סינתזה ירוקה ואפיון של ננו-חלקיקי ברזל המסונתזים מתמצית עלים מימיים של Vitex Leucoxylon והיישומים הביו-רפואיים שלו

תַקצִיר:שיטת המיצוי הקרה שימשה להשגת התמצית המימית שלVitex leucoxylonעלים ביחס של 1:10. ננו-חלקיקי ברזל (FeNPs) סונתזו באמצעות תמצית עלים מימית שלV. leucoxylonכגורם מפחית. הגישה לפיטורפואה שימשה לייצור FeNPs על ידי ערבוב של 1 מ"ל של תמצית צמחית עם 1 מ"מ של סולפט ברזל. מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM), ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום פורייה (FTIR), ספקטרוסקופיה אולטרה-סגולה גלויה (UV-Vis) וספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרת אנרגיה שימשו לבחינת ה-FeNPs המסונתזים. התגובה המפחיתה הוצגה על ידי שינוי בצבע התמיסה, והיווצרות צבע שחור מאשרת שנוצרו FeNPs. שיא הספיגה הגדול ביותר (מקסימום) נמצא ב-395 ננומטר בניתוח ספקטרלי UV-Vis. ספקטרום FTIR שלV. leucoxylonתמצית עלים מימית הראתה שינויים בחלק מהפסגות, כלומר 923.96 ס"מ−1 ו-1709.89 ס"מ−1, עם קבוצות פונקציונליות חומצות קרבוקסיליות, אלדהידים בלתי רוויים וקטונים, שהיו חסרים בספקטרום FTIR של FeNPs ואחראים ליצירת FeNPs. FeNPs בקטרים ​​בין 45 ל-100 ננומטר נצפו בתמונות SEM. יצירת FeNPs אושרה על ידי EDX, אשר מראה אות חזק באזור הברזל המתכתי ב-6-8 Kev. XRD גילה אופי גבישי וקוטר ממוצע של 136.43 ננומטר.נוגד חמצון,אנטי דלקתי, ציטוטוקסי, וריפוי פצעבדיקות במבחנה דיווחו על פעילות משמעותית של ה-FeNPs. הממצאים המצטברים של המחקר הנוכחי מצביעים על כך שהסינתזה הירוקה של FeNPsמגביר את הפעילות הביולוגית שלוועשויה לשמש כחומר אפשרי לריפוי פצעים עורייםוחומר ציטוטוקסי נגד סרטן. יש צורך במחקר עתידי על זיהוי מנגנונים המעורבים בסינתזה של FeNPs על ידיV. leucoxylonוהיישומים הביו-רפואיים שלה.

מילות מפתח:Vitex leucoxylon; ננו-חלקיקי ברזל; SEM; ריפוי פצע; ציטוטוקסי

הטבות CISTANCHE עבוראנטיאוקסידנט,אנטי דלקתיות, CYTOTOXIC, וריפוי פצע

1. הקדמה

היישום של ננוטכנולוגיה במדע ובטכנולוגיה לייצור חומרים חדשים ברמת הננו הוא תחום שצומח במהירות [1]. ננוטכנולוגיה עוסקת בייצור חומרים ברמה האטומית כדי להשיג תכונות ייחודיות, שניתן לתמרן עבור יישומים מועדפים. תחום זה צומח במהירות עם יישומיו במדע ובטכנולוגיה לייצור חומרים חדשים ברמה הננומטרית [2]. מגזרים תעשייתיים שונים אימצו את הננוטכנולוגיה בשנים האחרונות בשל יישומיה בתחומי מערכות אחסון אלקטרוניות [3], ביוטכנולוגיה [4], הפרדה מגנטית וריכוז מוקדם של אנליטים מטרה, אספקת תרופות ממוקדת [5] וכלי רכב לגנים ולתרופות משלוח [3,5,6]. כתוצאה מכך, לחלקיקים אלה יש פוטנציאל להשפיע באופן מהותי על החברה כתוצאה מהמגוון הרחב של היישומים שעבורם ניתן להשתמש בהם. ננו-חלקיקים (NPs) הם מסות של חלקיקים בגודל של פחות ממאה ננומטר ונחשבים למסה מבנית מרכזית בתחום הננוטכנולוגיה. הפעילות הגבוהה יותר של ה-NPs היא גם המאפיין המגדיר שלהם וגם האיכות שבה הם בולטים ביותר [7]. NPs אורגניים ואי-אורגניים הם שני הסיווגים העיקריים שניתן ליישם על ננו-חלקיקים. חלקיקי ננו אורגניים עשויים לכלול NPs מגנטיים, NPs מתכת אצילה (כגון זהב וכסף), ו-NPs מוליכים למחצה (כגון טיטניום דו חמצני ותחמוצת אבץ). ננו-חלקיקים אורגניים עשויים לכלול NPs פחמן. חלקיקי ננו אורגניים מושכים תשומת לב עצומה מכיוון שהם מציעים תכונות חומר מעולות יחד עם צדדיות תפקודית. הם נחקרו ככלים אפשריים להדמיה רפואית וכן לטיפול במחלות בשל מאפייני הגודל שיש להם [8]. התכונות הכימיות, הפיזיקליות והביולוגיות המגוונות של NPs מושפעות מאוד ממגוון פרמטרים, כולל גודל ננו-חלקיקים ומורפולוגיה, כמו גם ציפוי פני השטח, אשר נקבעים בדרך כלל במהלך הסינתזה של ננו-חלקיקים. אובדן הפעילות הביולוגית המיועדת נגרם כתוצאה מירידה ביציבות הקולואידית. pH, חוזק יוני ומספר רב של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם AgNPs בנסיבות רלוונטיות, כולם משפיעים על היציבות הקולואידית. כתוצאה מכך, בחירת טכניקת סינתזה נכונה היא קריטית להשגת מאפייני החלקיקים הרצויים עבור יישומים ספציפיים [9].

נכון לעכשיו, קיים מגוון רחב של NPs שניתן לסנתז באמצעות מגוון תהליכים פיזיקליים, כימיים, ביולוגיים והיברידיים. על פי הממצאים של מספר רב של מחקרים, התהליכים הפיזיקליים והכימיים לייצור ננו-חלקיקים כוללים שימוש בממיסים אורגניים, תרכובות מסוכנות, כמויות משמעותיות של אנרגיה וחומרים מייצבים שאינם מתכלים [10]. לכן, בתחום הננוטכנולוגיה הירוקה, סינתזה של NPs באמצעות חומרים זמינים טבעיים כגון תמציות צמחים, מיקרואורגניזמים שונים, המטבוליטים שלהם, וכמה חומרים הומוסיים טבעיים [11,12] כחומרי צמצום ומכסים הופכת לפופולרית יותר ויותר. שיטות סינתזה ידידותיות לסביבה שימשו לייצור מגוון רחב של ננו-חלקיקים מתכתיים, כולל כסף, זהב, ברזל, נחושת ואבץ. פיתוח שיטות קלות ומקובלות מבחינה סביבתית לסינתזה של NPs הוא אחד ממוקדי המפתח של הננוטכנולוגיה. ניתן להשתמש בחומרים ביולוגיים כגון מיקרואורגניזמים ותמציות צמחים בתהליך הכנת מגוון רחב של NPs [13,14]. עם זאת, מכיוון שחלק מהאורגניזמים הם פתוגנים, מסוכן לטפל בהם. על מנת לשגשג, מיקרואורגניזמים צריכים להישמר בתרבות ולהיות נתונים לתנאים מבוקרים בקפידה, כולל טמפרטורה, pH ופרמטרים אחרים. מכיוון שהוא מבטל את התהליך המפרך של שמירה על התרבות המיקרוביאלית, סינתזה של NPs באמצעות חלקי צמחים יכולה לפעמים להתגלות כמועילה יותר מתהליכים ביולוגיים אחרים [15]. כתוצאה מכך, הוא זכה לתשומת לב רבה בשל המאפיינים המובנים שלו, הכוללים ניצול משאבי טבע, מהירות, ידידותיות לסביבה ושפירות. מאפיינים מושכים אלה נחוצים בהחלט לשימוש ביישומים רפואיים. הננו-חלקיקים המיוצרים בסינתזה ירוקה הם בעלי גודל מוגדר היטב ובשליטה, הם נקיים ממזהמים, והשיטה פשוטה להגדלה. אלו הם חלק מהיתרונות הנוספים של סינתזה ירוקה [16]. הפעילות הביולוגית של הננו-חלקיקים המסונתזים נקבעת ומכווננת במידה רבה על ידי החומרים הירוקים המשמשים ליציבות והפחתת יוני מתכת. אחד המאפיינים האידיאליים של ה-NPs צריך להיות שהוא חייב להיות בעל יכולת יוצאת דופן להבחין בין מטרות פוטנציאליות (פתוגנים) ותאי יונקים (מארחים) [17].

בשל כך, התמצית המימית של עלי V. leucoxylon נחקרה על הפוטנציאל שלה להקל על היווצרות ננו-חלקיקי ברזל (FeNPs) במחקר הנוכחי. ברזל הוא אחד היסודות שניתן למצוא בשפע הגדול ביותר על פני כדור הארץ. לאחרונה, הוא הוכר כמעמד חדש של NPs חשובים בשל העובדה שהוא בעל מגוון תכונות ייחודיות, כולל כפייה גבוהה וסופר-פארמגנטיות. Cataly sis, מכשירים אלקטרוניים, אחסון מידע, חיישנים, טכנולוגיית מתן תרופות, ביו-רפואה, מכשירי הקלטה מגנטיים וניקוי סביבתי הם רק חלק מהיישומים המסקרנים הרבים שעשו שימוש ב-FenPs [18]. יתרה מכך, על פי מספר מחקרים, FeNPs עשויים להיווצר מתמציות צמחים שונות. תמציות צמחים אלו כוללות עלה אקליפטוס גלובולוס [19], עלה רימון [20], ואפר קליפת בננה [21]. הצמח V. leucoxylon, ששימש במחקר הנוכחי, הוא בן למשפחת ה-Werbenaceae. הוא ידוע גם בתור עץ חמשת העלים הצנוע (קנאדה: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) וניתן למצוא אותו באזור לאורך גדות הנהר ביערות ירוקי עד חצי ירוקי עד ויערות נשירים לחים לאורך נחלים. הוא יכול להגיע לגובה של עד 20 מ' והוא מסווג כעץ נשיר צנוע עד גדול. לאורכם של יערות הגהט המערביים של הודו, ניתן למצוא אותו במספרים גדולים. דווח כי עירוי תמצית עלי V. leucoxylon מחזיק במגוון רחב של פעילויות תרופתיות כגון פעילויות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון, אנטי פסיכוטיות, נוגדות דיכאון, אנטי פרקינסון ואנטי היפרליפידמיות [22]. מוצרים טבעיים שימשו לאורך ההיסטוריה ובמיוחד ברפואה העממית לטיפול במגוון רחב של תחלואים ומחלות. נוהג זה מתוארך לתקופות קדומות. שיטות הכימיה של מוצרים טבעיים הקיימות כבר זמן רב אפשרו למצוא מגוון עצום של מטבוליטים משניים ביו-אקטיביים המגיעים ממקורות יבשתיים וימיים. מספר לא מבוטל מהחומרים המופיעים הטבעיים הללו נחשב כעת לשימוש כתרופות פוטנציאליות [23].

ישנם מספר רב של כימיקלים וחומרים מזינים המופיעים באופן טבעי שטרם נחשפו ושימושיים לאנושות. כתוצאה מכך, ישנה דרישה מיידית למחקר ופיתוח של אפשרויות טיפוליות חדשניות העשויות להיות מנוצלות בהצלחה בהתערבויות טיפוליות תוך יצירת כמות מינימלית של תופעות לוואי.

תהליך הסינתזה הירוקה המוצע כעת עבור FeNPs הוא נבדל וחסכוני. במחקר הנוכחי נעשה ניסיון ליצור ננו-חלקיקים בטמפרטורת החדר ללא שימוש בכימיקלים או טכניקות פיזיקליות. מפעל Vitex leucoxylon נבחר במאמץ לסנתז ננו-חלקיקי ברזל, ובוצעו מודלים שיטתיים מקיפים במבחנה כדי להעריך את העוצמה של ננו-חלקיקי ברזל. רק מספר מצומצם של מחקרים על הרעיון של ננו-חלקיקים ויישומים ביו-רפואיים שלהם פורסמו על צמח זה. כתוצאה מכך, החלטנו שיהיה מועיל לבצע מחקר זה מתוך מחשבה על המטרות הבאות: סקר לפיטוכימיקלים ומדידת מספר המטבוליטים המשניים ב-V. leucoxylon; סינתזה ירוקה ואפיון של FeNPs מ V. leucoxylon; מחקר השוואתי של השפעות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות של V. leucoxylon וה-FeNPs שלו במבחנה; פעילות ציטוטוקסית במבחנה של תמצית עלים מימית של V. leucoxylon ו-FeNPs שלה נגד סרטן העור, סרטן הריאות וסרטן הפה; פעילות ריפוי פצעים במבחנה של תמצית עלים מימית של V. leucoxylon ו-FenP הסינתטיים שלו על ידי בדיקת שריטות.

2. חומרים ושיטות

2.1. אוסף חומר צמחי

בחודש מרץ 2022, עלים טריים של V. leucoxylon נקטפו מאזור יער אנשי ב-Ghats המערבי במחוז אוטר קנאדה במדינת קרנטקה בהודו. העלים זוהו ואומתו על ידי ד"ר קוטרשה ק., טקסונום, המחלקה לבוטניקה, המכללה למדע קרנטקה, דרוואד; קרנטקה, על ידי התייחסות לדגימת השובר שהופקדה במחלקה לבוטניקה, המכללה למדע קרנטקה, דרוואד, קרנטקה. לאחר שנאסף, חומר העלים הצמחיים הטריים נשטף תחת מי ברז זורמים, מיובש בשמש ולאחר מכן טחון לאבקה גסה באמצעות מטחנה מכנית. האבקה נשמרה במיכלים שנאטמו בטמפרטורת החדר כך שניתן יהיה להשתמש בה מאוחר יותר בתהליך של מיצוי ממס גולמי.

2.2. הכנת תמצית צמחים

באמצעות מכשיר Soxhlet, 25 גרם של אבקת עלים חולצו במשך 48 שעות עם 250 מ"ל מים מזוקקים. התמצית המימית רוכזה עוד יותר באמצעות מאייד רוטו, ולאחר מכן יובשה במייבשי ייבוש לפני שנשמרה בבקבוק סגור ב-4 ◦C עד לשימוש. לסינתזה של FeNPs, התמצית המימית נוצלה כחומר מפחית ומייצב.

2.3. ממיסים וריאגנטים

כל הכימיקלים והממסים שהיו בשימוש היו באיכות אנליטית ונרכשו מ-Hi-media (Hubli, הודו).

2.4. ניתוח פיטוכימי

בעקבות ההליך המתואר על ידי Deepti et al. (2012), תמצית העלים המימית הגולמית V. leucoxylon נבדקה באופן איכותי לנוכחותם של מרכיבים פיטוכימיים שונים כגון פלבנואידים, אלקלואידים, פנולים, גליקוזידים, סטרולים, ליגנינים, ספונינים, אנתרקינונים, טאנינים וסוכרים מפחיתים [24].

2.5. סינתזה של ננו-חלקיקי ברזל

ראשית, 1 מ"ל של תמצית עלים מימית V. leucoxylon נוספה ל-1 0 מ"ל של תמיסה מימית של 0.05 מ"מ FeSO4, והתערובת נערה. בטמפרטורת החדר ובסביבה חשוכה, בוצע תהליך תערובת התגובה המלא. תגובת החמצון/הפחתה נראתה בבירור לאחר שתערובת התגובה חסרת הצבע הודגרה והגיבה במשך פרק הזמן הנדרש [25]. על מנת להסיר עקבות של תמצית מימית מה-FeNPs שזה עתה מסונתז, אשר הורשו להתייבש באבקה לאחר צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד במשך עשר 10 דקות במהלך תקופת התגובה הרצויה, התערובת המימית המכילה FeNPs עברה צנטריפוגה. פעם שניה והתפזר במים מזוקקים כפולים ויבש [26].

2.6. אפיון של FeNPs

מספר שיטות, כגון ספקטרוסקופיה אולטרה-סגולה גלויה (UV-Vis), ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום פורייה (FTIR), מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת, וספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרת אנרגיה, דיפרקציית רנטגן (XRD), מנתח גודל חלקיקים וזטה פוטנציאל, נוצלו על מנת לאפיין את ה-FeNPs.

2.6.1. ניתוח מבוסס UV – גלוי-ספקטרוסקופיה

ראשית, מנה של 1 מ"ל של תמיסת FeNPs קולואידית בקובטות קוורץ הוערכה באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vitible (U-3310, Hitachi, טוקיו, יפן), תוך שימוש במים מזוקקים כנקודת התייחסות ו-0.05 mM FeSO4 כריק, כדי לאמת את הפחתת יוני הברזל בתמיסה הקולואידית [27].

2.6.2. ניתוח מבוסס FTIR

קבוצות התפקוד (הקבוצות) שהיו קשורות על פני הברזל והיו מעורבות בסינתזה של FeNPs זוהו באמצעות ספקטרוסקופיה FTIR (S700, Nicolet, MA, ארה"ב), [28]. לאחר 72 שעות של דגירה, ה-FeNPs בודדו על ידי צנטריפוגה חוזרת (3-4 פעמים) של תערובות התגובה ב-10, 000 סל"ד למשך 15 דקות. הסופרנטנט הוחלף במים דה-יונים והגלולה אוחסנה כאבקה. לאחר ייבוש, ה-FeNPs עברו ניתוח FTIR תוך שימוש בתהליך כדורת אשלגן ברומיד ביחס של 1:100.

2.6.3. ניתוח מבוסס סריקה-אלקטרון-מיקרוסקופיה

מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, ארה"ב), שימשה לבחינת הננו-חלקיקים ולביסוס צורת פני השטח שלהם. מצעים הוכנו על מצע Si נקי בגודל 5 מ"מ × 5 מ"מ שנבקע מפיסה בקוטר 100 מ"מ. המצע הורשה להגיב במשך 2 שעות עד 6 שעות והדגימה הוכנה על ידי צנטריפוגה של תמיסה קולואידית ב-10,000 סל"ד למשך 5 דקות. הגולה יובשה לאחר צנטריפוגה חוזרת פעמים רבות, ולאחר מכן היא פוזרה מחדש במים דה-יונים וההליך חזר על עצמו. לבסוף, התקבלה הכדור היבש, שהועבר עוד יותר לאפיון המבני על ידי ניתוח SEM לפי הנוהל המתואר על ידי המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה, NIST-2007 [29].

2.6.4. צילום רנטגן פיזור אנרגיה

לאחר ייבוש על רשת נחושת מצופה פחמן, ה-FenPs המופחתים נותחו באמצעות EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, ארה"ב), מה שאפשר גם לקבוע את הרכב היסודות.

2.6.5. זיטה פוטנציאל

תצפיות על NPs פוטנציאל הזטה הוא כלי שימושי להשגת תובנות נוספות על יציבות ה- NPs הקולואידים. משרעת פוטנציאל הזטה מספקת רמז ליציבות האפשרית של הקולואיד. לפי Meléndrez et al. (2010), חלקיקים נחשבים יציבים אם ערכי פוטנציאל הזטה שלהם הם חיוביים יותר מ-30 mV או יותר שליליים מ-30 mV [30]. עובדה זו צריכה להילקח בחשבון. מד הזטה הלייזר נוצל על מנת להשיג קריאות של פוטנציאל הזטא פני השטח (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, בריטניה). הדגימות הנוזליות של הננו-חלקיקים, בהיקף כולל של 5 מיליליטר, הודללו ב-50 מיליליטר של מים מזוקקים כפול, ו-2 מ"מ למ"ר של נתרן כלורי שימשו כתמיסת האלקטרוליט המרחף. לאחר מכן, ה-pH שונה עד שהגיע לרמה הרצויה. הדגימות נסערו במשך 30 דקות בסך הכל. לאחר ניעור המיכל, צוין ה-pH בשיווי משקל, ונקבע פוטנציאל הזטה של ​​החלקיקים המתכתיים. לצורך קביעת פוטנציאל פני השטח של FeNPs, נוצל פוטנציאל זטה. בכל מקרה, הערך הנקוב היה הממוצע של התוצאות של שלוש מדידות בודדות. כאשר ערכי פוטנציאל הזטה נעו בין גבוה יותר מ-30 mV לנמוך מ-30 mV, הקריטריונים ליציבות של NPs נקבעו [31].

2.6.6. מנתח גודל חלקיקים

על מנת לקבוע את גודל החלקיקים של הדגימה, בוצעה עליה בדיקת PSA לאחר שעברה ליאופיל ולאחר מכן התפזרה באמצעות קולי (SZ-100, Horiba, Kyoto, יפן).

2.6.7. ניתוח דיפרקציית רנטגן (XRD).

ננו-חלקיקי הברזל המסונתזים מתמצית עלים מימית של V. leucoxylon עברו ניתוח XRD (Smart Lab SE, Rigaku, טוקיו, יפן) כדי לקבוע את הטבע וכן את הגודל הממוצע של הננו-חלקיקים.

2.7. קביעת פעילות נוגדת חמצון באמצעות שיטות במבחנה

2.7.1. מבחן כוח נוגד חמצון מפחית יון ברזל (FRAP)

על פי Oyaizu (1986), בשינוי מינורי, הוערך כוח הפחתת יוני הברזל [32]. במשך 30 דקות ב-50 ◦C, נוספו 2.5 מ"ל של חיץ פוספט 20 מ"ל ו-2.5 מ"ל של 1 אחוז אשלגן פריציאניד ל-2.5 מ"ל של תמצית עלי V. leucoxylon וה-FeNP המסונתז שלו מעורבב עם השילוב. לאחר תקופת הדגירה, התערובת נוספה ב-2.5 מ"ל של חומצה טריכלורואצטית 10 אחוזים ו-0.5 מ"ל של כלוריד ברזל 0.1% w/w לפני הדגירה למשך 10 דקות נוספות. לבסוף, נעשה שימוש בספקטרופוטומטר UV-V כדי לזהות את הספיגה ב-700 ננומטר. כסטנדרט נעשה שימוש בחומצה אסקורבית. כל דגימה נבדקה שלוש פעמים.

2.7.2. מבחן ניקוי מי חמצן

בהתבסס על היכולת של תמצית עלה מימית V. leucoxylon וה-FenP הסינתטיים שלה לסלק מי חמצן, הוערכה פעילות נוגדת החמצון של תרכובות אלו. ראשית, {{0}}.6 מ"ל של חיץ פוספט (pH-7.4) המכיל 4 מ"ל H2O2 נוספו ל-0.5 מ"ל של חומצה אסקורבית סטנדרטית בריכוז ידוע, כמו גם צינורות המכילים תמציות צמחים בריכוזים שונים נע בין 100 µL ל- 500 µL (pH-7.4). באמצעות חיץ פוספט ותמיסה ריקה ללא מי חמצן, הערכנו את הספיגה של התמיסה ב-230 ננומטר לאחר 10 דקות. חיץ פוספט שימש ליצירת הבקרה במקום המדגם או התקן [33]. כל דגימה נבדקה שלוש פעמים. גישת הנוסחה שימשה לחישוב אחוז העיכוב.

2.7.3. DPPH ניקוי רדיקלים חופשיים

תמצית עלים של Assay V. leucoxylon ו-FeNPs מסונתזים נבדקו על יכולתם לנקות רדיקלים חופשיים באמצעות רדיקל DPPH כמגיב [34]. דגימות שולבו עם תמיסה רדיקלית DPPH (60 M) באתנול (100 μL) בריכוזים שונים (w/v). ספקטרופוטומטר UV-Vis שימש למדידת הספיגה של התערובת ב-517 ננומטר לאחר 30 דקות של דגירה בחושך בטמפרטורת החדר. חומצה אסקורבית שימשה כסטנדרט לניסוי. המשוואה הבאה שימשה כדי לקבוע את פעילות ניקוי ה-DPPH של כל דגימה:

כאשר Ac מייצג את הספיגה של תגובת הבקרה, המתבצעת על ידי ערבוב של 100 ליטר אתנול עם 100 ליטר מתמיסת DPPH, ו-At מייצג את הספיגה של דגימת הבדיקה. ניסויים בוצעו בשלישיות. ערך IC50 חושב עבור כל מדגם. רמה גבוהה יותר של פעילות רדיקלים חופשיים צוינה על ידי תערובת התגובה בעלת ספיגה נמוכה יותר.

2.7.4. בדיקת פוספומוליבדן (PM).

פעילות נוגדת החמצון הכוללת נקבעה באמצעות הטכניקה הסטנדרטית של Prieto et al., 1999. כל מבחנה שהכילה 3 מ"ל מים מזוקקים ו-1 מ"ל של תמיסת מגיב מוליבדאט קיבלה תמצית עלים מימית של V. leucoxylon ו-FeNPs שלו בריכוזים מגוונים שנעים בין 100 µL ל-500 µL. צינורות אלה הודגרו במשך 90 דקות ב-95 ◦C. הספיגה של תערובת התגובה נמדדה ב-695 ננומטר לאחר שהצינורות הללו הותאמו לטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות לאחר הדגירה. תקן הייחוס היה חומצה אסקורבית [35].

2.8. הערכה של פעילות אנטי דלקתית חוץ גופית

ההשפעה האנטי דלקתית של תמצית עלה מימית V. leucoxylon וה-FeNPs שנוצרו בה הוערכה באמצעות שיטת דנטורציה של חלבון המתוארת על ידי Elias et al., 1988, עם שינויים קלים [36]. כתרופה סטנדרטית, נעשה שימוש בנתרן דיקלופנק. תערובת תגובה הכוללת 2 מ"ל של ריכוז ידוע של FeNPs מיוצרים (100 גרם/מ"ל) עם נתרן דיקלופנק סטנדרטי (100 גרם/מ"ל) ו-2.8 מ"ל של תמיסת מלח מוגפת בפוספט (pH 6.4) מעורבבה עם 2 מ"ל של ביצת תרנגולת טרייה אלבומין (1 mM) והודגר ב-27 ± 1 ◦C למשך 15 דקות. דנטורציה נגרמה על ידי הכנסת תערובת התגובה לאמבט מים ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הקירור, הספיגה ב-660 ננומטר נמדדה באמצעות מים מזוקקים כפולים כריק. כל בדיקה בוצעה שלוש פעמים. הנוסחה הבאה שימשה כדי לחשב את אחוז העיכוב של דנטורציה של חלבון:

כאשר, ב-= ספיגה של דגימת בדיקה; Ac=ספיגת שליטה.

2.9. קביעת פעילות ציטוטוקסית ואנטי סרטנית של ננו-חלקיקי ברזל באמצעות מבחן MTT

הוערכה ההשפעה של V. leucoxylon וה-FeNPs המסונתז שלו על הכדאיות של תאי פיברובלסט לא סרטניים L292 והפעילות האנטי-סרטנית שלו על סרטן העור (A375), סרטן הריאות (A549) וסרטן הפה (KB-3-1) באמצעות מבחן MTT הסטנדרטי, על פי Carmichael et al., (1987) [37]. כל שורות התאים הושגו מהמרכז הלאומי למדעי התא (NCCS), פונה, הודו. ערכי אחוז עיכוב צמיחת תאים (IC50) נגזרו באמצעות עקומות מינון-תגובה עבור כל שורת תאים, והנוסחה הבאה שימשה כדי לחשב את אחוז עיכוב הצמיחה. ההמרה של MTT למוצר פורמזן סגול על ידי דהידרוגנאז מיטוכונדריאלי של תאים בריאים היא הבסיס לניסוי זה [38].

2.10. מחקר לריפוי פצעים במבחנה על ידי שימוש במבחן Scratch Assay

יכולות ההתפשטות והנדידה של תאי קו תאים L292 שנגרמו על ידי דגימות עם ריכוזים ידועים של תמצית צמחים וננו-חלקיקי ברזל נבדקו בחקירה הנוכחית [39]. לוחות תרבית תאים בעלי חיים עם מדיה DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS ו-2 אחוז אנטיביוטיקה Pen-Strep (Darmstadt, גרמניה) שימשו כדי להתחיל את תהליך תרבית התאים. קצה פיפטה פלסטיק סטרילי שימש כדי לגרד את מפגש התאים החד-שכבתי לאחר שגדלו לכ-50,000 תאים למ"ל. תמיסת PBS שימשה להסרת כל פסולת תאים לא רצויה. כביקורת שלילית, נעשה שימוש בתאים לא מטופלים, ואילו חומצה אסקורבית סטנדרטית שימשה כביקורת חיובית עבור דגימות פולימר בריכוז ידוע. במשך 24 השעות הבאות, התאים נשמרו ב-37 ◦C עם 5 אחוז CO2. לבחינת נדידת תאים יחסית וסגירת פצעים, שכבות התאים השרוטות הודגרו והצטלמו במרווחים שנעים בין 0 שעות ל-6 שעות עד 12 שעות ו-24 שעות. כיול המדידה של MagVision Software (X64, 2016, Magnus, ניו דלהי, הודו) ברזולוציית 4× שימש כדי לכמת את מרחק הפער. על מנת לקבוע את סגירת הפצע וקצב הנדידה, נעשה שימוש בנוסחה המוצגת להלן:

ביחס לדברים הבאים: A0h=אזור הפצע נמדד מיד לאחר הגירוד; שטח הפצע של ATh=נמדד לאחר שעות; Rm=קצב הגירה (מיקרומטר/שעה); Wf=רוחב פצע ראשוני (מיקרומטר); ו-T=זמן הגירה (שעה).

2.11. ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כסטיית התקן הממוצעת וטעות התקן, וכל ניסוי בוצע שלוש פעמים. תוכנת SPSS גרסה 20 שימשה לביצוע ניתוח שונות של שונות (ANOVA) על ההבדלים בממוצע הציונים שהיו קיימים בין הקבוצות.

תבקש עוד:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון: פלוס 86 15292862950

לִקְנוֹת:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop