גרהם-2023-למידה משרה תמליל ייחודי

תַקצִיר:
למידה יכולה לגרום לפלסטיות נוירופיזיולוגית בקליפת המוח השמיעתית בקנה מידה מרובים. שינויים מתמשכים בתפקוד קליפת המוח השמיעתי הנמשכים לאורך ימים, שבועות או אפילו לכל החיים, דורשים ביטוי גנים המושרה על ידי למידה. ואכן, תעתיק דה נובו הוא הקובע המולקולרי לשאלה האם חוויות חולפות הופכות לזיכרונות ארוכי טווח עם השפעה מתמשכת על התנהגות.

עם ההתפתחות המתמשכת של המדע והטכנולוגיה, הופיעו תופעות חיים קסומות רבות במהלך חיי האדם, ביניהן הזיכרון היקר ביותר למחקר. הזיכרון הוא חלק חשוב מהפעילות העצבית המתקדמת של האדם, והוא גם תיעוד והצטברות של אירועים שונים שהתרחשו מאז האבולוציה האנושית. אז האם יש קשר בין ביטוי גנים לזיכרון? התשובה היא כן.

ראשית, השפעת הגנים על הזיכרון ברורה. זה יכול לווסת את הביטוי של מגוון מולקולות וחלבונים הקשורים לזיכרון באמצעות פולימורפיזמים נוקלאוטידים בודדים (SNPs) ושיטות אחרות. זה יכול להשפיע על יעילות התקשורת בין נוירונים, ובכך להשפיע על המאפיינים הקוגניטיביים, המושגיים, הרגשיים ואחרים של האדם, המעידים על איכות הזיכרון.

שנית, לזיכרון יכולה להיות השפעה מסוימת על ביטוי גנים. בתהליך הלמידה, הזיכרון והחשיבה שלנו, מדובר לא רק בשינויים בפעילות העצבית של המוח אלא גם בוויסות והתערבות של גנים ומולקולות רבות. הוויסות של הגנים והמולקולות הללו יתעד עקבות התואמות לתחושות ולחוויות הקיימות בזיכרון לטווח ארוך שלנו, ובסופו של דבר יאוחסנו בגנים.

לבסוף, קיימת תלות הדדית בין גישה חיובית ליכולת זיכרון לטווח ארוך. מצב רוח שמח יכול לעזור לנו להתמקד יותר ולהתרכז בתהליך הלמידה והחשיבה, ובכך לעזור לשפר את יכולת הזיכרון. זיכרון מכוון לטווח ארוך יכול גם לקדם היווצרות של קשרים ומבנים עצביים חדשים במוח, מה שגם עוזר מאוד ללמידה ולזיכרון עתידיים.

לכן, אנו יכולים להסיק שיש מתאם בין ביטוי גנים לזיכרון. אנו יכולים לקדם ולשפר את יכולת הזיכרון שלנו באמצעות זיכרון מכוון, אופטימיות וחשיבה חיובית, מה שיכול גם לעזור לנו להשיג בריאות פיזית ונפשית טובה יותר. רק כך נוכל לשרת טוב יותר את החברה ואת ההתפתחות האנושית. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche deserticola יכול לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche deserticola הוא חומר רפואי סיני מסורתי בעל השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של בשר טחון מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, לרבות חומצה, פוליסכרידים, פלבנואידים ועוד. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח בדרכים שונות.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי לשפר את הזיכרון

עם זאת, גנים קליפת המוח השמיעתיים התומכים בלמידה שמיעתית, זיכרון והתנהגות ספציפית לצליל נרכשים אינם ידועים במידה רבה. דו"ח זה הוא הראשון לזהות שינויים בכל הגנום בביטוי גנים המושרה על ידי למידה בתוך קליפת השמע הנחשבת כעומדת בבסיס היווצרות הזיכרון השמיעתי. ניתוחים ביואינפורמטיים על פרופילי העשרת גנים מרצף RNA זיהו מסלולים ביולוגיים הכוללים כולינרגיות סינפסות ואינטראקציות קולטן נוירואקטיביות.

הממצאים מאפיינים גורמים מועמדים מרכזיים העומדים בבסיס השינויים בתפקוד קליפת המוח התומכים ביצירת זיכרון שמיעתי ארוך טווח במוח הבוגר. המולקולות והמנגנונים שזוהו הם יעדים טיפוליים פוטנציאליים כדי להקל על שינויים ארוכי טווח וספציפיים לקול בתפקוד השמיעתי בבגרות וכעת הם מתאימים לחקירות עתידיות ממוקדות גנים.

כְּתַב יָד:

מושג מקובל בתחום הלמידה והזיכרון הוא שזיכרונות מאוחסנים במקום שבו הם מעובדים (Nadel & Hardt, 2011). אירועים ביולוגיים הידועים בשם איחוד זיכרון יכולים לייצב ייצוגים עצביים חולפים המתעוררים על ידי חוויה חושית (Lechner, Squire, & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). מנגנונים יסודיים ואבולוציוניים שמורים שיוזמים איחוד זיכרון הם שעתוק ותרגום, המוגדרים כביטוי פעיל של גנים ומוצרי החלבון הבאים שלהם, בהתאמה (Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

שיערנו כי למידה של הבחנה קולית גורמת לביטוי גנים דה נובו בתוך קליפת השמיעה. ייצוגים ספציפיים ביותר של רמזים קוליים יכולים להחזיק מעמד את ארעיות החוויה (שניות ודקות) על ידי התגבשות לזיכרון לטווח ארוך (שעות עד ימים) שמנחה מאוחר יותר התנהגות עם רמז קולי. בעוד שפרופילים תעתיקים אזוריים מובחנים נחשבים כאחראים לגיבוש זיכרון (Katzman, et al., 2021), אירועי שעתוק הנגרמת על ידי למידה התומכים ביצירת זיכרון במערכת השמיעה המרכזית אינם מתוארים בצורה חמורה.

לעומת זאת, קליפת השמיעה תוארה בצורה יוצאת דופן במחקרים על למידה וזיכרון שמיעתיים ברמה של שינויים נוירו-פיזיולוגיים במיוחד בשדות קליטה ומפות טונוטופיות (Schreiner &Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), קורטיקו- קישוריות קליפת המוח וקורטיקו-פוגלית (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), כולל בטווחי זמן מרובים (Froemke & Martins) , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David, & Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). יתרה מכך, שינויים נוירופיזיולוגיים מקושרים להתנהגות, למשל, לפעולה מכוונת רמז (Letzkus, Wolff & Lüthi, 2015), קשב (Fritz et al., 2007;Elhilali et al., 2007) וזיכרון לאותות קול (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al.,2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

עשרות שנים של עדויות לפלסטיות נוירו-פיזיולוגית הנגרמת על ידי למידה בקליפת השמיעה הראו מאפיינים התנהגותיים משותפים של זיכרון שמיעתי (Weinberger 2007a; 2007b), מה שהופך אותו לאזור מועמד מוביל לגיבוש זיכרון שמיעתי. על ידי חקירה ביו-אינפורמטית של קליפת המוח השמיעתית, אנו גם ממנפים הזדמנות חסרת פניות לחשוף שומרי סף ביולוגיים נפוצים או מובהקים של נוירופלסטיות העומדים בבסיס תפקוד שמיעתי אדפטיבי. מנקודת מבט רחבה יותר, פרופיל תעתיק אזורי יכול להוביל להבנה מלאה יותר של האופן שבו המערכת החושית משתנה על ידי ניסיון בשירות הזיכרון.

פרופילים טראנסקריפטומיים המושרים על ידי למידה המזוהים בתוך קליפת השמיעה יכולים לאמת, להרחיב או להוביל למודלים ביולוגיים חדשים של תהליכים התומכים או פוגעים בעיבוד שמיעתי אדפטיבי. איחוד הזיכרון השמיעתי הוא ככל הנראה תוצר של שינויים תלויי ניסיון בביטוי גנים המשפיעים על תפקודים תאיים בתוך קליפת השמיעה, אשר בתורם מקדמים שינויים מתמשכים בתגובתיות נוירופיזיולוגית מעוררת צלילים שמשנים התנהגויות שנשמעו באמצעות קול.

כדי לזהות תמלילים המושרים על ידי למידה, בוצע ניתוח פרופיל ביטוי, באמצעות RNAsequencing (RNAseq) על דגימות של קליפת שמע מוגדרת אנטומית (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) ממבוגרים מוגבלים במים שעברו הכשרה ללחיצת ברים ועד לגוונים טהורים לתגמול מים. תגובות לתדר טון טהור מטרה (5.0 קילו-הרץ; 65 dB SPL) הובילו לתגמול, בעוד שתגובות לא-יעד (11.5 קילו-הרץ; 65 dB SPL) לא זכו לתגמול והחלו תקופת פסק זמן שהאריכה את הזמן עד לניסוי הבא.

משימת ההבחנה הדו-גוונית הזו (2TD) אינה קשה מבחינה תפיסתית; התדרים האקוסטיים נמצאים במרחק של מעל אוקטבה זה מזה, והם מובחנים בקלות על ידי מכרסמים (Talwar & Gerstein, 1998). במקום זאת, האתגר ההתנהגותי היה אסוציאטיבי: ביצועי 2TD דורשים זיכרון שעבורו הטון קשור לתגמול (לעומת ללא תגמול). חולדות מאומנות (N=8) הוקרבו לאחר שלושה אימונים יומיים רצופים של 45-דקה 2TD והשוו לקבוצה של חולדות תמימות קול (N=4). זוהי נקודת זמן מוקדמת באימון כאשר בעלי חיים עדיין רוכשים את משימת ה-2TD. רכישת מטלות מוקדמת נועדה ללכוד אירועים תעתיקים ראשוניים הנגרמות על ידי למידה שהכינו את הבמה לעלייה מאוחרת יותר בביצועי 2TD שנצפו בהתנהגות במשך שבועות של אימון.

לדוגמה, הביצועים הממוצעים היו מעל הסיכוי, אך רק 66±7.81% לאחר 3 ימים, בהשוואה לרמה גבוהה או שווה ל-90% לאחר אימון ממושך (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). כדי לנצל הזדמנות לזהות את הביטוי של גנים הרלוונטיים לזיכרון אסוציאטיבי מוצלח לצליל, מינפנו מעכב HDAC שמכוון לוויסות ספיגנטי של ביטוי גנים תלוי פעילות בלמידה ויצירת זיכרון (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al. al., 2017; Malvaez, et al., 2012). חשוב לציין, עשור של עבודה הראה שעיכוב HDAC יכול להקל על פלסטיות נוירו-פיזיולוגית הנגרמת על ידי למידה בתגובות קליפת המוח השמיעתיות (ביחס לגוף) ומשפרת התנהגויות הבחנה שמיעתיות (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) כולל בלתי אנושיים (Gervain, et al., 2013).

מחצית מהחיות המאומנות טופלו במעכבי HDAC, RGFP966 (N=4; 10 מ"ג/ק"ג, ApexBio, cat#A8803; הזרקת תת-מ"ק) , בעוד החצי השני היו מאומנים באופן זהה אך קיבלו תמיסת רכב (N=4; נפח מותאם, sub. cu. injection; איור 1a). לא היו הבדלים בביצועי 2TD בין קבוצות בזמן איסוף המוח (RGFP966: 61±5.0% לעומת רכב: 71±7.0%; t(5.9166)=-1.21, p=0.272 מוחות נאספו מיידית והוקפאו בנקודת זמן התואמת את ריכוז השיא של המעכב בקליפת השמע, שעה אחת לאחר ההזרקה שלאחר הפגישה של מעכב ה-HDAC או כלי הרכב (Bieszczad et al., 2015).

הממצאים כאן הם הראשונים לזהות פרופיל טרנסקריפטומי של למידה אסוציאטיבית בתוך קליפת השמיעה. למידה במשימת ההבחנה הדו-גוונית הובילה לשינויים ברמות התעתוק של מאות גנים (בהשוואה לקול נאיבי) (איור 1ב). אלגוריתם היררכי אשכול הראה כי גנים מווסתים או מווסתים באופן ייחודי, וחושף רשת מורכבת של אירועי ביטוי גנים בקליפת המוח הנגרמים על ידי למידה שמיעתית (איור 2א).

ניתוחי העשרה (iPathwayGuideTM; שיטת Impact Analysis) זיהו את הכולינרגית סינפסה (גנים מבוטאים דיפרנציאליים (DEG) / כל הגנים (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) כמסלול הביולוגי העליון (טבלה 1) . תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים מאז שנות ה-90 המדגישים את הספיקות של איתות כולינרגי בקליפת המוח השמיעתית פורנו-פיזיולוגית והתנהגות שמיעתית קשורה (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 19). רמות התמלול שנגרמו על ידי למידה תחת עיכוב HDAC הוגברו באותו כיוון (על ידי עליות נוספות או ירידה נוספת ברמות תמלול גנים ייחודיות) (איור 2b) או קהות בהשוואה ללמידה בלבד (איור 2c). מסלול ביולוגי מוביל בתנאים אלה היה האינטראקציה של ליגנד-קולטן נוירואקטיבי (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; טבלה 1) שכללה אפקטורים חיוניים להפעלה עצבית.

מסלול עליון נוסף היה האינטראקציה של קולטן המטריצה ​​החוץ-תאית (ECM-receptor) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; טבלה 1). רכיבי ה-ECM הם קריטיים עבור פלסטיות קליפת המוח וגיבוש זיכרון (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). מסלולים אלה מציעים אלטרנטיבות פוטנציאליות, אולי משלימות, לאיתות כולינרגי שיכולות להקל על שינויים מתמשכים תלויי חוויה בתפקוד השמיעתי (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). גנים אחרים שהביטוי שלהם השתנה עם למידה שמיעתית אך לא בהמשך עם עיכוב HDAC היו קשורים ככל הנראה לתנאים פרוצדורליים של המשימה, ולא לזיכרון אסוציאטיבי ספציפי לצליל. לדוגמה, מסלול האיתות של אפלין זוהה (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), שהוא חשוב במוח לוויסות ההומיאוסטטי של צריכת המים (Hu, et al., 2021). השוואה ישירה של רמות התמלול בין שתי הקבוצות של חולדות מאומנות (לומדות עם או בלי עיכוב HDAC) הראתה מעט מאוד גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEG).

סף המשמש במידה ניכרת לזיהוי ה-DEGs הסבירים ביותר (p =0.05) מצא שרק Adamts13, U6, Rexo4 ו-Cabin1 באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (איור 2d). לפיכך, נראה שההשפעה העיקרית של עיכוב HDAC לווסת את הביטוי של גנים המושרים על ידי למידה שמיעתית בתנאים נורמליים, במקום לגייס חדש גנים ייחודיים כדי לשרת זיכרון ספציפי לצליל. יחד, ממצאים אלה מראים ששינויים בקנה מידה גדול מתרחשים בקליפת השמיעה בשלב מוקדם באימון, כאשר בעלי חיים בוגרים לומדים להבחין בין קשרים אסוציאטיביים בין רמזים קוליים. יחד עם דיווחים נוירופיזיולוגיים והתנהגותיים מבוססים על עיכוב HDAC לקידום תפקוד שמיעתי, ממצאים אלה תומכים בטקטיקה של שימוש במעכבי HDAC כדי להבחין בין גנים שהביטוי שלהם קובע את הצלחת היווצרות זיכרון שמיעתי.

מספר גנים בעלי עניין (GOIs) נבחרו מתוך המסלולים האינביולוגיים של ניתוח העשרה כדי לאמת ריצוף רחב הגנום בגישה ממוקדת גנים. דגימות נאספו מקבוצות נפרדות ששכפלו את שתי הקבוצות של בעלי חיים מאומנים ומטופלים באותו שלב מוקדם ב- נקודת זמן אימון (כלומר שעה אחת לאחר האימון השלישי של 2TD) לשימוש בניתוח ביטוי גנים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR). לא היו הבדלי ביצועים של 2TD בקבוצות משוכפלות (RGFP9661: 61±5.0% לעומת RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; ו-Vhicle1:71±6.0% לעומת Vehicle2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; מבחן ה-t של Welch).

ה-GOI הראשון היה Egr1, "גן מיידי-מוקדם" שנחקר היטב ותלוי פעילות הידוע בשיאו במהלך השעות הראשונות של הלמידה וקריטי ליצירת זיכרון (Duclot & Kabbaj, 2017). זה היה גן המושרה על-ידי למידה עם ביטוי מוגבר מאושר שהוגבר גם עם עיכוב HDAC בקבוצה נפרדת של בעלי חיים במחקר ממוקד גנים (איור 3). הדבר נכון גם לגבי Per2, גן המעורב בוויסות של מקצבי יממה ומסלולים סרוטונינריים במוח (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 הוא חלק ממשפחת "גן השעון" שנקשרה לאפונון HDAC באזורי מוח אחרים (Kwapis, et al., 2018) ועשויה להיות לו תפקיד גם בתפקוד השמיעתי (Reh et al.,2020). לעומת זאת, כמה GOIs שזוהו בכל הגנום אושרו רק חלקית.

Chrna7 מקודדת תת-יחידה של הקולטן הדינמי לאצטיל כולין ניקוטין (nAChR) שנמצאה כמנוחתת עם למידה שמיעתית, בהתאם לראיות נוירופיזיולוגיות (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). לפיכך, ציפינו שהמחקר ממוקד גנים יאשר ירידה ברגולציה של Chrna7 בכל בעלי החיים שעברו הכשרה ב-2TD, אך וויסות מטה היה ניכר רק בחיות שטופלו ברכב שלמדו 2TD ללא עיכוב HDAC. GOI שנבחרו נוספים היו ממשפחת הקולטנים הגרעיניים היתומים Nr4a, Nr4a1 ו- Nr4a2, שהם גנים מיידיים שדווחו שהם נחוצים להפצת ההשפעות במורד הזרם של יעד ה-HDAC הסלקטיבי של RGFP966 באזורי מוח אחרים (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

בהתאם לדיווחים קודמים על הבדלים אזוריים תלויי משימה בביטוי הגנטי של משפחת Nr4a (McNulty, et al., 2012), Nr4a1 אך לא Nr4a2 זכה לוויסות מוגברת בקליפת המוח השמיעתית לאחר למידה שמיעתית. DEGs אחרים, Htr1a או Adamts13, לא אושרו על ידי מחקר ממוקד גנים, ככל הנראה בגלל הבדלים בגרסאות תמלול ידועות שלא זוהו על ידי בדיקות ממוקדות גנים שעוצבו בהתאמה אישית שלנו, או עקב שגיאה מסוג I, או הבדלים התנהגותיים עדינים בין קבוצות מאומנות של בעלי חיים לא זוהה במדדי ביצועים של 2TD. חקרנו גם את Lynx1, גן עם היסטוריה ארוכה של תפקוד לפתיחה מחדש של פלסטיות דמוית "תקופה קריטית" בקליפת המוח החושית (Morishita et al., 2010), ככל הנראה על ידי פעולתו על מודולציה כולינרגית וסרוטונרגית (Takesian, et al. , 2018). עם זאת, בהתאם לדיווחים קודמים ברחבי הגנום שנכשלו בזיהויו (Kalish, et al., 2020), הוא לא זוהה במערך הנתונים של RNAseq שלנו ולא במחקר ממוקד גנים.

למרות שזה נותר אתגר לקבוע אם ניתן להסביר אי התאמות על ידי שונות ביולוגית או אינדיבידואלית אמיתית בין בעלי חיים, או עקב שונות טכנית עם שפע נמוך או תמלילים המבטאים ספציפיים לסוג תא, אנו מדווחים על תוצאות עקביות בצורה יוצאת דופן עבור כמה GOIs. מכיוון שהביטוי המושרה על ידי למידה של Chrna7,Egr1 ו-Per2 עקבי בין הגישות הממוקדות לגנים ולכלל הגנום, ובין קבוצות שונות של בעלי חיים מאומנים, הגיוני שגנים אלה עשויים להיות השחקנים הבסיסיים ביותר לשינויים מתמשכים ב- תפקוד שמיעתי וזיכרון והם כעת ראשונים לחקירה עתידית.

בהתחשב ביחד, הממצאים חושפים נוף שעתוק דינמי בקליפת המוח השמיעתית של מבוגרים שיכול לתמוך בתפקוד שמיעתי מתהווה בנוירופיזיולוגיה והתנהגות. לאור העדויות ההולכות וגדלות של בקרות אפיגנטיות על תפקוד מערכת החישה (cf, Shang &Bieszczad, 2022), זה מרגש לשקול. כיצד מנגנונים אפיגנטיים ממלאים תפקיד באיזון היציבות עם הפלסטיות התלויה בחוויה של מעגלי קליפת המוח השמיעתיים. לדוגמה, מערך הנתונים הנוכחי הכולל של הגנום זיהה גם הפחתה הנגרמת על ידי למידה בביטוי של דה-אצטילאז היסטון arepressive, Hdac9, שנעדר עם עיכוב HDAC.

מפתה להשוות את ההשפעה של ביטוי HDAC9 מופחת להשפעה של עיכוב תרופתי של HDACs כדי לקדם שעתוק המושרה על ידי למידה. מחלקה חשובה נוספת של מווסתים אפיגנטיים משנה DNA ולא היסטונים. דוגמאות לכך הן Tet1 ו- Gadd45b, ששניהם משפיעים על מתילציה של DNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) ונמצאו כבעלי וויסות מטה ומעלה עם למידה, בהתאמה, תחת עיכוב HDAC. יתר על כן, קבוצה של microRNAs הופיעה כמסלול הביולוגי העליון המושרה על ידי למידה עם עיכוב HDAC (ראה טבלה 1), שזכו למשיכה בשטח כמווסתים אפיגנטיים מרכזיים של בקרת תעתיק עצבית (Saab &Mansuy, 2014). סביר להניח שגם אינטראקציות מולקולריות מסדר גבוה יותר בין שחקנים אפיגנטיים ומוצרי חלבון של גנים מבוטאים. לדוגמה, ה-Egr1 המזוהה המווסת למעלה יכול לגייס את Tet1 כדי להסיר סימני מתילציה מדכאים כדי להפעיל גנים במורד הזרם (Sun, et al.,2019). יהיה צורך במחקרים מולקולריים נוספים כדי לנתח את המשמעות של אינטראקציות בין מווסתים אפיגנטיים במערכת השמיעה במהלך הלמידה. יתר על כן, דו"ח זה מציג הזדמנות מיידית ליצור קשרים בין גנים נבחרים של קליפת המוח השמיעתית לבין המשפיעים שלהם במורד הזרם.

גישור הפער בין הגנים והמולקולות הללו להשפעתם על אירועים נוירופיזיולוגיים מעוררי צלילים חיוני כדי להבין כיצד מערכת השמיעה של מבוגרים מסתגלת עם הניסיון לשנות התנהגות. ואכן, התרגום של תעתיק דה נובו נדרש לשינויים ארוכי טווח בתפקוד ההתנהגותי מכיוון שהם מייצרים שינויים מתמשכים בתפקוד הסלולרי. לדוגמה, משפיעני יעד מרכזיים של תהליכי תעתיק הנגרמת על ידי למידה עשויים לשנות את זמינותם של ערוצים או קולטנים (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) בתוך מעגלים הקובעים את הצליל- עוררה סף, תגובה וארכיטקטורת שדה קליטה במערכת השמיעה. סביר להניח שמטלות שמיעתיות שונות יגייסו רשתות גנטיות ייחודיות למסלולים ביולוגיים הרלוונטיים לתפקודים התאיים המסוימים, אשר יתמכו בלמידה עבור תכונת הצליל או מבנה המשימה הרלוונטיים למשימה.

בסך הכל, דוח זה משמש כנקודת מוצא להפיכת מערכי נתונים של RNAseq מקליפת המוח הלמידה, המבוגרים והשמיעית זמינים (ראה מאגר נתונים). מאמץ לצמצם את פער הידע שהוחמר בשל המחסור החמור במחקרים המתמקדים בתהליכים גנטיים מולקולריים בקליפת השמע הבוגרים מתקבל כעת בברכה. אנו מעודדים מחקר מעבר למגבלות המרחב-זמניות של רצף RNA בתפזורת שרגישותו מוגבלת מבחינה טכנית גם על ידי עומק הקריאה (Li&Wang, 2021), במיוחד מכיוון שטכנולוגיות Omics המודרניות מתפתחות ומשתפרות במהירות.

בעוד מחקר בקליפת השמע עשה כמה צעדים ראשוניים בגנטיקה מולקולרית שזיהו אשדות מולקולריות חיוניות (Schicknick, et al., 2008), פרופילי IEG מתירניים (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018 ; Peter, et al., 2011) ואפילו כרומטינדינמיקה (Peter, et al., 2021), יש תקדים בפריפריה השמיעתית שבה דינמיקת תעתיק נלמדת בצורה יפה (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al. al., 2020; Ebeid, et al., 2017). כלים מולקולריים קיימים כמו רצף RNA חד-תא (RNA-Seq) ומולקולות פלואורסצנטיות במקום הכלאה (smFISH) יהיו שימושיים כדי לספק תובנות לגבי וריאציות תא לתא תלויות ניסיון ואינטראקציות מולקולריות בתוך תאים ומעגלים שמיעתיים. בניגוד ל-RNAseq בתפזורת, שיטות אלו מכבדות את המגוון התאי העמוק ואת הארגון בסדר גבוה בקליפת המוח השמיעתית, כגון המיקרו-מעגלים הספציפיים לשכבה והטופוגרפיה המינית שלו.
גישות חכמות לתיוג ולרצף תמלול מתאי קליפת המוח הפעילים רק לאחרונה (Cho, Huang, & Gray, 2016) עשויות להגביר את הרגישות במידה מספקת כדי להשיג את קבוצות הגנים הרלוונטיות ביותר מבחינה תפקודית מסוגי התאים והאוכלוסיות הרלוונטיות ביותר מבחינה תפקודית. ניתן להשתמש בגישות דומות גם באופן תת-קורטיקלי כדי ללכוד ולהבדיל בין פרופילים תעתיקים אזוריים תלויי פעילות בקליפת המוח המכבדים את האינטגרציה המדהימה של קליפת המוח עם התפקוד התת-קורטיקלי של מערכת השמיעה בתנאי הקשבה או דרישות התנהגותיות שונות. אפיון מלא של הבדלים תאיים ואזוריים במנגנונים גנטיים ומולקולריים העומדים בבסיס הלמידה השמיעתית במוח הבוגר הוא חיוני לפיתוח טיפולי דיוק סלקטיביים וממוקדי מולקולות המאפשרים שינויים תפקודיים חזקים ומתמשכים לתמיכה ביכולות שמיעה והקשבה ספציפיות לאורך כל החיים.

שיטות

נבדקים: בסך הכל נעשה שימוש ב-24 חולדות זכר Sprague-Dawley בוגרות (250 - 300 גרם בהגעה; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) בניסויים התנהגותיים ומולקולריים. כל בעלי החיים אוחסנו בנפרד בחדר מושבה מבוקר טמפרטורה (24 ˚C) במחזור אור/חושך של 12-שעה. לנבדקים הייתה גישה אד-ליביטום למזון ומים לפני אימון התנהגותי. כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בראטגרס, אוניברסיטת המדינה של ניו ג'רזי (פרוטוקול מס': 999900026 (KMB)).

מנגנון התנהגותי וגירויי קול: כל הפגישות ההתנהגותיות נערכו בשני תאי התניה אינסטרומנטליים זהים (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) בתוך קופסה מוחלשת קול. מפגשי אימון יומיים היו מאוזנים כדי להבטיח חשיפה שווה לשני החדרים. כל תא (12 אינץ' W x 10 אינץ' D x 12 אינץ' H; רצפת רשת תיל הייתה מצוידת במנוף תגובה (H21-03R), אור בית (H11-01R), רמקול (H{ {8}}R), ומערכת אספקת מים (H14-05R). במהלך שלבי האימון, בעלי חיים יכלו ללחוץ על ידית התגובה ("barpress"), מה שגרם להצגת כוס מים (~0.02cc) ביציאת התגמול (1.25"W x 1.625"H). נעשה שימוש במתג יד (H21-01) במהלך הפגישה המוקדמת כדי לעצב את תגובת הלחיצה של בעל החיים כדי להפעיל מצגות של כוס המים שאפשרה גישה ל- תגובות התנהגותיות תועדו באמצעות תוכנת Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) לניתוח לא מקוון.

כל הגירויים השמיעתיים נוצרו באמצעות תוכנת Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) ותוכנת RPvdsEx, והוצגו באמצעות הרמקול התלוי על הקיר של החדר האופרנטי. רעש לבן (במהלך אימון פרוצדורלי; איור 1א) ​​הוצג למשך 7 או 9 שניות (75 dB SPL). גוונים טהורים (במהלך אימון הבחנה דו-גווני; איור 1a) הוצגו תמיד למשך 8 שניות (70dB SPL). רמות הקול כוילות מדי יום באמצעות מד קול דיגיטלי (Larson DavisSoundTrack LxT1).

אימון התנהגותי ועיכוב תרופתי של HDAC3: לאחר יום אחד של התאקלמות ל-vivarium, חולדות טופלו מדי יום למשך 3 ימים לפחות. לפני תחילת האימון ההתנהגותי, חולדות הוצבו בלוח זמנים של מים מוגבלים עד שהגיעו ל-85% מהמשקל הבלתי מוגבל של חיות ביקורת תואמות גיל. חולדות מוגבלות במים עוצבו לאחר מכן בתוך חדרים מוחלשים לצליל כדי לחשוף את תגמול המים (איור 1א). עיצוב הברפרס ואימוני הסאונד שלאחר מכן היו כמתואר קודם לכן (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). בקצרה, כל בעלי החיים עוצבו ל-Barpress במשך 5 ימים ולאחר מכן אומנו במשימה פרוצדורלית ללמוד ל-barpress לצליל, שבשלב זה היה גירוי רעש גאוסי רחב פס (1-12.5 kHz רעש לבן מסונן בפס פס; 75 dB SPL), כדי לקבל תגמול מים. כל החיות למדו בהצלחה לקשר את הצליל הזה לתגמול לפני שהמשיכו לשלב הבא של האימון. אימון פרוצדורלי הראה שונות אינדיבידואלית של כמה מהר יכלו החיות ללמוד את המשימה לרמות גבוהות של ביצועים. עם זאת, כל החיות הצליחו להגיע לרמת ביצועים של יותר מ-90% או שווה ל-90% במשך יומיים רצופים (ממוצע=92.85%, sem =0.01%) לאחר ממוצע של 12.67 ימים ( sd=2.85 ימים). הביצועים חושבו באמצעות 100%.

השלב הבא של האימון היה משימת ההבחנה הדו-גוונית (2TD) (איור 1a), שבה אומנו חולדות להבחין בין שני תדרי צליל מובחנים מבחינה ספקטרלית. לחיצות על הטון S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) יגרמו להצגת פרס מים, בעוד לחיצות סרגל אל האבן (11.5 kHz; 70 dB SPL) הובילו לאות שגיאה (בית מהבהב אור) ו"פסק זמן" (המתנה של 6 שניות נוספות לתחילת הניסיון הבא). ניסויי S+ ו-S-S חולקו באקראי ונמשכו 8 שניות. מרווחי זמן בין ניסויים (ITI) היו בממוצע 15 שניות (טווח: 5-25 שניות, באקראי). חבטות במהלך ITI שקט היו חסרות משמעות (ללא פסק זמן, ללא אות שגיאה, ולא תגמול מים). הפעלות היומיות היו באורך 45 דקות. כל החיות ביצעו את 2TDtask במשך שלושה ימים רצופים. חולדות זוווגו על ידי צופה מיומן כך שלבעלי חיים עם שיעורים דומים של רכישת המשימה הפרוצדורלית הוקצו תנאי טיפול שונים בשלב ה-2TD. זוגות התואמים ביצועים קיבלו זריקות מערכתיות של מעכב HDAC3 מסוג I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 מ"ג/ק"ג; sc; N=12) או תמיסת רכב (N=9) מיד לאחר כל אחת מהן. מפגש 2TD. ביצועי המשימה 2TD חושבו כפי שתואר קודם לכן: 100% (Shang,Bylipudi, & Bieszczad, 20).

איסוף רקמות ובידוד של RNA: שעה לאחר שחיות קיבלו את החילוק השלישי והסופי של RGFP966 לאחר הפגישה השלישית של 2TD, מוחות נותחו במהירות והוקפאו במהירות בכוס של 2-מתיל-בוטאן שהונחה על קרח יבש. מוחות שהוקפאו בפלאש אוחסנו אז ב--80˚ C עד לעיבוד עתידי. כדי להכין מוחות לחיתוך בהקפאה, מוחות עטפו תרכובת טמפרטורת חיתוך לא אופטימלית (OCT) ואוחסנו ב--20˚ C למשך 12-24 שעות כדי להבטיח שרקמת המוח תגיע ל--20˚C לחיתוך. מוחות עטופים ב-OCT ייחתכו אז בצורה אופקית בקריוסטט (Leica CM 3050S) בעובי של 250 מיקרומטר. באמצעות אגרוף מיקרו רקמה עגולה בגודל 1 מ"מ, נדגמו 2 מ"מ של רקמת קליפת המוח שמיעתית מכל חצי כדור (משולב לדגימה אחת עבור סך של 4 מ"מ לכל אזור מוח) לצורך מיצוי RNA. קליפת מוח שמיעתית זוהתה באמצעות The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates של Paxinos ו-Watson (מהדורה 6) כהתייחסות (בערך A/P=-3.6 עד -5.8 מ"מ, M/L {{20} } ±6.4 מ"מ D/V=-4.2 עד -5.8 מ"מ; ושימוש בהיפוקמפוס כנקודת ציון

RNA הכולל מכל דגימה בודד באמצעות ערכת PureLinkTM RNA Mini (ThermoFisher) תוך שימוש בפרוטוקול של היצרן. לאחר מכן טוהרו דגימות RNA עם ערכת RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), ספריות רצף נוצרו באמצעות Illumina TruSeq® Stranded Library Prepkit לפי הפרוטוקולים המומלצים של היצרן. ספריות אוחדו והרצף בוצע על מכשיר Illumina NovaSeq 6000 המריץ 100 bp קצה מזווג SBSchemistry. קריאות עובדו באמצעות צינור המידע הפתוח 'bcbio-nextgen.py' שפותח בעיקר ב-Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) הפועל ב-Argon HPCresource באוניברסיטת איווה. צינור זה כולל גישות 'שיטות עבודה מומלצות' לבקרת איכות קריאה, יישור קריאה וכימות. הצינור 'bcbio-nextgen.py' הופעל במצב "RNA-seq" עם מפתח 'rn6' בתור מבנה הגנום שנבחר (התייחסות פנימית למכלול Ensembl ו-genebuild 'Rnor_6.0'). הצינור המיושר קורא ל-Rnor_6.0genome באמצעות יישור hisat2 (2.2.1) המודע ל-splice, מהיר במיוחד, ובמקביל קריאות מכומות לתעתיק באמצעות מיישר 'סלמון' (1.4.0). Qualimap (2.2.2), כלי חישוב הבוחן קבצי יישור BAM hisat2, שימש לבחינת נתוני הקריאה עבור בקרת איכות. ציוני איכות הרצף עברו בדיקות בסיסיות ושיעורי שכפול הרצף היו בפרמטרים מקובלים. כל הדגימות עברו QC לצורך יישור קריאה לאזורים אקסוניים. כימות תמלול שמקורן בסלמון (TPM או "תמלילים למיליון") יובאו וסוכמו לספירות משוערות ברמת הגן באמצעות tximport (1.12.3) ב-Rstudio, כמתואר ב- מתרגלת ויגנט DESeq2(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

גנים עם פחות מ-5 ספירות משוערות בכל הדגימות סוננו מראש מניתוח במורד הזרם, לפי הנוהל המומלץ. ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי נערך עם DESeq2 (v.1.24.0) על ספירות משוערות של רמת הגן. FDR של 5% ו-X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

אימות נתוני RNA-seq עם qRT-PCR: נתוני RNA-seq אומתו על ידי qRT-PCR על mRNA שהופקו מקבוצות שונות של חולדות. חמישה תמלילים נבחרו מתוך רשימה של DEGs חדש שנמצאו מועשרים בכל אזור בקו הבסיס. שלושה מהגנים היו מונעים על סמך השערות על סמך ספרות פיזיולוגית והתנהגותית של קליפת המוח שמיעתית, בעוד ששלושה גנים נוספים היו גנים חדשים שזוהו מרמת הגנים וניתוח DEG בהשוואה בין קבוצות תרופות וכלי רכב. כל רצפי הפריימר נבחרו מתוך ספרות קודמת על רקמת מוח בחולדות (רצפים המופיעים בטבלה למטה) או תוכננו באמצעות NCBI Primer Blast ואימות ספציפיות למטרה על ידי הערכת עקומות נמס ורצף מוצר אמפליקון PCR. ניתוח qRT-PCR בוצע ב-QuantStudio 3 (Applied Biosystems) עם SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). עבור כל דגימה, 500 ננוגרם של cDNA הוגבר באמצעות iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר אנדריאה שאנג, שון צאור וסוראז בייליפודי על הסיוע שלהם בהליכים התנהגותיים ובניתוח; ד"ר מימי ל. פאן על הסיוע שלה עם חילוץ RNA ואיסוף דגימות; ד"ר Troy A. Roepke, Ali Yasrebi, ו-ChristopherO'Brien על סיועם בניתוח טיהור דגימת RNA; ואליסה ריי לסיוע טכני. ברצוננו להודות לכל אנשי מעבדת CLEF בהווה ובעבר על הסיוע והתמיכה.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לחרשות והפרעות תקשורת [R01-DC014753 ל-KMB]; בית הספר לאמנויות ומדעים באוניברסיטת רוטגרס; קרן ארסטי באוניברסיטת רוטגרס עם מימון מענקים קטנים למחקר לתואר ראשון; ותוכנית Project SUPER באוניברסיטת רוטגרס עם מימון מענקים קטן למחקר לתואר ראשון.

הפניות:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). תקנת התמלול באיחוד זיכרון. ColdSpring Harbor Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 ו-mper2 חיוניים לאיפוס רגיל של השעון הצירקדי. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). הניאוקורטקס החושי והזיכרון האסוציאטיבי. Behavioral Neuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). פונקציות דיפרנציאליות של mPer1, mPer2 ו-mPer3 בשעון הצירקדי של SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). אינדוקציה של זיכרון פיזיולוגי בקליפת המוח על ידי גירוי של הגרעין בזליס. הליכים של האקדמיה הלאומית למדעים של ארצות הברית של אמריקה, 93(20), 11219-11224. דוי:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). רשתות פרינורון בקליפת המוח החושית של מבוגרים נחוצות ללמידת פחד. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

ברטה, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . הוא, DZ (2018). RNA-seq transcriptomicanalysis של תאי שיער באוזן הפנימית של דג זברה בוגרים. נתונים מדעיים, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). התפקיד של דה-מתילציה של DNA תלוי-פעילות במוח הבוגר והפרעות נוירולוגיות. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). עיכוב היסטון Deacetylase באמצעות RGFP966 משחרר את הבלמים על גמישות קורטיקלית חושית והספציפיות של היווצרות זיכרון. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

בראון, MR, & Kaczmarek, LK (2011). אפנון תעלות אשלגן ועיבוד שמיעתי.Hearing Research, 279(1-2), 32-42. דוי:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 מונע חסימת פוטנציאל ארוכת טווח והפחתה של NeuromodulatorExpression הנגרמת על ידי A 1-42 והפעלת JNK. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com