גוסיפיטרין, פלבנואיד המופיע באופן טבעי, מחליש את הנזק הנוירוני והמיטוכונדריאלי המושרה על ידי ברזל: חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.5. איתור קומפלקסים של Gos-Fe(I).

השערה סבירה להסבר התוצאות לעיל היא שגוס יוצר קומפלקס חולף עם Fe(ll) שמקל על חמצונו על ידי חמצן. קומפלקס מעבר זה יכול להעביר את האלקטרונים שלו בקלות רבה יותר מאשר Fe()-citrate, וליצור קומפלקס יציב יותר עם Fe(Ill). איור 6A מציג ספקטרום טיפוסי של Gos עם ספיגה מקסימלית ב-276, 332 ו-380 ננומטר (קו שחור). התוספת של Fe() גרמה לירידה תלוית ריכוז בפסגות הספיגה המקסימליות והופעה של חדש ליד 500 ננומטר (איור 6A). התרחשות של מערך ספקטרום שמקורו בספקטרום ה-Gos אושרה על ידי נוכחות של נקודה איזובסטית ב-λiso=405 ננומטר (ראו נקודות שחורות), מה שמצביע על שיווי משקל כימי (מורכבות) בין גוס חופשי למורכב. התוספת (איור 6A) מראה את היווצרותו של קומפלקס עם סטוכיומטריה 2:1 (גוס-ברזל). הסטוכיומטריה של קומפלקסים מסוג גוס-ברזל נקבעה בשיטת איוב המראה נקודת שבירה ביחס מולרי של 0.5.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

ראיות נוספות על המתאם בין ברזל לגוס הושגו על ידי ספקטרוסקופיה IR (איור 6B). עבור Gos החופשי וקומפלקס הברזל שלו, הפס הרחב שנמצא בטווח של 3000-4000 ס"מ נחשב כמתיחה של מימן- קבוצות הידרוקסיל קשורות עקב נוכחות מולקולות מים. מצב המתיחה v(C=O) של ה-Gos החופשי מתרחש ב-1654 ס"מ-I, אשר הוסט לעבר היווצרות מורכבות של 1636 ס"מ-איפון. תוצאה זו מציעה כי Fe(Ⅱ) נמצא בקורלציה לחמצן קרבוניל [31]. יתרה מכך, הנוכחות של רטט המתיחה v(Fe-O) ב-630 ס"מ-I מחזקת את היווצרות תסביך הברזל-גוס, מכיוון ש-Gos החופשי אינו מציג רצועה כזו.

איור 6.(A) השפעות של Fe(II) על ספקטרום ה-UV-VIS של Gos (200-600 ננומטר). תערובת דגירה המכילה 125 מ"מ סוכרוז, 65 מ"מ KCl, חיץ HEPES 10 (pH 7.2), 2 מ"מ ציטראט ו- Gos 1.6 מיקרומטר. הריכוזים של Fe（I） מלמעלה למטה היו עקבות {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96, ו-1.12 μM.Inset∶ העלילה של איוב למתחם Gos-Fe（II） בריכוז כולל קבוע 【Fe（D）】 בתוספת 【Gos】=1.6 מיקרומטר. הנקודה השחורה מציינת את הנקודה האיזובסטית. החצים כלפי מטה ולמעלה מצביעים על ירידה ועלייה בערכי הספיגה ב-380 ו-500 ננומטר, בהתאמה. ניסויים נערכו ב-28 מעלות. מהירות הסריקה הייתה 2nm/sA. קו הבסיס נקבע עם תערובת הדגירה בתוספת 1.6 מיקרומטר Fe（I）.（B）ספקטרום אינפרא אדום של Gos ו-Gos-Fe（I）. מוצגות דוגמאות אופייניות.

2.6. Gos מנע הפחתת Fe(III) על ידי אסקורבט

מצב הברזל המקודם על ידי Gos מייצג מנגנון נוגד חמצון סביר שכן הוא מעכב את הפעילות הקטליטית של Fe(II). עם זאת, עדיין ניתן היה לצמצם את Fe(III) שוב לצורתו הברזלית על ידי חומרים מפחיתים טבעיים כמו אסקורבט. האחרון יכול לטעון מחדש מערכות ביולוגיות ב-Fe(II), המשתתף בתגובות פנטון-הבר-וייס, ויוצר את הרדיקל ה-OH תגובתי במיוחד. כדי לבחון את האפשרויות הללו, השתמשנו ב-1,10-phenanthroline כדי למדוד את רמות היווצרות Fe（II） מתמיסת Gos (100 מיקרומטר) שטופלה ב-2 mM אסקורבט ובריכוזי Fe（II） שונים ({{6} } מיקרומטר. איור 7 מראה שהיעדר Gos אפשר קצב הפחתה מקסימלי של Fe(II) ל-Fe(II) (קו שחור עם שיפוע של 5.85×10-3); אולם תהליך זה הואט על ידי נוכחות של Gos (1-דקה דגירה, קו ירוק), ולאחר 5 דקות של דגירה עם Gos, קצב ההפחתה של Fe(I) על ידי אסקורבט ירד כמעט פי 3 (קו אדום עם שיפוע של 2.04× 10-3). תוצאה זו מראה את היכולת של Gos לעכב את הפחתת Fe() בתיווך אסקורבט ל-Fe(I)

איור 7. Gos מעכב הפחתת Fe(ⅢI) על ידי אסקורבט בהיעדר מיטוכונדריה של כבד חולדה. תנאי ניסוי: 125 מ"מ סוכרוז, 65 מ"מ KCl, חיץ HEPES 10 מ"מ (pH7.2), 1 מ"מ ציטראט, Gos 100 מיקרומטר. ניסויים נערכו ב-28 מעלות. Ascorbate (4 mM) ו-5 mM 1,10-phenanthroline נוספו לאחר דקה אחת או 5 דקות של דגירה של Gos-Fe(I). קווים מייצגים שלושה מבחני.

2.7. Gos מגן מפני 2-התפרקות חמצונית Deoxyribose

כדי לתעד את יכולתו של Gos לפעול בעדיפות על ברזל במקום על רדיקלים חופשיים, בוצעו מחקרי תחרות כדי להעריך את היעילות של Gos ו-2·OH מנקי (DMSO וסליצילאט) בהגנה על 2.8 או 28 מ"מ 2-דאוקסיריבוז מברזל. -נזק חמצוני מתווך (איור 8). מנקי ה-OH ב-20 מ"מ הגנו על 28 מ"מ 2-דאוקסיריבוז פחות מ-2.8 מ"מ2-דאוקסיריבוז (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

איור 8. ההשפעה של גוסי ו-OH שואבי דימתיל sulfoxide (DMSO) וסליצילאט על נזק חמצוני ל-2.8 או 28 mM 2-deoxyribose המושרה על ידי Fe(II)-EDTA בתוספת אסקורבט. התמיסות הודגרו במשך 30 דקות ב-37 מעלות והכילו 10 מ"מ חיץ פוספט (pH7.2), 2-דאוקסיריבוז (2.8 או 28 מ"מ), 150 מיקרומטר EDTA ו-50 מיקרומטר Fe (ⅢI） התגובות התחילו על ידי הוספת אסקורבט לריכוז סופי של 2 מ"מ. הפסים מראים ממוצע ±SD (n=3). בקרות מכילות רק DMSO (0.001 אחוז), שהוא ריכוז הממס בדגימות Gos. מבחן t חד-זנב שימש עבור*p<0.05, n.s.,="">

3. דיון

הברזל המשתחרר בכמה מצבים נוירודגנרטיביים, כולל שבץ איסכמי ודימומי, מעורר דה-וויסות של הומאוסטזיס של ברזל במוח, מה שמוביל לפתופיזיולוגיה של פגיעה נוירולוגית [4,32-34]. ברמות תת-תאיות, נראה כי פגיעה במיטוכונדריה מעורבת במוות נוירוני מתיווך ברזל [10,15,35-38]. עדויות פרה-קליניות תומכות ביתרון של שימוש ב-chelators של ברזל, בעיקר deferoxamine mesylate, נגד ניוון עצבי כולל כל סוגי השבץ [7,16]. עם זאת, העלות הגבוהה שלהם ואי-זמינותם, והמגוון הרחב של ההשפעות השליליות של קלאטורי ברזל קלאסיים, הובילו לשימוש בקלאטורים טבעיים לניהול ברזל בדיסהומאוסטזיס [39,40].

Cistanche יכול לשפר את החסינות

פעולת ההגנה של Gos מוצגת על תאי HT-22 ומיטוכונדריה של מוח חולדה שהודגרו עם תערובת ברזל/ציטראט, שם מצאנו הגנה חזקה מפני נזק חמצוני הנגרם על ידי ברזל. תאי HT-22 בהיפוקמפוס של עכברים שנחשפו לעומס יתר של ברזל (24 שעות) הראו ירידה בכדאיות, אשר הייתה קשורה קשר הדוק לפיזור מוקדם של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי והפחתת ATP (איור 2A-C, בהתאמה). זה מצביע על כך שפגיעה במיטוכונדריה תורמת לתמותה נוירונלית. ואכן, בתנאים שלנו, לפחות חלק מה-Fe(II) שהועלה לנוירונים צפוי להגיע לאברונים, שכן למוות נוירוני שנגרם על ידי ברזל קדם אובדן תפקוד המיטוכונדריה. לפיכך, הוכח שעומס ברזל גורם למוות תאי HT-22 בהיפוקמפוס של עכברים ולפיצול מיטוכונדריאלי [41,42]. באופן דומה, חשיפה מתמשכת לברזל מגבירה את רמות ROS המיטוכונדריות בתאי נוירובלסטומה דופמינרגית SHSY5Y [43]. יתר על כן, זרימת ברזל נרחבת לנוירונים בהיפוקמפוס, כמו גם נזק למיטוכונדריה, אומתו לאחר החשיפה ל-100 uM ברזל ברזל [36]. כאן ראינו שהשימור המושרה על ידי Gos של הכדאיות של נוירוני ההיפוקמפוס המושפעים מברזל קשור קשר הדוק לשימור פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות ה-ATP שלהם.

כמו בתאים שלמים, החשיפה הישירה של המיטוכונדריה לברזל ברזל עוררה נפיחות נרחבת של האברון, פיזור פוטנציאל הממברנה ואובדן ATP (איור 3A-C, בהתאמה). במסגרת ניסוי זו, Gos הצליח להגן על מיטוכונדריה עמוסת ברזל, שהתבטאה בשימור הפרמטרים הנ"ל. במובן זה, נצפתה שמיטוכונדריה הטעונות בריכוז מיקרומולרי של ברזל עברו פתיחת נקבוביות חדירות מיטוכונדריאלית ופיזור △Y באופן רגיש לקלציה של ברזל אך לא תלוי בפעולה נוגדת חמצון של קטלאז |44]. מעניין לציין כי נוגד החמצון Mito-Tempo מגן מפני נזקי עומס ברזל בנוירונים בהיפוקמפוס על ידי ניקוי רדיקל האניון הסופראוקסיד המיטוכונדריאלי ושימור שלמות מורפולוגית ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי [36]. לאחרונה תיארנו את ההשפעות נוגדות החמצון של הפלבנואיד הזה ואת יכולתו להגן על תאי PC12 מפני מוות כתוצאה מהיפוקסיה כימית [29], שם הגיע למסקנה כי ניקוי הרדיקלים החופשיים והיכולת נוגדת החמצון של Gos מעורבים בחלקם בהגנה מפני ברזל. HT-22 ונזק מיטוכונדריאלי. עם זאת, היעילות המשופרת של Gos נגד lipoperoxidation בתיווך ברזל לעומת lipoperoxidation בתיווך tertbutyl hydroperoxide (איור 4A,B, בהתאמה) מרמזת מאוד על כך שיכולת אינטראקציה עם הברזל שלו היא המנגנון העיקרי נגד נזק שנגרם על ידי ברזל.

כדי לאפיין את האינטראקציה Gos-Fe עוד יותר, בוצעו מספר ניסויים ללא תאים וללא מיטוכונדריה. ראינו שכאשר פוליפנול הודגרה יחד עם Fe (II), ריכוז יוני המתכת יורד, בעוד שהייתה עלייה מקבילה בקצב צריכת החמצן (איור 5A-C). השפעות אלו מצביעות על כך שגוס מסיר את Fe(II) מתסביך הציטראט, ומחמצן אותו לצורת ברזל בתהליך הדורש O2 כמקבל אלקטרונים. כתוצאה מכך, Gos מקדם את הירידה בריכוז Fe(II) שעלול להפריע לרדיקלי ההידרוקסיל באמצעות תגובות פנטון. מאחר שקומפלקס Gos-Fe(II) מאפשר חמצון של חומרים מפחיתים רלוונטיים כגון אסקורבט, וכתוצאה מכך היווצרות/התחדשות של Fe(II), הצלחנו להדגים ש-Gos מעכב את ההפחתה בתיווך אסקורבט של Fe(II) ל-Fe(II).

ההשערה שגוס מקיים אינטראקציה חזקה עם ברזל אוששה כאן גם באמצעות טכניקות ספקטרוסקופיות, ואימתה תוצאות קודמות שבהן מערכים שונים של

סטוכיומטריית קומפלקס גוס-ברזל התאפיינה בספקטרוסקופיה מסה יינון ספין אלקטרוני [45].

תוצאות אלו הוכיחו את ההשפעות המגנות של Gos מפני נזק נוירוני בתיווך ברזל, כנראה על ידי אינטראקציה עם יוני ברזל, מה שמפריע למעורבותו ביצירת מיני חמצן תגובתי קטליטי. יתר על כן, הדבר מרמז על היווצרות של קומפלקס העברת מטען חולף בין Fe(Ⅱ) ו-Gos, האצת חמצון Fe(II) ויצירת קומפלקס Fe(III)-Gos יציב יותר שאינו יכול להשתתף בשלב ההתפשטות של שומנים. חמצון. יתרה מכך, חומר מפחית רלוונטי מבחינה ביולוגית כגון אסקורבט לא הצליח להפחית ברזל ברזל בנוכחות Gos, מה שמגביל מאפיינים פרו-אוקסידנטים של פלבנואידים מסוימים המעורבים במחזור המחזור של יוני ברזל. [30]. Gos בריכוזים מיקרו-מולריים היה יעיל יותר מחומרי נבלות קלאסיים במניעה מראש של חמצון בתיווך ברזל של 2-דאוקסיריבוז. יעילות גבוהה זו עשויה להיות מיוחסת להיווצרות של Gos-Fe(II)/() פעיל חיזור, כפי שצפינו בעבר עבור פוליפנולים אחרים ששיפרו את הביצועים שלהם כנוגדי חמצון עם האינטראקציה שלהם עם ברזל בפרדיגמות שונות במבחנה של נזק חמצוני [ 22,46-48].

הוכח כי חומרי קלאט המכילים חמצן בתור ליגנד (אוקסו ליגנד, O2-) יכולים להכשיר ברזל ולקדם את החמצון של Fe(I), התייצבות של Fe(II), וכתוצאה מכך לייצר ירידה ב פוטנציאל ההפחתה שלו49]. ב-pH פיזיולוגי, קטכולים יוצרים בקלות קומפלקסים ביס יציבים מבחינה תרמודינמית עם ברזל ברזל, המועדפים על ידי ריכוזים נמוכים של הליגנדים. הנוכחות של חלק קטכול במבנה Gos מרמזת על מנגנון אינטראקציה דומה עם ברזל, שיכול להסביר את ההגנה המושגת מפני נזק שנגרם על ידי ברזל של תאי עצב ומיטוכונדריה. בהקשר זה, הדגמנו בעבר שגם מנגיפרין וגוטיפרון A מעוררים חמצון ברזל ברזל ומעכבים הפחתת ברזל ברזל [23,24,26-28].

היכולת של Gos לקלאט ברזל עשויה גם לעורר מסלולי איתות התורמים להגנה עצבית. לדוגמה, אנזימים של תחום הפרוליל הידרוקסילאז (PHD), האנזימים הקלאסי Hypoxia Inducible Factor-lalpha(HIF-1o) המשתנים הידרוקסילציה תחת נורמוקסיה, זוהו כמטרות קריטיות של chelators ברזל המועילים קלינית ברבים הפרעות נוירולוגיות [50,51]. זה מובן שכן PHD תלוי בברזל דו ערכי כגורם צימוד [52]. מספר גנים שהיו מעורבים בהגנה עצבית מוסדרים על ידי HIF-la, כגון eNOS, VEGF ו-EPO[53]. יתר על כן, הפעלת HIF הנובעת מעיכוב PHD יכולה למנוע פגיעה במיטוכונדריה בתיווך מתח חמצוני ואפופטוזיס, ללא תלות בתפקידו כגורם שעתוק [54].

פרופטוזיס, מוות תאים מווסת תלוי-ברזל שאופיין לאחרונה, הוצע כמנגנון שדרכו מתים הנוירונים שנחשפו לנזק דימומי [8]. תפקוד לקוי של המיטוכונדריאלי היה קשור לאחרונה למוות תאי פרופטוזיס [55]. לכן, עיכוב פרופטוזיס, החוסך תפקוד מיטוכונדריאלי מנזק ברזל, יכול להיות גם מנגנון סביר להגנה עצבית מפני הפרעות נוירולוגיות מתווכות ברזל המוגנות על ידי Gos, אשר ראויות לתשומת לב נוספת. יש לבצע מחקר נוסף על ההשפעות המועילות המשוערות של Gos על מודלים של בעלי חיים in vivo של ניוון עצבי הקשור לברזל, על מנת להציע את הפלבנואיד הזה כהתערבות טיפולית נגד נזק לרקמת המוח שנגרם על ידי דה-וויסות הומאוסטזיס של ברזל.