להיחשב כחומר תזונה רלוונטי למושגים של חילוף חומרים אימונו.28

חסינות מתייחסת ליכולת של הגוף להתגונן מפני גורמים מזיקים שונים מהעולם החיצון. לחסינות טובה יש השפעה רבה על גוף האדם, כולל: 1. עמידות למחלות: חסינות יכולה לזהות ולחסל פתוגנים ולמנוע מגוף האדם להידבק במחלות. 2. לקדם החלמה: אם גוף האדם נדבק בפתוגנים, חסינות יכולה להאיץ את החלמת המחלה ולקדם החלמה גופנית. 3. אנטי אייג'ינג: תפקוד חיסוני לקוי יגרום להזדקנות הגוף, וחסינות טובה יכולה לעכב את הזדקנות הגוף. 4. מניעת סרטן: מערכת חיסון טובה יכולה להרוס תאים סרטניים ולמנוע סרטן. 5. הגן על בריאות הלב וכלי הדם: חסינות טובה יכולה להפחית את התרחשותן של מחלות לב וכלי דם.

אז אנחנו צריכים לשפר את החסינות שלנו בחיי היומיום. מחקרים מצאו כי Cistanche יכול לשפר חסינות. Cistanche מכיל גם כמה חומרים נוגדי חמצון, כמו פלבנואידים, ויטמין C וכו' שיכולים לסייע בהסרת רדיקלים חופשיים בגוף, להפחית נזקים חמצוניים לתאים, ובכך לשפר בעקיפין את החסינות. רכיבים תזונתיים שונים וחומרים פעילים של Cistanche יכולים לפעול בצורה סינרגטית, לשפר את חסינות הגוף, ויש להם תפקיד חיובי בקידום בריאות האדם.

לחץ על היתרונות הבריאותיים של cistanche

Hepcidin, Hypoferremia וזיהומים ויראליים

חלוקה מחדש של ברזל מבוקרת הפצידין מגינה מפני כמה זיהומים חיידקיים ומלריה בעכברים.29,30 בבני אדם, הפצידין והיפופרמיה מוגברים מתרחשים לאחר זיהומים ניסיוניים של נורוווירוס, טיפוס, ומלריה,31-33, ובמהלך ההופעה הראשונית של וירמיה ב-HIV{ {5}}תורמי דם נגועים.34 למרות שהיפופרמיה דלקתית יכולה להיות מועילה בהקשר של זיהומים עם אורגניזמים חד-תאיים שחייבים לרכוש ברזל מהמארח שלהם, חסרות עדויות לכך שברזל נמוך בסרום מגן בהקשר של זיהומים ויראליים. למעשה, בניסויים שלנו עם נגיף השפעת, הטלת היפופרמיה הנגרמת על ידי הפצידין הובילה לתגובה חיסונית אדפטיבית לקויה, התמדה ויראלית ומחלת ריאות חמורה, מה שמרמז כי ברזל נמוך בסרום עשוי לפעמים להיות תגובה לא מועילה לזיהום.

דיווחים אחרונים מראים כי היפופרמיה קיימת בחולי מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) בכניסה ליחידה לטיפול נמרץ (ICU).35 ברזל נמוך בסרום נמצא בקורלציה עם לימפפניה, וברזל נמוך במיוחד בסרום (~3 mmol/L). ) זיהו חולי COVID-19 עם היפוקסמיה נשימתית חמורה, ככל הנראה משנית לנזק ריאתי. היפופרמיה זו היא עמוקה יותר מאשר בקבוצות שדווחו בעבר של חולי טיפול נמרץ ללא COVID-19, כולל אלו עם אלח דם,36,37, מה שמצביע על כך שהיפופרמיה קיצונית עשויה להיות תכונה מסוימת של מחלת COVID-19 חמורה. IL-6 מניע את ביטוי ההפצידין, ותגובה דלקתית לא מאוזנת של IL-6 גבוה ו-IFN מסוג I וסוג III נמוך יחסית קשורה ל-COVID-19 חמור ולתוצאות גרועות.38,39 IL -6-היפופרמיה מונעת ותיווך בהפקידין עלולה לפגוע בתגובה החיסונית האנטי-ויראלית, ולתרום לחומרת הזיהום. Tocilizumab, המתמקד ב-IL-6R, נמצא בבדיקה כתרופה לטיפול ב-COVID-19 ועלול לנטרל היפופרמיה. ניטור ברזל בסרום בחולי COVID-19 עשוי להיות שימושי בהערכת חומרת המחלה והשפעות הטיפולים.

החלפת הברזל - השלכות לחסינות מסתגלת וחיסונים

איפיונים קודמים של תפקידו של ברזל בהקשר של זיהום מתארים את ניסיונותיו של הפתוגן לחטוף ברזל מאכסן, שהמארח מגן עליהם, מה שמוביל למירוץ חימוש אבולוציוני.40 אנו מציעים כי ההיפופרמיה של זיהום מייצגת גם פשרות עבור המארח, המנסה להפחית את הארסיות של פתוגנים פולשים על ידי מניעת ברזל, אך תוך כדי כך מונע ברזל מתגובות חיסוניות אדפטיביות.

התוצאה של פשרה זו תהיה תלויה באופי הזיהום הסיבתי, בגודל ובסוג התגובה הדלקתית ובמצב הברזל הבסיסי של המארח. בעולם, היפופרמיה נפוצה באוכלוסיות שבהן מחסור תזונתי נפוץ בברזל ושבהן יש גם עומס של זיהומים ודלקות המגבירים את ההפצידין, שילוב שכנראה משפיע על מאות מיליוני אנשים.4,10 כמו גם משפיע על תגובות ל זיהום ישירות, להיפופרמיה עשויות להיות השפעות עקיפות על הנטל הזיהומי על ידי פגיעה בתגובות לחיסון. היעילות והאימונוגניות של חלק מהחיסונים אינם אופטימליים באוכלוסיות שבהן מחסור בברזל אנדמי,41 ובאוכלוסיות כאלה, תמותה בילדות מזיהומים הניתנים למניעה באמצעות חיסון נותרה גבוהה באופן בלתי מתקבל על הדעת.42 כאן, אנו מדגימים במודל חזרזירים שמברזל מגביר את התגובות לחיסון בהקשר של מחסור טבעי בברזל.

לאחרונה, הראינו בניתוח רטרוספקטיבי של תינוקות קניה כי אנמיה קשורה לתגובות הומורליות לקויות לחיסונים מסוימים וכי תוספת ברזל עשויה לשפר את התגובה ההומורלית לחיסון נגד חצבת.43 עם זאת, ברזל יכול גם להגביר את הסיכון לזיהומים מסוימים ולרעה. להשפיע על מיקרוביוטה של ​​המעי.4 כתוצאה מכך, יש צורך בניסויים מותאמים אישית כדי לקבוע אם ברזל תזונתי ממוקד שניתן בזמן החיסונים משפר את יעילות החיסונים באוכלוסיות עם מחסור בברזל, כולל ילדים וקשישים.

עלייה בהפקדין והיפופרמיה בחולי IRIDA עם מוטציות ב-TMPRSS6 עשויות להיקשר לחסינות הומורלית לקויה, לפחות נגד פתוגנים מסוימים. הפצידין והיפופרמיה גבוהים מתמשכים הם גם מאפיינים של הפרעות דלקתיות כרוניות לא זיהומיות כגון מחלת כליות כרונית,9 ודלקת ומחסור בברזל נצפים בסוגי סרטן.44 חסינות הסתגלותית באוכלוסיות ובמצבים אלו עשויה להיפגע על ידי היפופרמיה. יש לציין, מניפולציה תרופתית או גנטית של פעילות הפצידין, שנועדה כהתערבות טיפולית להפרעות הקשורות לברזל, מפותחת יחסית.45 לכן, הפצידין הוא כבר יעד פוטנציאלי נגיש וניתן לחקור אותו כאופן לשליטה בתגובות החיסון במספר רב של תגובות חיסון. הקשרים.

מגבלות הלימוד

בעוד שהמחקר שלנו מצא שהגבלת ברזל פוגעת בחילוף החומרים האירובי של תאי T כפי שהוערכו על ידי צריכת חמצן ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, גישות רחבות יותר ללא השערות יכולות לספק הערכה הוליסטית יותר של המנגנון שבאמצעותו הגבלת זמינות הברזל משבשת את תפקוד תאי T. גם התגובות של תאי T וגם תאי B נפגעות על ידי מחסור בברזל בסרום in vivo, אך לא חקרנו כיצד הפיזיולוגיה של תאי B מבודדים מוטרדת על ידי מחסור בברזל או כיצד התמיינות תאי T מושפעת מברזל. יתר על כן, לא שאלנו באיזו מידה הפגיעה בזיכרון תאי CD8 T על ידי מחסור בברזל משתרעת על זיכרון תאי CD4 ו-B וכיצד תצפיות אלו יכולות להשפיע על תגובות לחיסונים והגנה מפני זיהום.

סיכום

מצאנו שהיפופרמיה הנגרמת על ידי hepcidin פוגעת בתגובות ראשוניות וזיכרון לחיסון, וחשפנו ביקוש עמוק של תאי T מופעלים לברזל בתיווך ברזל לפחות בחלקו על ידי IRP1/2 ו-TFRC. הפצידין גבוה יכול לעכב תגובות חיסוניות אדפטיביות לפתוגנים, בעוד שעל רקע של ברזל נמוך בסרום, ברזל משלים יכול לשפר את התגובות החיסוניות. תוצאות אלו מצביעות על כך שברזל בסרום, המוסדר על ידי הפצידין, הוא נקודת בקרה חשובה ואפשרית למטרות לחסינות.

שיטות כוכב פלוס

שיטות מפורטות מסופקות בגרסה המקוונת של מאמר זה וכוללות את הדברים הבאים:

תודות

המחברים מודים לצוות המחלקה לשירותים ביו-רפואיים, אוניברסיטת אוקספורד לגידול בעלי חיים, אלירזה מורובט (ביוכימיה קלינית, NHS Foundation Trust של אוניברסיטת אוקספורד) על הסיוע במדידות ביוכימיות, דיוויד פטינסון (מכון ג'נר, אוניברסיטת אוקספורד) ומעבדות ביובסט , אדינבורו, לעזרה עם ELISAs, ומתקן Weatherall Institute of Molecular Medicine flow cytometry וחברים במעבדת Cantrell, University of Dundee, לדיונים מועילים רבים.

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר רפואי בבריטניה (מימון ליבה של יחידת האימונולוגיה האנושית של MRC ל-HD, פרס מס' MC_UU_12010/10), ומלגת כריסטופר וולש ומלגת EMBO לטווח קצר ל JNFSJ דרייפר הוא חוקר ג'נר, עמית בפרס המחקר של מכון ליסטר ועמית בכיר ב-Welcome Trust (106917/Z/15/Z).

אנו מודים למכון ג'נר, אוניברסיטת אוקספורד ולמתקן ליבת וקטור ויראלי על הייצור של חיסונים ויראליים רקומביננטיים. העבודה שנערכה ב-i3S נתמכה על ידי Norte 2020 Portugal Regional Operational Program (מענק מס' Norte-01-0145- FEDER-000012); המחברים גם מכירים בתמיכה של פלטפורמת i3S Scientific Platform HEMS, חברה בתשתית הלאומית PPBI-Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). OB ממומן על ידי מלגת Sir Henry Wellcome (105654/Z/14/Z). TKT מומנה על ידי קרן הצדקה Townsend-Jeantet (מספר צדקה מס' 1011770). MS ו-UG נתמכו על ידי יחידת האימונולוגיה האנושית של MRC. מימון הליבה ל-VCBK ממומן על ידי מענק מימון יכולות מחקר NIHR ממרכז המחקר הביו-רפואי של אוקספורד. SJ Dunachie הוא חוקר ג'נר וממומן על ידי קרן פלמינג במחלקת הבריאות והרווחה של בריטניה. MDF ו-DRC נתמכים על ידי פרופסור S. Burt Wolbach, בית הספר לרפואה של הרווארד. SKW נתמכה על ידי תוכנית הדוקטורט של Wellcome Trust Infection, Immunology & Translational Medicine (מענק מס' 108869/Z/15/Z). BG קיבלה מענקים מה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (מענק מס' GA2075/3-1 ו-GA2075/5-1). MA מומנה על ידי סטודנטים למחקר בינלאומי של אוניברסיטת רידינג. AS נתמכת כעת על ידי מלגת מחקר דוקטורט של NIHR (NIHR-DRF-2017-10-094). מחקר זה מוקדש למריה דה סוזה ול-Vincenzo Cerundolo.

תרומות מחבר

תפיסה ועיצוב של עבודה, JNF, TKT, MA, TLD, AEA, ARMT, BG, MCL, ו-HD רכישה וניתוח נתונים, JNF, TKT, MA, AS, SKW, MB, NS, KW, BK, GS, DRC, TLD, JML, AEA, JA, PJL, AEP, DA, MT, CN, MS, UG, FRMvdK, ARMT, BG, MDF, MCL ו-HD איסוף, פנוטייפ וגנוטייפ של חולים עם חוסר ברזל, MDF ו פרשנות DRC של נתונים, JNF, NS, TLD, OB, SCA, SJ Dunachie, MZ, FRMvdK, VC, SJ Draper, ARMT, BG, MDF, MCL ו-HD Writing, JNF ו-HD

הצהרת אינטרסים

HD ישב במועצה המייעצת של קימאב, קיבל מימון מחקר מפייזר ומחברת התרופות לה ג'ולה, וקיבל אות הוקרה מ-Pharmacosmos ו-Vifor. המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הפניות

1. Phan, AT, Goldrath, AW, and Glass, CK (2017). תיאום מטבולי ואפיגנטי של חסינות תאי T ומקרופאג. חסינות 46, 714–729.

2. Andreini, C., Putignano, V., Rosato, A., and Banci, L. (2018). פרוטאום הברזל האנושי. Metallomics 10, 1223–1231.

3. Jabara, HH, Boyden, SE, Chou, J., Ramesh, N., Massaad, MJ, Benson, H., Bainter, W., Fraulino, D., Rahimov, F., Sieff, C., et אל. (2016). מוטציית missense ב-TFRC, המקודדת לרצפטור טרנספרין 1, גורמת לכשל חיסוני משולב. נאט. ג'נט. 48, 74–78.

4. Pasricha, SR, Armitage, AE, Prentice, AM, and Drakesmith, H. (2018). הפחתת אנמיה במדינות בעלות הכנסה נמוכה: שליטה בזיהום חיונית. BMJ 362, k3165.

5. Muckenthaler, MU, Rivella, S., Hentze, MW, and Galy, B. (2017). שטיח אדום למטבוליזם של ברזל. תא 168, 344–361.

6. Nemeth, E., Tuttle, MS, Powelson, J., Vaughn, MB, Donovan, A., Ward, DM, Ganz, T., and Kaplan, J. (2004). Hepcidin מווסת את פליטת הברזל הסלולרית על ידי קשירה לפרופורטין והשראת הפנמתו. מדע 306, 2090–2093.

7. Lim, PJ, Duarte, TL, Arezes, J., GarciaSantos, D., Hamdi, A., Pasricha, SR, Armitage, AE, Mehta, H., Wideman, S., Santos, AG, et al. (2019). Nrf2 שולט בהומאוסטזיס של ברזל בהמוכרומטוזיס ובתלסמיה באמצעות Bmp6 והפצידין. נאט. Metab. 1, 519–531.

8. Drakesmith, H., and Prentice, AM (2012). הפצידין וציר זיהום הברזל. מדע 338, 768–772.

9. גנץ, ט' (2019). אנמיה של דלקת. N. Engl. J. Med. 381, 1148–1157.

10. Armitage, AE, Agbla, SC, Betts, M., Sise, EA, Jallow, MW, Sambou, E., Darboe, B., Worwui, A., Weinstock, GM, Antonio, M., et al. (2019). צמיחה מהירה היא מנבא דומיננטי של דיכוי הפצידין וירידה בפריטין אצל תינוקות גמביים. Haematologica 104, 1542–1553.

11. Prentice, AM, Bah, A., Jallow, MW, Jallow, AT, Sanyang, S., Sise, EA, Ceesay, K., Danso, E., Armitage, AE, Pasricha, S.-R., et al. (2019). זיהומים בדרכי הנשימה מניעים חסימה בתיווך הפצידין של ספיגת ברזל המובילה לאנמיה מחוסר ברזל בילדים אפריקאים. Sci. Advances 5, eaav9020.

12. דלמן, יחסי ציבור (1987). מחסור בברזל והתגובה החיסונית. אמ. ג'יי קלין. נוטר. 46, 329–334.

13. אופנהיימר, SJ (2001). ברזל והקשר שלו לחסינות ומחלות זיהומיות. י. נוטר. 131 (2S-2), 616S–633S, דיון 633S–635S.

14. וואנג, ז', ין, ו', ג'ו, ל', לי, ג', יאו, י', צ'ן, פ', סאן, מ', ג'אנג, ג', שן, נ', סונג, י. ., ו-Chang, X. (2018). ברזל מניע את הפתוגניות של תאי T Helper על ידי קידום חלבון קושר RNA PCBP1-תיווך ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים. חסינות 49, 80–92.ה7.

15. Jiang, Y., Li, C., Wu, Q., An, P., Huang, L., Wang, J., Chen, C., Chen, X., Zhang, F., Ma, L. ., ועוד. (2019). היסטון תלוי ברזל 3 ליזין 9 דה-מתילציה שולטת בשגשוג תאי B ובתגובות חיסוניות הומורליות. נאט. Commun. 10, 2935.

16. Preza, GC, Ruchala, P., Pinon, R., Ramos, E., Qiao, B., Peralta, MA, Sharma, S., Waring, A., Ganz, T., and Nemeth, E. (2011). מיניהפסידינים הם פפטידים קטנים המעוצבים בצורה רציונלית המחקים פעילות הפצידין בעכברים ועשויים להיות שימושיים לטיפול בעומס ברזל. ג'יי קלין. להשקיע. 121, 4880–4888.

17. Howden, AJM, Hukelmann, JL, Brenes, A., Spinelli, L., Sinclair, LV, Lamond, AI, and Cantrell, DA (2019). ניתוח כמותי של פרוטאומים של תאי T וחיישנים סביבתיים במהלך התמיינות תאי T. נאט. אימונול.20, 1542–1554. 

18. Hentze, MW, Muckenthaler, MU, Galy, B., and Camaschella, C. (2010). שניים לטנגו: ויסות חילוף החומרים של ברזל ביונקים. תא 142, 24–38.

19. Hukelmann, JL, Anderson, KE, Sinclair, LV, Grzes, KM, Murillo, AB, Hawkins, PT, Stephens, LR, Lamond, AI, and Cantrell, DA (2016). פרוטום תאי ה-T הציטוטוקסי ועיצובו על ידי הקינאז mTOR. נאט. אימונול. 17, 104–112.

20. Knight, ZA, Schmidt, SF, Birsoy, K., Tan, K., and Friedman, JM (2014). תפקיד קריטי עבור mTORC1 באריתרופואיזיס ואנמיה. eLife 3, e01913.

21. Gerlach, C., Moseman, EA, Loughhead, SM, Alvarez, D., Zwijnenburg, AJ, Waanders, L., Garg, R., de la Torre, JC, and von Andrian, UH (2016). קולטן הכימוקין CX3CR1 מגדיר שלוש תת-קבוצות של תאי CD8 T עם ניסיון באנטיגן עם תפקידים ברורים במעקב חיסוני ובהומאוסטזיס. חסינות 45, 1270–1284.

22. Hikono, H., Kohlmeier, JE, Takamura, S., Wittmer, ST, Roberts, AD, and Woodland, DL (2007). פנוטיפ הפעלה, ולא פנוטיפ של זיכרון מרכזי או אפקטור, מנבא את יעילות ההיזכרות של תאי CD8 בתוספת T בזיכרון. J. Exp. Med. 204, 1625–1636.

23. Rytych, JL, Elmore, MR, Burton, MD, Conrad, MS, Donovan, SM, Dilger, RN, and Johnson, RW (2012). מחסור בברזל בתחילת החיים פוגע בקוגניציה המרחבית אצל חזרזירים יילודים. י. נוטר. 142, 2050–2056.

24. Maes, D., Segales, J., Meyns, T., Sibila, M., Pieters, M., and Haesebrouck, F. (2008). שליטה בזיהומי Mycoplasma hyopneumoniae בחזירים. וטרינר. מיקרוביול. 126, 297–309.

25. Feinberg, KE, Heeney, MM, Campagna, DR, Aydinok, Y., Pearson, HA, Hartman, KR, Mayo, MM, Samuel, SM, Strouse, JJ, Markianos, K., et al. (2008). מוטציות ב-TMPRSS6 גורמות לאנמיה מחוסר ברזל עמיד בברזל (IRIDA). נאט. ג'נט. 40, 569–571.

26. Harboe, ZB, Benfield, TL, Valentiner-Branth, P., Hjuler, T., Lambertsen, L., Kaltoft, M., Krogfelt, K., Slotved, HC, Christensen, JJ, and Konradsen, HB ( 2010). מגמות זמניות במחלות פנאומוקוק פולשניות וסרוטיפים פנאומוקוקליים במשך 7 עשורים. קלינ. לְהַדבִּיק. Dis. 50, 329–337.

27. Kalia, V., and Sarkar, S. (2018). ויסות של אפקטור וזיכרון CD8 T Cell Differentiation על ידי IL-2-A Balancing Act. חֲזִית. אימונול. 9, 2987.

28. Lee, YS, Wollam, J., and Olefsky, JM (2018). תצוגה משולבת של אימונומטבוליזם. תא 172, 22–40.

29. Arezes, J., Jung, G., Gabayan, V., Valore, E., Ruchala, P., Gulig, PA, Ganz, T., Nemeth, E., and Bulut, Y. (2015). היפופרמיה הנגרמת על ידי הפצידין היא מנגנון הגנה קריטי של המארח מפני החיידק ההידרופילי Vibrio vulnificus. Cell Host Microbe 17, 47–57.

30. פורטוגל, S., Carret, C., Recker, M., Armitage, AE, Gonc¸ alves, LA, Epiphanio, S., Sullivan, D., Roy, C., Newbold, CI, Drakesmith, H. , ו- OPEN ACCESS 178 Med 2, 164–179, 12 בפברואר 2021 מאמר קליני ותרגומי Mota, MM (2011). ויסות בתיווך מארח של זיהום-על במלריה. נאט. Med. 17, 732–737.

31. Darton, TC, Blohmke, CJ, Giannoulatou, E., Waddington, CS, Jones, C., Sturges, P., Webster, C., Drakesmith, H., Pollard, AJ, and Armitage, AE (2015) . הסלמה מהירה של הפצידין והרעבת ברזל בסרום הם מאפיינים של התגובה החריפה לזיהום בטיפוס בבני אדם. PLOS Negl. טרופ. Dis. 9, e0004029.

32. Spottiswoode, N., Armitage, AE, Williams, AR, Fyfe, AJ, Biswas, S., Hodgson, SH, Llewellyn, D., Choudhary, P., Draper, SJ, Duffy, PE, and Drakesmith, H. (2017). תפקידם של אקטיבינים בוויסות הפצידין במהלך מלריה. לְהַדבִּיק. חיסון. 85, ה00191-ה17.

33. Williams, AM, Ladva, CN, Leon, JS, Lopman, BA, Tangpricha, V., Whitehead, RD, Armitage, AE, Wray, K., Morovat, A., Pasricha, SR, et al. (2019). שינויים בריכוזי סמנים ביולוגיים של מיקרו-נוטריינטים ודלקת בסרום לאחר אתגר אנושי של נורו-וירוס. אמ. ג'יי קלין. נוטר. 110, 1456–1464.

34. Armitage, AE, Stacey, AR, Giannoulatou, E., Marshall, E., Sturges, P., Chatha, K., Smith, NM, Huang, X., Xu, X., Pasricha, SR, et al . (2014). דפוסים ברורים של ויסות הפצידין וברזל במהלך זיהומי HIV-1, HBV ו-HCV. פרוק. נאטל. Acad. Sci. ארה"ב 111, 12187–12192.

35. Shah, A., Frost, JN, Aaron, L., Donovan, K., and Drakesmith, H.; משתפי פעולה (2020). היפופרמיה מערכתית וחומרת כשל נשימתי היפוקסמי ב-COVID-19. קריט. טיפול 24, 320.

36. Lan, P., Pan, KH, Wang, SJ, Shi, QC, Yu, YX, Fu, Y., Chen, Y., Jiang, Y., Hua, XT, Zhou, JC, ו-Yu, YS (2018). רמת ברזל גבוהה בסרום קשורה לתמותה מוגברת בחולים עם אלח דם. Sci. רפ' 8, 11072.

37. Tacke, F., Nuraldeen, R., Koch, A., Strathmann, K., Hutschenreuter, G., Trautwein, C., and Strnad, P. (2016). פרמטרי ברזל קובעים את הפרוגנוזה של חולים קשים. קריט. Care Med. 44, 1049–1058.

38. Blanco-Melo, D., Nilsson-Payant, BE, Liu, WC, Uhl, S., Hoagland, D., Møller, R., Jordan, TX, Oishi, K., Panis, M., Sachs, ד., ועוד. (2020). תגובה מארח לא מאוזנת ל-SARS-CoV-2 מעודדת התפתחות של COVID-19. תא 181, 1036–1045.ה9.

39. Cao, X. (2020). COVID-19: אימונופתולוגיה והשלכותיה על הטיפול. נאט. כומר אימונול. 20, 269–270.

40. Barber, MF, and Elde, NC (2014). בריחה מפיראטיות ברזל חיידקית באמצעות התפתחות מהירה של טרנספרין. מדע 346, 1362-1366.

41. Olotu, A., Fegan, G., Wambua, J., Nyangweso, G., Leach, A., Lievens, M., Kaslow, DC, Njuguna, P., Marsh, K., and Bejon, P. (2016). יעילות שבע שנים של חיסון נגד מלריה RTS, S/AS01 בקרב ילדים אפריקאים צעירים. N. Engl. J. Med. 374, 2519–2529.

42. גרינווד, ב' (2014). תרומת החיסון לבריאות העולמית: עבר, הווה ועתיד. פילוס. עָבָר. R. Soc. לונד. ב ביול. Sci. 369, 20130433.

43. Stoffel, NU, Uyoga, MA, Mutuku, FM, Frost, JN, Mwasi, E., Paganini, D., Van der Klis, FRM, Malhotra, IJ, LaBeaud, AD, Ricci, C., et al. (2020). אנמיה מחוסר ברזל בזמן החיסון מנבאת ירידה בתגובת החיסון ותוספת ברזל בזמן החיסון מגבירה תגובת חיסון הומורלית: מחקר עוקבה לידות ומחקר מעקב אקראי בתינוקות קניה. חֲזִית. אימונול. 11, 1313.

44. Lopez, A., Cacoub, P., Macdougall, IC, and Peyrin-Biroulet, L. (2016). אנמיה מחוסר ברזל. Lancet 387, 907–916.

45. Katsarou, A., and Pantopoulos, K. (2018). Hepcidin Therapeutics. פרמצבטיקה (באזל) 11, 127.

46. ​​Schulman, JL, and Kilbourne, ED (1969). וריאציה עצמאית באופי של אנטיגנים להמגלוטינין ונוירמינידאז של נגיף השפעת: הייחודיות של אנטיגן ההמגלוטינין של נגיף הונג קונג-68. פרוק. נאטל. Acad. Sci. ארה"ב 63, 326–333.

47. פאוול, TJ, Silk, JD, Sharps, J., Fodor, E., and Townsend, AR (2012). נגיף שפעת פסבדוטייפ A כחיסון להשראת חסינות הטרוטיפית. J. Virol. 86, 13397– 13406.

48. Wang, C., Hart, M., Chui, C., Ajuogu, A., Brian, IJ, de Cassan, SC, et al. (2016). תגובות של תאי B של מרכז נבט ותאי זקיק T ל-Vector ויראלי וחיסונים אדג'ובנטיים. J. Immunol. 197, 1242–1251.

49. Galy, B., Ferring, D., and Hentze, MW (2005). יצירת אללים מותנים של הגנים המווסתים בברזל (IRP)-1 ו--2. בראשית 43, 181–188.

50. Badea, TC, Wang, Y., and Nathans, J. (2003). אסטרטגיה גנטית/פרמקולוגית לא פולשנית להמחשת מורפולוגיה של תאים ויחסי שיבוט בעכבר. J. Neurosci. 23, 2314–2322.

51. Heeney, MM, Guo, D., De Falco, L., Campagna, DR, Olbina, G., Kao, PP, Schmitz-Abe, K., Rahimov, F., Gutschow, P., Westerman, K. ., ועוד. (2018). נורמליזציה של hepcidin מנבאת מצב מוטציה של TMPRSS6 בחולים עם מחסור כרוני בברזל. דם 132, 448–452.

52. Naik, SH, Proietto, AI, Wilson, NS, Dakic, A., Schnorrer, P., Fuchsberger, M., Lahoud, MH, O'Keeffe, M., Shao, QX, Chen, WF, et al. . (2005). חוד החנית: יצירת מקבילות תאים דנדריטים CD8 פלוס בטחול ו-CD8- בתרביות מח עצם דמויות Fms של טירוזין קינאז 3 ליגנד. J. Immunol. 174, 6592–6597.

53. Xiao, B., Deng, X., Zhou, W., and Tan, EK (2016). הערכה מבוססת ציטומטריית זרימה של מיטופאגיה באמצעות MitoTracker. חֲזִית. תָא. Neurosci. 10, 76.

54. Armitage, AE, Lim, PJ, Frost, JN, Pasricha, SR, Soilleux, EJ, Evans, E., Morovat, A., Santos, A., Diaz, R., Biggs, D., et al. (2016). הפרעה נגרמת של הורמון ויסות הברזל Hepcidin מעכב היפופרמיה דלקתית חריפה. ג'יי איסון מולדת. 8, 517–528.

55. Buchweitz, JP, Karmaus, PW, Harkema, JR, Williams, KJ, and Kaminski, NE (2007). מודולציה של תגובות דרכי הנשימה לשפעת A/PR/8/34 על ידי Delta9-tetrahydrocannabinol בעכברי C57BL/6. J. Pharmacol. Exp. ת'ר. 323, 675–683.

56. Efstratiou, A., and Maple, PAC (1994). אבחון מעבדה של דיפתריה (המשרד האזורי של ארגון הבריאות העולמי לאירופה).

57. Hefele, L., Syphan, S., Xayavong, D., Homsana, A., Kleine, D., Chanthavilay, P., Nouanthong, P., Xaydalasouk, K., Phathammavong, O., Billamay, S. ., ועוד. (2019). הגנה מפני סרופ ברמות שונות של מערכת הבריאות לאחר חיסון שגרתי עם דיפתריה-טטנוס שעלת תא שלם-הפטיטיס B-Haemophilus influenzae סוג B ברפובליקה הדמוקרטית העממית של לאו. קלינ. לְהַדבִּיק. Dis. 69, 2136–2144.

58. ארגון הבריאות העולמי (2005). המלצה לייצור ובקרה של חיסונים מצומדים לפנאומוקוק. איבר הבריאות העולמי. טק. נציג סר. 927, 64–98.

59. Chen, RT, Markowitz, LE, Albrecht, P., Stewart, JA, Mofenson, LM, Preblud, SR, and Orenstein, WA (1990). נוגדן חצבת: הערכה מחדש של טיטר מגן. J. Infect. Dis. 162, 1036–1042.

שיטות כוכב פלוס

טבלת משאבי מפתח

זמינות משאבים

איש קשר מוביל

מידע נוסף ובקשות למשאבים וריאגנטים צריכים להיות מופנים אל ויעלו על ידי איש הקשר הראשי, Hal Drakesmith (alexander.drakesmith@ imm.ox.ac.UK).

זמינות חומרים

פרויקט זה לא יצר ריאגנטים ייחודיים חדשים.

זמינות נתונים וקוד

פרויקט זה לא יצר קוד חדש או מערכי נתונים חדשים.

מודל ניסוי ופרטי נושא עכברים

אלא אם כן צוין אחרת, נהלי בעלי חיים בוצעו בסמכות של פרויקט משרד הפנים של בריטניה ורישיונות אישיים על ידי חוק בעלי חיים (נהלים מדעיים) משנת 1986 ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית של אוניברסיטת אוקספורד. עכברים אוחסנו בכלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי והוזנו באופן חופשי עם דיאטה סטנדרטית המכילה 188ppm ברזל (SDS Dietex Services, diet 801161), או דיאטה דלת ברזל מוקרנת (2ppm Fe, TD.99397, Teklad Envigo), או דיאטת ברזל מותאמת מוקרנת. (בקרה לדיאטה דלת ברזל, 200ppm Fe, TD.07801, Teklad Envigo). עכברים הורדמו בריכוזים עולים של CO2.

עכברי WT C57BL/6JOlaHsd הוזמנו מ-Envigo. WT B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (עכברים המבטאים C57BL/6 CD45.1) גדלו בבית באוניברסיטת אוקספורד. עכברי WT נשמרו על דיאטת ברזל סטנדרטית של 188ppm במשך לפחות 2- שבועות בתוך הבית לפני שנעשו השוואות לטרנסגניות. עכברי TfrcY20H/Y20H על רקע הומוגני של C57BL/6 היו מתנה חביבה מ-Raif Geha, בית החולים לילדים בבוסטון, בית הספר לרפואה של הרווארד.3 OT-I CD45.1: Transgenic C57BL/6.Tg(TcraTcrb)1100Mjb (OT-I) עכברים שהוצלבו עם זן מולד B6 של BL6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ בתוך הבית הייתה תרומה אדיבה ממייק בוגטופטה ברנקוב ווינצ'נזו סרונדולו (MRC HIU). עכברים הטרוזיגוטיים OT-II CD45.1/CD45.2.

עכברי B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OT-II) מהונדסים היו מתנה מאוליבר בנרד ובמקור ממעבדת ג'קסון, בר הארבור ME, והועברו ל-B6 הומוזיגוטי מולד. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) ליצירת עכברים הטרוזיגוטיים לטרנסגן Tg(TcrbaTcrb)425Cbn, אללים Pepc ו-Pepb: OT-II CD45.1/CD45.2 הטרוזיגוטיים.

כל העכברים היו תואמים למין ולגיל (בתוך 2- שבועות) במסגרת הניסויים הבודדים. עבור ניסויי חיסון in vivo נעשה שימוש בעכברים בין גיל 6-9 שבועות, כל העכברים היו בגיל 6-12 שבועות בעת התחלת הניסוי. בתוך כל ניסוי, עכברים הוקצו אקראית לקבוצות טיפול כך שמספר שווה של עכברים בכל כלוב קיבל כל טיפול. עבור ניסויי דיאטה, עכברים חולקו באקראי לקבוצות דיאטה בתחילת הניסוי.

תאי T עם אובדן מותנה של תפקוד IRP נגזרו מבעלי חיים שהושגו על ידי חציית קווי עכבר הנושאים אללים מסוג Irp1 (Aco1) ו-Irp2 (Ireb2)49 עם זן נוק-אין הנושא רצף CRE recombinase (CreERT2) הניתן להשראת טמוקסיפן לרצף Rosa26 המתירני locus.50 Aco1flox/flox, Ireb2flox/flox, Rosa26 plus / plus (CRE שלילי, המכונה IRP1/2flox/flox Cre –ve) ו-Aco1flox/flox,Ireb2flox/flox, Rosa26 plus /CreERT2 ליטרmates (CRE חיובי, המכונה IRP1/ 2flox/flox Cre plus ve) היו על רקע הומוגני של C57BL/6. הגידול וההליכים שבוצעו על עכברים ב-DKFZ נעשו על פי הנחיות מוסדיות. עכברים עברו גנוטיפ באמצעות רצפי פריימר Aco1 ו-Ireb2 בטבלת משאבי המפתח.

חומרים מוזרקים

מיניהפסידין: מסה מתאימה של מיני-הפצידין PR7329 (da-TH-Dpa-bhProRCR-bhPhe-Ahx-Ida(Hexadecylamine)-NH2) הומסה ב-80 אחוז אתנול ולאחר מכן ערבבה עם 60 מ"ג של Purebright SL220/Sunbright DSPE }}CN (NOF). תמיסת הבקרה הייתה Purebright SL220 מומסת באתנול. האתנול התאדה באמצעות תא ואקום שחומם ל-50C. הג'ל שנוצר אוחסן עד 24 שעות ב-4C והומס מחדש בנפח מתאים של מים כדי לתת ריכוז mHep של 1mM: 100nMole של מיני-hepcidin ב-100 מ"ל מים הוזרקו לכל עכבר לכל מנה.

אמוניום ציטראט ברזל (FAC) (F5879 Sigma Aldrich) הומס ב-3mg/ml ב-PBS. 100 מ"ל הוזרק תוך צפק לעכברים. דקסטרן ברזל (Sigma, D8517) הותאם ל-20 מ"ג/מ"ל ב-PBS ו-100 מ"ל הוזרק תוך צפק לעכברים.

חיסונים

נגיף vaccinia שונה באנקרה המבטא Ovalbumin: MVA-OVA היה מתנה חביבה ממתקן ליבת וקטור ויראלי, מכון ג'נר, אוניברסיטת אוקספורד. הנגיף דולל ל-10^7 יחידות יוצרות פלאק (PFU)/מ"ל ב-PBS, ו-100 מ"ל הוזרק תת עורית לאגף העכברים.

סרוטיפ 5 של אדנוווירוס אנושי המבטא Ovalbumin: AdHu5-OVA היה מתנה חביבה ממתקן ליבת וקטור ויראלי, מכון ג'נר, אוניברסיטת אוקספורד. הנגיף דולל ל-10^10 חלקיקים ויראליים (VP)/מ"ל ב-PBS, ו-100 מ"ל הוזרק תת עורית לאגף העכברים.

עבור חיסוני חלבון OVA ראשוני קיבלו עכברים 200 אג' (עבור תגובות OT-I או OT-II) או 800 אג' (תגובות אנדוגניות) של OVA (בקצהו Ovalbumin vac-pov, Invivogen), 25 ug של MPLA (vac-mpla, Invivogen) ו 1 אג' של אלפא-גלקטוסילסרמיד (מתנה מ-GS Besra, אוניברסיטת ברמינגהם, בריטניה או KRN7000 Enzo Life Sciences). עבור חיסוני OVA משני עכברים קיבלו 200 אג' של OVA ו-25 ug של MPLA תת עורית בצד.

העברות מאמצות

עבור ניסויים הכוללים את התגובה של תאי OT-I CD8 או OT-II CD4 T, הושגו תרחיפים של טחול עם תא אדומים, והתדירות של תאי OT-I CD8 T או OT-II CD4 T הוערכה על ידי ציטומטריית זרימה. הריכוז של תרחיף טחול שלם הותאם ל-50,000 תאי OT-I CD8 T/ml או 500,000 תאי OT-II CD4 T/ml ו-100ul של תרחיף תאים ב-PBS הוזרק iv

כימרות מעורבות של מח עצם

עבור ניסויי כימריות מח עצם מעורבת שולבה תערובת של 60 אחוזי TfrcY20H/Y20H CD45.2 (או WT CD45.2) מח עצם עם 40 אחוז מח עצם CD45.1 כדי לבדוק את הקיבולת של תאי TfrcY20H/Y20H לשקם ולתרום לתגובות חיסוניות ביחס לתאים מסוג פרא. מקבלי CD45.2 גברים בגיל 8 שבועות קיבלו הקרנה קטלנית ב-4.5 Gy למשך 300 שניות, ולאחר מכן מנוחה של 3-שעות, ומנה של 4.5 Gy לאחר מכן למשך 300 שניות. עכברים קיבלו בסך הכל 2 מיליון תאי מח עצם מהעכברים שצוינו לאחר 9-שבועות של מנוחה דם היקפי נלקח כדי לנתח שיקום על ידי ציטומטריית זרימה. כדי למנוע זיהום חיידקי עכברים שקיבלו אנטיביוטיקה במי השתייה שלהם (0.16mg/mL Enrofloxacin (Baytril), Bayer Corporation).

זיהום בנגיף השפעת

וירוס שפעת (A/X-31 (H3N2) A/Aichi/2/1968)46 הופץ בתאי MDCK-SIAT1 וכומת על ידי מבחני המגלוטינציה ו-TCID50 כפי שתואר קודם.47

עכברים הורדמו עם איזופלורן באירוסולין והודבקו ב-0.08 יחידות hemagglutination (HAU) של וירוס השפעת X-31 תוך-נאסלית. תרחיף הנגיף הוזרם בפיפטציה בצורה טיפה על האף כך שהנגיף נשאף.

טיטר נוגדנים ספציפיים לשפעת בנסיוב של עכברים נגועים נמדדו על ידי מבחני מיקרונייטרליזציה במבחנה של זיהום של תאי MDCK-SIAT1 עם H3N2 (X31) GFP המבטא וירוס כתב פסאודוטיפוס (S-FLU) כמתואר47 עם שינויים קלים. בקצרה, סרת עכברים שנאספה הושבתה בחום ב-56C למשך 30 דקות. דילולים של סרה (דילול החל 1:40) הודגרו עם H3N2 (X31) S-FLU למשך שעתיים ב-37C לפני הוספת 3e4 של תאי אינדיקטור MDCK-SIAT1. צלחות הודגרו למשך הלילה ב-37C. לאחר מכן נשטפו הצלחות וקבועות ב-10 אחוז פורמלין. ביטוי GFP נמדד בקורא צלחות Clariostar ודילול הסרה שהביא להפחתה של 50 אחוז בזיהום של הנגיף (נקבע באמצעות הפחתה של 50 אחוז באות GFP) דווח כטיטר המנטרל (EC50).

לימוד חזרזירים

דיור חזרזירים והליכי ניסוי בוצעו כולם במרכז לחקר חלב (CEDAR), אוניברסיטת רידינג, לפי הנחיות אתיות מקומיות. כל הניסויים אושרו על ידי ה-Reading Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) ובוצעו תחת רישיון משרד הפנים בבריטניה.

כדי להעריך את ההשפעה של מחסור בברזל על התגובות לחיסון, 18 חזרזירים לבנים היברידיים גדולים מ-6 המלטות חולקו באופן שווה בין 2 קבוצות טיפול תואמות מין בגיל יום אחד. הטיפולים היו: קבוצה 1: בקרה ללא תוספת ברזל, תחליף חלב זריעה ניזון (SMR) בדומה לחלב פורמולות לתינוקות מבוסס בקר; קבוצה 2: הוזנה ברזל בתוספת (150mg/kg BW) SMR, מחצית מקבוצה זו קיבלה גם זריקת ברזל תוך שרירית (200mg Fe) בגיל יום אחד (איור S6). לפני שהגיעו ל-CEDAR, החזרזירים לא קיבלו חיסונים, אנטיביוטיקה או זריקות ברזל סטנדרטיות לבעלי חיים. בתחילה, חזרזירים אוכסנו ב-2 קבוצות (ברזל דרך הפה וללא תוספת ברזל דרך הפה) כדי ללמוד לשתות מקערות ובגיל יומיים אוכסנו בנפרד.

לאורך כל הניסוי, חזרזירים אוחסנו ב-30 מעלות צלזיוס על נסורת וקש וצוידו במנורות חום במחזור אור וחשוך של 12 שעות והייתה להם גישה חופשית למי שתייה טריים. חזרזירים קיבלו תחילה ריכוז SMR של 10 אחוז (בתוספת ברזל או ללא תוספת) כל 4 שעות (5 האכלות ליום) וזה הוגדל ל-15 אחוז ולבסוף ל-20 אחוז (4 האכלות ליום, ריכוז סטנדרטי) ביום הרביעי. כדי להקטין את הסיכון לשיוף. לאחר מדידות משקל פעמיים בשבוע, כמות ה-SRM והברזל-סולפט (תוסף ברזל דרך הפה) הוגדלה בהתאם להשגת 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף לאורך כל הניסוי. כל החזרזירים קיבלו חיסון IM נגד Mycoplasma hyopneumoniae (2 מ"ל, Suwaxyn MH-One, Zoetis Ltd, Leatherhead, בריטניה) בגיל שבועיים, ודגימות דם נאספו באמצעות ניקור ורידים תוך שימוש באבזור ללא EDTA לאחר שבועיים (לפני החיסון), בני 3 ו-4 שבועות (אחרי החיסון). הדם הועבר בקירור מיידית למשך 3-4 שעות לפני שבוצע צנטריפוגה לקבלת סרום, שנשמר ב-80C. לאחר 28 ימים, חזרזירים נהרגו על ידי מנת יתר של פנטוברביטל נתרן BP 20 אחוז (Dolethal, Vetoquinol Ltd, Northamptonshire, בריטניה).

חולי IRIDA

איסוף, גנוטיפ ופנוטייפ המטולוגי של IRIDA וחולי ביקורת תוארו בעבר.51

תרבית תאים

כל התאים תורבו ב-37C, 20% O2 ו-5% CO2. כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. השלם R10. RPMI עם 10 אחוז FCS (סיגמא), גלוטמין (2mM), פניצילין (100U/ml), סטרפטומיצין (0.1mg/ml), ובטא-מרקפטואתנול (55mM). מצע תרבות שעבר שינוי בברזל. הוזמן תחליף סרום Pannexin NTS (P04-95080; Pan Biotech) חסר ברזל. תחליף סרום Pannexin NTS נטול ברזל נוסף ב-10% v/v ל-RPMI לצד גלוטמין (2mM), פניצילין (100U/ml), סטרפטומיצין (0.1mg/ml) ובטא-מרקפטואתנול (55mM) כדי להפוך את הברזל ללא ברזל. בינוני. כדי לשנות את תכולת הברזל של המדיום המלא ללא ברזל, הוסף הולו טרנספרין (T0665 Sigma Aldrich) בריכוז שצוין. Apotransferrin (T1147 Sigma Aldrich) נוספה גם למדיום המלא ללא ברזל כדי לשמור על ריכוז הטרנספרין הכולל של המדיום על 1.2mg/ml.

תאי T CD8. תרחיפים של תא בודד נוצרו מבלוטות לימפה צוואריות, מפשעתיות, ביתיות וברכיאליות על ידי ניתוק מכני דרך מסננת תאים בגודל 40 מ"מ. כאשר התפשטות נותחה, השעיות בלוטות הלימפה הושעו מחדש ב-500 מ"ל של PBS עם 5mM Invitrogen Cell Trace Violet (C34557) והוצבעו ב-37C למשך 8 דקות לפני כיבוי עם 12 מ"ל של מדיום שלם, שטיפה והמשך לבידוד תאי T. תאי CD8 T בודדו מבלוטות הלימפה של WT C57BL/6, TfrcY20H/Y20H, OT-I CD45.1 באמצעות ערכת בידוד תאי T של Stem Cell Technologies CD8 (19853, Stem Cell Technologies) ו-Easy Plate Magnet, ומ-IRP1 /2flox/flox Cre -/ פלוס עכברים המשתמשים בערכת בידוד תאי T שלילי CD8 של Miltenyi Biotech (130-104-075, Miltenyi Biotech) לפי הוראות היצרן.

צלחות שטופלו בתרבית רקמה שטוחה טופלו ב-5 מ"ג/מ"ל של CD3 נגד עכבר (145-2C11) למשך שעתיים ב-37C ולאחר מכן נשטפו עם PBS. תאי CD8 T צופו במדיום שלם עם ריכוז סופי של 100U/ml עכבר IL-2 ו-1 mg/ml anti-עכבר CD28 (37.51). תרבויות הכוללות תאי TfrcY20H/Y20H, WT C57BL/6 או IRP1/2flox/flox Cre -/ plus ve בוצעו במדיום R10 שלם. תרבויות שבדקו את ההשפעה של ריכוז מופחת של ברזל על תאי WT T מעכברי C57BL6/ או OT-1 CD45.1 בוצעו במדיום מלא ללא ברזל. תאי CD8 T צופו בריכוז סופי של 500,000/ml לניתוח ב-72 שעות לאחר ההפעלה לניתוח התפשטות או 700,000/ml לניתוח ב-24 שעות לאחר ההפעלה לניתוח הפעלה.

עבור התרבית של IRP1/2flox/flox Cre -/ plus, תאי ve טופלו ב-4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (H6278, Sigma/Merck) ב-100nM או בנפח דומה של אתנול טהור במקביל לתערובת ההפעלה של אנטי-CD28 מסיס, IL-2 ואנטי-CD3 הקשורים לצלחת. כאשר היה צריך לנתח את התפשטות התאים, לאחר 24 שעות של תרבית תאים נקצרו, הסתובבו והוקפו מחדש במדיום טרי עם 100U/ml עכבר IL-2 ו-1 mg/ml anti-עכבר CD28 כדי להסיר {{19} }OHT או EtOH ומצופה מחדש בארות מצופים ב-CD3 נגד עכבר. תאים תורבו במשך 48 שעות נוספות והשגשוג הוערך על ידי ציטומטריית זרימה.

עבור ניסויי הצלת ברזל נוספו ברזל סולפט (FeSO4) (F8633, Sigma Aldrich) או אמוניום ציטראט ברזל (FAC) (F5879, Sigma Aldrich) בריכוז המצוין מתחילת התרבית והתחדשו במארז. של IRP1/2flox/flox Cre -/ פלוס ניסויים לאחר 24 שעות כאשר הוסרו 4-OHT/EtOH.

BMDCs תורבתו כמתואר52 עם שינויים קלים. בקצרה, תאי מח עצם שעברו ליטוש של תאים אדומים מעכברי C57BL/6 הושעו מחדש ב-1 מיליון תאים/מ"ל במדיום R10 שלם עם 100ng/ml FLT3L (550702, Biolegend) ותופחו במשך 7 ימים לפני השימוש.

פרטי השיטה

ציטומטריית זרימה

השעיות חד-תאיות של בלוטות לימפה או טחול נעשו על ידי ניתוק מכני דרך מסננת תאים 40 מ"מ. תאים אדומים חולקו בהשעיות טחול באמצעות חיץ תמוגה של תאים אדומים (2.06 גרם/ליטר Tris ו-7.47 גרם/ליטר NH4Cl, 1L H20, מותאם ל-pH 7.2) באמצעות Tris אמוניום כלוריד (ACT)

כדי לבודד לימפוציטים מהריאה, הריאות נטחנו במספריים ועוכלו במשך 30 דקות ב-4 מ"ל של מדיום עיכול: RPMI, 40U/ml DNase I (Sigma-Aldrich, מספר קטלוגי: D5025), ו-0.4mg/ מ"ל של Collagenase IV (Sigma-Aldrich, מספר קטלוגי: C5138). השעיות חד-תאיות נוצרו על ידי ריסוק דרך 70-מסננת תאים. תאים חולקו ותאים אדומים חולקו עם חיץ תמוגה של תאים אדומים ACT. לאחר מכן נעשה שימוש בבידוד שכבת 40% /80% Percoll (GE Healthcare 17-0891-02) כדי להעשיר לימפוציטים בתרחיף הריאות. לאחר מכן נשטפו לימפוציטים מועשרים ונספרו לפני צביעת זרימה.

לניתוח של לויקוציטים מדם היקפי של עכברים, 100 מ"ל של דם מלא שנאסף על ידי דימום זנב לתוך שפופרת BD micro trainer EDTA עורבבו עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה של ACT Red Cell והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. תמיסת הדם נסחררה ב-400 גרם למשך 5 דקות, הסופרנטנט הוסר, וכדורית הלויקוציטים הועברה לצלחת תחתית עגולה בעלת 96 בארות לצביעה ציטומטרית זרימה.

השעיות תאי רקמה או תאים מופעלים במבחנה בנקודות זמן מתאימות לאחר תאי הפעלה הועברו לצלחת 96-תחתונה עגולה היטב, הסתובבו ונשטפו עם 200 מ"ל של PBS. התאים נצבעו בריכוזים מתאימים של בלוק קולטן FC, נוגדנים מצומדים פלואורופור וצבע חי מת שניתן לתקן ב-40 מ"ל של PBS למשך 20 דקות ב-4C בחושך. תאים נשטפו והפעילו ישירות על Invitrogen Attune או BD LSR Fortessa. עבור כמה ניסויים, תאים נקבעו למשך 10 דקות ב-100ul של 4 אחוז פרפורמלדהיד בטמפרטורה של 4C בחושך לפני שטיפה והשעיה מחדש לצורך ניתוח או הושענו מחדש במאגר סלסול מבוסס ספונין כדי לצבוע אנטיגנים תוך תאיים.

צביעת טטרמר באמצעות ריאגנטים ממתקן הטטרמר NIH בוצעה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות במאגר FACs (PBS עם 2 אחוז FCS ו-0.04 אחוז נתרן אזיד) לפני צביעת נוגדנים.

לצורך ניתוח מיטוכונדריאלי, התאים נשטפו והוצבעו ב- Mitotracker Green (M7514, Thermofisher Scientific) וב- Mitotracker Deep Red (M22426, Thermofisher Scientific) ב-100nM במדיה מלאה (או מדיום חסר ברזל למחסור בברזל בסרום או RY120 לחזרת תרבית/TH120 תרביות Y20H) למשך 30 דקות ב-37C לפי הוראות היצרן. מצאנו שצביעת MTDR הייתה רגישה לשיבוש תרופתי של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית עם Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) בהתאם לספרות שפורסמה.53 היחס בין MTDR ל-MTG חושב כדי להצביע על פוטנציאל הממברנה המנורמל עבור נפח המיטוכונדריה .

לזיהוי של ציטוקינים תוך-תאיים, ספלנוציטים צופו ב-2 מיליון תאים/200מ"ל במדיה שלמה בצלחת תחתית עגולה של 96 בארים עם 0.1mg/ml SIINFEKL (OVA 257-264)( פפטיד Vac-sin Invivogen) לתגובות ספציפיות ל-OVA, פפטיד B8R 0.5mg/ml עבור תגובות ספציפיות ל-Vaccinia (AS-64688, Anaspec) או 1ug/ml OVA (323-339), (Va- is, Invivogen) כדי לגרום לייצור ציטוקינים OT-II. לאחר 30 דקות נוספו 5mg/ml Brefeldin A והתאים תורבו במשך 4 שעות נוספות לפני צביעה פני השטח/תוך תאית לציטומטריית זרימה.

לזיהוי של תגובות CD4 ספציפיות ל-MVA על ידי ICS, יום 7 BMDC צויפו ב-0.3 מיליון תאים לבאר של 96-צלחת באר עם 50ng/ml FLT3L. BMDCs נותרו ללא גירוי, גירוי לא ספציפי עם 0.5mM של CpG (ODN 1826) (Tlrl-1826, Invivogen), או הודבקו ב-MOI של 1 של MVA-OVA למשך הלילה. למחרת התאים נשטפו ונוספו 2 מיליון ספלנוציטים מעכברים לא מחוסנים או מחוסנים ב-MVA. לאחר 30 דקות נוספה Brefeldin A לריכוז סופי של 5mg/ml והתאים תורבו במשך 4 שעות נוספות לפני צביעה פני השטח/תוך תאית לציטומטריית זרימה. תאי CD4 T מפרישי ציטוקינים הוגדרו כ-CD154 פלוס ציטוקין פלוס (בהשוואה ל-CD4 לא מגורה ב-DCs עם פעימות CpG או CD4 של עכברים תמימים).

ראה את טבלת המשאבים העיקריים עבור נוגדנים בשימוש.

סכימות שער לדוגמה עבור אוכלוסיות מפתח מתוארות באיורים של שיטות משלימות 1-6. CD8 פלוס CD44 פלוס טטרמר פלוס תאי T CD8 (שיטות משלימות איור 1A) והשפעה של מיני hepcidin על CD8s חיובי לטטרמר (שיטות משלימות איור 1B). B220 פלוס IgD-CD95 בתוספת תאי B ממרכז נבט (שיטות משלימות איור 2A) והשפעה של מיני הפצידין על תאי B ממרכז נבט (שיטות משלימות איור 2B). CD4 פלוס CD44 פלוס CXCR5 פלוס PD-1 פלוס תאי עוזר זקיקים של T (שיטות משלימות איור 3A) והשפעה של מיני hepcidin על תאי עוזר זקיקים T (שיטות משלימות איור 3B). CD138 פלוס IgD- תאי פלזמה (שיטות משלימות איור 4A) והשפעה של מיני hepcidin על פלזמה (שיטות משלימות איור 4B). CD8 פלוס CD45.1 פלוס OT-I CD8s (שיטות משלימות איור 5A) וההשפעה של מיני hepcidin על תאי אפקטור OT-I (שיטות משלימות איור 5B). שער של OT-I IFN-gamma, TNF-alpha או IL-2 המייצרים תאי CD8 T על ידי ICS (Supplementary Methods Figure 6A) והשפעה של mini hepcidin על תאי CD8 T המייצרים ציטוקינים (Supplementary Methods איור 6B).

ניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)

RNA הופץ מיציאות כבד או אונות ריאה שנאספו ל-RNA מאוחר יותר (AM7020 Thermofisher Scientific) וכדוריות תאים קפואות עם הערכה של RNeasy plus (QIAGEN, 74136) ותעתוק לאחור ל-cDNA (Life Technologies, 4387quantitative עבור PCR 4387406) מכונת מערכת PCR מהירה בזמן אמת של Biosystems 6500 המשתמשת במבחני TaqMan המפורטים בטבלת משאבי המפתח. לפי הפרוטוקולים של היצרן. ביטוי גנים מוצג כ-2^([CT של גן בקרה אנדוגני] – [CT של הגן המעניין]). Hprt השתמש בגן ​​בקרה אנדוגני עבור qRT-PCR של כבד וריאות. B2m שימש כגן בקרה לתרביות תאי T CD8 מכיוון שה-CT אינו משתנה במהלך הפעלת תאי T.

מדידות ברזל רקמות וסרום

הרקמות יובשו במשך 3 שעות ב-100C, והמסה היבשה של פיסת הרקמה נמדדה. חתיכות רקמה עוכלו ב-10 אחוזים של חומצה טריכלורואצטית / 30 אחוז חומצה הידרוכלורית במשך 20 שעות ב-65C. תכולת הברזל הלא-האם נקבעה על ידי התגובה של הרקמה המעוכלת בחומצה עם ריאגנט כרומוגן המכיל 0.1 אחוז (w/v) חומצה באטו-פנונתרולידי-סולפונית (Sigma, 146617) ו-0.8 אחוז חומצה תיוגליקולית (Sigma, 88652) מודדים ספיגה ב-53-53 לעקומה סטנדרטית של אמוניום ציטראט ברזל כמתואר.54

לניתוח סרום של דגימות עכברים עד 400 מ"ל של דם שהושג על ידי ניקור לב הונח בצינור BD micro trainer SST (Beckton Dickinson). הסרום הושג על ידי ספינינג דגימת הדם הקרושה נסחררה ב-8,000 גרם למשך 5 דקות ואוחסנה ב-80C. ברזל בסרום הוכמת באמצעות מנתח אוטומטי של Abbott Architect c16000 (מעבדות אבוט) וערכת הברזל MULTIGENT בבית החולים אוקספורד ג'ון רדקליף, בריטניה.

ניתוח של מחקר חזרזירים

ברזל בסרום חזיר נמדד באמצעות בדיקה אוטומטית על מנתח אוטומטי של Abbott Architect c16000 (מעבדות אבוט) במחלקה לביוכימיה קלינית, OUHNHS. דגימות סרום נבדקו לנוגדנים מסוג M. hyopneumoniae באמצעות ELISA חסימת חד שבטי מסחרית (ערכת זיהוי M. hyopneumoniae, Thermo Scientific Oxoid, UK, K004311) לפי הוראות היצרן ב-Biobest Laboratories Ltd, אדינבורו; תוצאות צפיפות אופטית של מדגם (OD) תוקנו באמצעות ה-OD הממוצע של בארות בקרת חיץ. טיטר סרום של נוגדנים מנטרלים (אגנוסטי של איזוטיפ) חושבו כאחוז חסימה של אות שמקורו בקישור של האנטי-M המוגדר. נוגדן מצומד hyopneumoniae HRP שנכלל בבדיקה. תוצאות דווחו כשיפור באחוז החסימה ביום 28 (14 ימים לאחר חיסון) ביחס ליום 14 (יום החיסון) כדי לזהות שיפור בתגובות נוגדנים מעל נוגדן אימהי תורשתי. שיפור בחסימה אחוזית=(חסימה אחוז ביום 28) – (חסימה אחוז ביום 14).

טיטרים של IgG נגד OVA של Murine

טיטר נוגדנים נגד חלבון OVA מעכברים מחוסנים נקבעו על ידי ELISA. בקיצור, הצלחות צפו בחלבון OVA (InvivoGen Endofit,50 מ"ל/באר ב-10 מ"ג/מ"ל) למשך הלילה. לצלחת נוספו דילולים של סרה בדיקה (בשלוש עותקים). הצלחות נשטפו 6 פעמים עם PBS-T (PBS, 0.05 אחוז Tween). כדי לזהות IgG קושר ל-OVA, ה-Ab המשני של העז נגד עכבר קושר ל-IgG של עז אנטי-עכבר מצומדות אלקליין-פוספטאז (Sigma Aldrich A-3562), ולאחר מכן כביסה נוספת. OD405 לאחר הוספת מצע pNPP כמתה באמצעות קורא צלחות ELx800 (Bio-Tek). הדילול שבו ה-OD היה תחילה מתחת לרקע בתוספת 3 SD נרשם ב-AU כטיטר נקודת הסיום.

מדידות נוגדנים לסרה אנושית בחולי IRIDA

ריכוזי נוגדנים (IgG) נגד חצבת, חזרת, אדמת, אבעבועות רוח, Ptx, FHA, PRN, Dtxd, Ttx, Hib ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס סרוטיפים 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F בסרה של חולי IRIDA עם אללים מוטנטיים של TMPRSS6 ובקרות ללא חוסר ברזל מסוג TMPRSS6 נמדדו במכון הלאומי לבריאות הציבור והסביבה, Bilthoven, הולנד. בשום מקרה לא היה ריכוז נוגדנים ממוצע גבוה יותר באופן משמעותי בחולי TMPRSS6.

היסטולוגיה

כדי להעריך דלקת בדרכי הנשימה, דגימות ריאות תוקנה עם 4 אחוז פרפורמלדהיד במאגר פוספט והוטמעו בפרפין במתקן הליבה של HEMS ב-i3S, פורטוגל. לאחר דה-פראפיניזציה עם קסילן והידרציה על ידי מעבר בדרגת אלכוהול, קטעים בעובי 3 מ"מ נצבעו בהמטוקסילין-אאוזין. ציוני היסטופתולוגיה עבור דלקת ריאתית הוקצו באמצעות קריטריונים שונה55 כדלקמן: 0, נורמלי, ללא דלקת; 1, מוקדי דלקת מינימליים, נדירים; 2, חדירת תאים דלקתיים קלה של המחלקה הפריווסקולרית/פריברונכיולרית ללא הרחבת מכתשית או מועטה; 3, חדירת תאים דלקתיים בינונית של החלל הפריווסקולרי/פריברוכיולרי עם הרחבה מתונה לתוך הפרנכימה המכתשית; ו-4, חדירת תאים דלקתיים חמורים של החלל הפריבוסקולרי/פריברונכיולרי עם גודל גדול יותר של מוקדים דלקתיים שנמצאים בפרנכימה המכתשית.

חדירת ניוטרופילית סווגה כ-0, ללא עדות ללוקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN); 1, נוכחות של PMN מפוזר; 2, PMN תכופים עם צבירה מוקדית; 3, PMN תכופים עם צבירה מולטיפוקל. חדירת נויטרופילים הוערכה נוספת עם כתם כלורואצטט אסטראז (Leder), שבוצע בשירות הפתולוגיה האנטומית ב- Centro Hospitalar de Sa˜ o Joa˜ o, פורטוגל. צביעת Orcein (שבוצעה ב-IPATIMUP Diagnostics, פורטוגל) שימשה להערכת הסיבים האלסטיים של מחיצות המכתשית ולהעריך את מידת השינוי של מבנה הריאה המכתשית הקשורה לנוכחות החדירה הדלקתית. הקטעים נבחנו על ידי שני חוקרים, כולל פתולוג מיומן באופן עיוור ללא ידע מוקדם על קבוצות הטיפול. הציון הממוצע חושב והושווה בין קבוצות הטיפול. קטעי טחול עברו עיבוד דומה, אך נצבעו בתגובה הכחולת הפרוסית של פרלס לברזל ברזל באמצעות נהלים סטנדרטיים.

קצב ייצור ATP על ידי ניתוח השטף המטבולי של סוסון ים

קצב ייצור ATP והתרומה היחסית של חילוף החומרים המיטוכונדריאלי והגליקוליטי לכך חושבו לפי פרוטוקול היצרן באמצעות ערכת בדיקת קצב ATP בזמן אמת של Agilent Seahorse XF (103592-100) ומכשיר Aligent XF96. בקצרה תאי CD8 T נקצרו לאחר 48 שעות של הפעלה במדיה עם ריכוז הטרנספרין שצוין, נשטפו והוקפאו מחדש ב-Seahorse Assay Media (RPMI pH 7.4 ללא מאגר עם 1mM פירובט, 2mM L-גלוטמין ו-10mM גלוקוז) ו-150,000 תאים קיימא/באר חולקו למיקרו-לוחית XF96 מצופה Poly-D-ליזין. שיעורי צריכת החמצן (OCR) ושיעורי החמצה החוץ-תאית (ECAR) נמדדו בתוספת רציפה של 1.5 מ"מ אוליגומיצין ו-0.5 מ"מ Rotenone/Antimycin A.

כימות ATP על ידי זוהר

ייצור ATP נמדד באמצעות Cell Titer-Glo (Promega G7570) לפי הוראות היצרן. בקצרה תאי CD8 T תורבו כמתואר ב'תרבית תאים' במשך 24 שעות (ולכן נותחו לפני התחלת חלוקת התא), הסתובבו והוקפו מחדש ב-50 מ"ל של מדיום (ללא ברזל לתרביות של מחסור בברזל, RPMI רגיל עם 10 אחוז FCS עבור תרביות TfrcY20H/Y20H), הועבר לצלחת אטומה עם דופן לבן 96- מתאים למדידות זוהר ונוספו 50 מ"ל של Cell Titer-Glo. בארות היו מעורבות וזוהר, פרופורציונלי לתכולת ה-ATP, נמדדה ב-Promega GloMax Luminometer.

כימות וניתוח סטטיסטי

נהלי אקראי סטנדרטיים שימשו עבור ניסויים in vivo עם עכברים מאותו גיל ומין (עכברי ניסויים ובקרה נבחרו באקראי מבין חברי המלטה). החוקרים לא היו עיוורים להקצאה במהלך ניסויים והערכות. המספר הנדרש של עכברים לכל ניסוי נקבע מהזמינות של בעלי חיים מגודלים, חישובי כוח, ניסיון קודם בביצוע ניסויים עם אותם זני עכברים ונתונים מניסויי פיילוט. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות Prism גרסה 6 (תוכנת GraphPad). פרטים על מבחנים סטטיסטיים ספציפיים ניתנים באגדות איור.

עבור ריכוזי נוגדנים של חולי TMPRSS6 IRIDA, ערכנו ניתוחים סטטיסטיים עם SPSS (IBM SPSS Statistics, גרסה 22). הנתונים נבדקו לתקינות על ידי בדיקות סמירנוב-קולמוגורוב ועל ידי בדיקה ויזואלית של חלקות היסטוגרמה. נתונים שאינם מחולקים בצורה נורמלית הועברו טרנספורמציה לוגריתמית עבור ניתוחים סטטיסטיים. הגדרנו תגובה אימונולוגית כמגינה כאשר למשתתפים היו ריכוזי IgG בסרום נגד דיפתריה R 0$1IU/ml,56 anti-tetanus IgG > 0.5IU/ml,57 anti-Hib IgG > 1. 0mg/ml,57 anti-PCV IgG R 0$35 mg/ml58 ו-IgG R נגד חצבת 0$12IU/ml.59.

לא נקבע ריכוז מגן בסרום לאנטי-שעלת IgG.57 עבור השפעות בין קבוצות, נעשה שימוש בבדיקות t-מדגם עצמאיות או בבדיקות בלתי-פרמטריות מדגם עצמאי. ביצענו ניתוח של שיתופיות (ANCOVA) כדי להעריך את ההשפעה של הקבוצה (IRIDA לעומת בקרה) על ריכוזי IgG בסרום. הקבוצה הוגדרה כאפקט קבוע והוספנו ברצף מנבאים ידועים לתגובת חיסון: מגדר, גיל, Hb ו-TSAT כמשתנים שותפים למודלים. ביצענו את מבחן Chi-Square של Pearson ואת בדיקת Fisher's Exact כדי להשוות המרת סירו בין קבוצות ה- IRIDA והביקורת.

For more information:1950477648nn@gmail.com