Gomisin N מעכב מלנוגנזה באמצעות ויסות מסלולי האותות PI3K/Akt ו-MAPK/ERK במלנוציטים

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

תַקצִיר: גומיסין נ, אחת מתרכובות הליגנן שנמצאו ב-Schisander Chinensis הוכחה כבעלת פעילויות נוגדות חמצון, אנטי גידוליות ואנטי דלקתיות במחקרים שונים. כאן אנו מדווחים, לראשונה, על היעילות האנטי-מלנוגנית של Gomisin N ביונקים תאים כמו גם בעוברי דג הזברה. Gomisin N הפחית משמעותית את תכולת המלנין ללא רעילות תאית. למרות שהוא לא היה מסוגל לווסת את הפעילות הקטליטית של פטריותטירוזינאזבַּמַבחֵנָה,גומיסין נהוריד את רמות הביטוי של חלבוני מפתח שמתפקדיםמלנוגנזה. Gomisin N מווסת מטה קולטן למלנוקורטין 1 (MC1R), אדניליל ציקלאז 2, גורם שעתוק הקשור למיקרופטלמיה (MITF), טירוזינאז,טירוזינאזחלבון קשור-1(TRP-1), וחלבון הקשור לטירוזינאז-2 (TRP-2). בנוסף, תאי Melan-A שטופלו ב-Gomisin N הראו רמות מוגברות של p-Akt ו-p-ERK, מה שמרמז שההפעלה של מסלולי PI3K/Akt ו-MAPK/ERK עשויה לתפקד כדי לעכבמלנוגנזה. כמו כן, אימתנו שגומיסין N הפחית את ייצור המלנין על ידי דיכוי הביטוי של MITF,טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2בתאי עכברים ותאים אנושיים וכן בפיתוח עוברי דג זברה. ביחד, אנחנו מסיקים את זהגומיסין נמעכב את סינתזת המלנין על ידי דיכוי הביטוי של MITF ו-melanogenicenzymes, כנראה באמצעות אפנון מסלולי PI3K/Akt ו-MAPK/ERK.

מילות מפתח:Schisandra Chiensis;גומיסין נ; לינאן;מלנוגנזה; הלבנת עור

ל-cistanche יש פונקציית הלבנת עור

1. הקדמה

מלנין הוא פיגמנט המצוי ברוב איברי בעלי החיים כולל עור, שיער, עיניים, אוזן פנימית, עצמות, לב ומוח [1,2].מלנוגנזההוא תהליך מורכב שבו מעורבים מסלולי איתות מרובים. הקולטן למלנוקורטין 1 (MC1R) הוא מווסת מפתח במלנוגנזה, מאותת דרך הליגנדים שלו כגון הורמון מגרה מלנוציטים (MSH) והורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH) [3]. מלנין העור עובר סינתזה ביולוגית על ידי מלנוציטים באפידרמיס ולאחר מכן מועבר לקרטינוציטים, שם הם ממלאים תפקידים חשובים בהגנה על העור על ידי ספיגת קרינת UV מאור השמש וניקוי רדיקלים חופשיים תגובתיים [4,5]. סינתזה והעברה של מלנין בעור ובזקיקי השיער מווסתת על ידי הזמינות של חומרי המוצא שלו [6]. L-tyrosine ו-L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA), מצעים עיקריים של אנזימים מלנוגניים, מתפקדים גם כמווסתים דמויי הורמונים במלנוגנזה [7]. מצד שני, ייצור יתר של מלנין גורם לבעיות עור לא רצויות כמו נמשים ומלזמה [8,9]. מלנוגנזה יכולה להשפיע על ההתנהגות של מלנוציטים נורמליים וממאירים על ידי אפנון התכונות האלסטיות של התאים [10]. למרות שהקולטנים לסרוטונין ומלטונין המתבטאים בתאים עוריים ממלאים תפקיד מפתח בשמירה על הומיאוסטזיס תאי, ייצור מוגזם של מלנין באמצעות שינויים הורמונליים בלתי מבוקרים עלול לגרום למצבים פתולוגיים בעור [11].

לפיכך, נעשו מאמצים נרחבים להבהיר מנגנונים מולקולריים השולטים במלנוגנזה כשלב העיקרי לטיפול בהפרעות עור היפרפיגמנטריות. בנוסף, סוגים שונים שלהלבנת עורגורמים המעכבים את סינתזת המלנין זוהו מתמציות צמחיות ולא צמחיות ונעשה בהם שימוש מסחרי במוצרי קוסמטיקה [12,13]. חומרי ההלבנה הנפוצים ביותר כוללים הידרוקינון, מקונול, ארבוטין, חומצה קוג'ית, חומצה אסקורבית ורטינואייקאציד [12,14]. עם זאת, ישנן מגבלות שונות לשימוש בהם בטיפול בתסמינים חריפים או כרוניים של היפרפיגמנטציה בבני אדם. לדוגמה, הידרוקינון, למרות שהוא שימש זמן רב לדיפיגמנטציה מאז שנות ה-60, עלול לגרום לגירוי בעור ולדלקת עור ממגע [15,16]. זה גם מוביל לנזק ל-DNA על ידי הגברת הייצור של מיני חמצן תגובתיים ופיתוח של אוכרונוזה אקסוגנית בתאי יונקים [17,18]. אחרים ידועיםטירוזינאזלמעכבים כגון חומצה קוג'ית וחומצה אסקורבית יש לא רק חדירת עור גרועה, יציבות ויעילות הלבנה, אלא גם יכולים לגרום לציטוטוקסיות, דרמטיטיס ואריתמה משימוש ארוך טווח [19,20]. בהקשר זה, יש צורך גובר בפיתוח חומרי הלבנה בטוחים ויעילים יותר לטיפול בהיפרפיגמנטציה של העור האנושי. צמחי מרפא טבעיים המשמשים ברפואה מסורתית עשויים לספק מקורות חלופיים לזיהוי חומרי הלבנה חדשים השולטים בשלבי מפתח במלנוגנזהעם פחות או ללא תופעות לוואי [21].

Schisandra chinensis, הידוע גם בשם פירות יער צפוניים בטעם עדין, נמצא באופן טבעי בצפון מזרח סין, במזרח הרחוק של רוסיה, ביפן ובקוריאה [22]. צמח זה שימש זמן רב לטיפול בעיוורון לילה, כוויות בעור, דלקות אספטיות ומחלות כבד ברפואה המזרחית המסורתית [23,24]. תמצית פרי S. chinensis ותרכובות הליגנן שלה הוכחו כבעלי השפעות פרמקולוגיות שונות בשורות תאים של עכברים. לדוגמה, ל-Schisander A ו-C יש השפעות נוגדות חמצון, בעוד של-Schisandra B יש פעילויות אנטי-פיברוטיות, אנטי-דלקתיות, נוגדות חמצון ואנטי-אפופטוטיות [25]. עוד תרכובת ליגניןגומיסין נ(איור 1A) דווח כי הוא מדכא אפופטוזיס הנגרמת על ידי מתח חמצוני על ידי עיכוב שחרור ציטוכרום C מהמיטוכונדריה לציטופלזמה, ביקוע של קספאז 3 ו-PARP, ומעבר חדירות המיטוכונדריאלי המושרה על ידי Ca2 פלוס בקרדיומיוציטים של חולדה H9c2 [7,8]. מעניין לציין כי מספר מחקרים המשתמשים במודלים של עכברים וקווי תאי עור אנושיים חשפו את הפוטנציאל הטיפולי של S. chinensis לטיפול בהפרעות עור. Lee et al. דיווח שתמצית המתנול של פרי S. chinensis הקלה על תסמיני מגע דרמטיטיס על ידי הפחתת הייצור של ציטוקינים מעודדי דלקת כגון TNF- ו-IFN- ביישום מקומי [8,24]. קאנג וחב'. הראה שתמצית מים Schisandra Fructus עיכבה את הפעלת IκB, ובכך דיכאה את הייצור של TNF-, IL-6 ו-GM-CSF בקו תאי הפיטום האנושי HMC-1 [26]. ממצאים אלה הובילו אותנו להנחה ש-S. chinensis lignans עשוי להשפיע על תפקוד תאי העור בצורה רחבה יותר. במחקר זה, ביקשנו לחקור את התפקידים המשוערים שלגומיסין נ, אחד הליגנאנים העיקריים ב-S. Chinensis, בוויסותמלנוגנזה, ובכך להעריך את השימוש הפוטנציאלי שלו כסוכן אקוסמוטי. הנה, אנו מדווחים על כךגומיסין נמעכב ביוסינתזה של מלנין ללא רעילות תאית בתאי אדם ועכברים, כמו גם בעוברי דג הזברה.

2. תוצאות

2.1. השפעות של גומיסין N על היווצרות מלנין וחיות תאים

כדי לאמת את ההשפעות של Gomisin N עלמלנוגנזה, טיפלנו במלנוציטים של עכברים עם ריכוזים שונים שלגומיסין נבמשך 72 שעות, ולאחר מכן העריכו שינויים בתכולת המלנין. טיפול בגומיסין הפחית את תכולת המלנין הן בקו תאי המלנוציטים הנורמלי Melan-A והן בתאי B16F10melanoma באופן תלוי מינון ללא רעילות תאית (איור 1B, C). ראינו ש-Gomisin N עיכב ייצור מלנין המושרה על ידי MSH בתאי B16F10, אשר היה בר השוואה לתוצאות שהושגו בטיפול ב-PTU [27] (איור 1C). כדי להעריך אם הפחתת המלנין עלגומיסין נהטיפול נובע מירידה בפעילות של טירוזינאז, ביצענו בדיקת L-DOPAstaining בתאי מלנוציט אפידרמיס אנושי נורמלי (NHEM). כפי שמוצג באיור 1E, תאי NHEM שטופלו ב-Gomisin N הראו רמות מופחתות של L-DOPA בהשוואה לתאים לא מטופלים. עם זאת, ההשפעה המעכבת של Gomisin N על ייצור המלנין לא הייתה משמעותית בתאי הומלנומה MNT-1 (איור 1D) .

2.2. השפעות של Gomisin N על פעילות טירוזינאז

לבחון האםגומיסין נמעכבטירוזינאזפעילות במבחנה, השתמשנו בטירוסינאז פטריות ובליזטים של תאי מלנומה B16. חומצה קוג'ית, מעכב טירוזינאז ידוע, שימשה כביקורת חיובית. כאשר טופלו בטירוזינאז פטריות, בעוד שחומצה קוג'ית הפחיתה באופן משמעותי את הפעילות האנזימטית, גומיסין N לא גרמה לשום שינוי בהמרה של L-DOPA לדופכרום (איור 2A). עם זאת, כאשר טופל בתאי מלנומה B16, גומיסין N הביא לירידה בטירוזינאזפעילות של lysate התא באופן תלוי מינון (איור 2B). יתר על כן, כאשר מטופלים יחד עם תאי -MSH inB16,גומיסין נהפך את העלייה בהיווצרות דופאכרום מגורה על ידי -MSH (איור 3C). יש לציין שגומיסין N נראה יעיל יותר מחומצה קוג'ית לעיכוב התאיפעילות טירוזינאזשל תאי B16 על גירוי -MSH. ממצאים אלה מרמזים שההשפעה המעכבת של GomisinN על ייצור המלנין שנצפתה בתאי עכברים ותאים אנושיים (איור 1) אינה נובעת מתפקידו לעכב ישירות את הפעילות הקטליטית של טירוזינאז. עם זאת, עדיין יתכן שגומיסין לא מווסת את הביטוי של טירוזינאז או חלבונים אחרים הממלאים תפקידי מפתח במלנוגנזה.

2.3. השפעות של Gomisin N על השבתת מסלול האותות MC1R

ביקשנו להבהיר את המנגנון הבסיסי האחראי להשפעה המעכבת של GomisinN על ייצור המלנין. נימקנו את זהגומיסין נעשוי לווסת חלבוני איתות המעורבים במלנוגנזהובכך לעכב את סינתזת המלנין. קולטן למלנוקורטין 1 (MC1R) הוא קולטן מצמד חלבוני G מסוג אמלנוציטי שמתפקד כמווסת מפתח בסינתזת המלנין. ההפעלה של MC1R על ידי הליגנד שלו -MSH או הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH) מובילה לעלייה ב-adenylyl cyclase, אשר בתורה מגבירה את רמות cAMP תוך תאי [2,3]. כתוצאה מכך, רמת התעתוק של MITF מוגברת באמצעות מסלול פרוטאין קינאז-C (PKA)/פרוטאין קשירת אלמנט מגיב (CREB) [2,28]. כדי להעריך את ההשפעה הרגולטורית של Gomisin N על מסלול האיתות MC1R, בדקנו את רמות הביטוי של MC1R ומולקולות האיתות שלו במורד הזרם לאחר טיפול בתאי Melan-A עם Gomisin N. ראינו ש- Gomisin N הוריד משמעותית את רמות החלבון של MC1R וגם של adenylyl cyclase 2 באופן תלוי מינון (איור 3A-C). כצפוי,גומיסין נתאים שטופלו הראו ירידה ברמות החלבון של MITF והמטרות הידועות שלו טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 (איור 3A, D-G). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-Gomisin N מעכב אנזימים מייצרי סמלנין על ידי השבתת MITF דרך מסלול האותות MC1R.

2.4. השפעות של Gomisin N על זרחון של Akt ו-ERK1/2 בתאי מלאן-A

המסלולים PI3K/Akt ו-MAPK/ERK ידועים כמעורבים במלנוגנזה על ידי וויסות תעתוק או פוסט-תעתוק של MITF [29,30]. כדי להעריך אם GomisinN משפיע על מסלולי איתות אלה, הערכנו את מצב הזרחון של ניתוח Akt ו-ERK1/2 byWestern blot. כפי שמוצג באיור 3H–J, טיפול במינון גבוה (30 מיקרומטר) שלגומיסין נשיפר משמעותית את הזרחון של Akt וגם של ERK. נתונים אלה מצביעים על כך שההשפעה המעכבת של Gomisin N עלמלנוגנזהצפוי להיות קשור למסלולים P13K/Akt ו-MAPK/ERK.

2.5. Gomisin N עיכב מלנוגנזה בעוברי דג זברה

לאחר מכן שאפנו לבחון האם Gomisin N יעיל בעיכובמלנוגנזהin vivo. עד סוף זה, טיפלנו בעוברי דג זברה עם Gomisin N במשך 72 שעות בריכוזים של 1, 10, 20 ו-30 מיקרומטר, ולאחר מכן מדדנו רמות ביטוי של חלבונים מלנוגניים. ראינו שטיפול בגומיסין N מעכב יצירת מלנין בפיתוח עוברי דג זברה.גומיסין נעוברים שטופלו הראו הפחתה בתכולת המלנין באופן תלוי ריכוז בהשוואה לבקרה הלא מטופלת (איור 4). מצאנו גם שרמות החלבון שלטירוזינאז, MITF, TRP-1 ו-TRP-2 הופחתו על ידי טיפול Gomisin N (איור 5). תוצאות אלו מראות שגומיסין N מעכב את המלנוגנזה in vivo על ידי ויסות גורם השעתוק MITF והמטרות שלוטירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2.

2.6. Gomisin N הפך את המלנוגנזה המושרה על ידי Rapamycin ב-MNT אנושי-1

למרות שגומיסין N עיכב משמעותיתמלנוגנזהבתאי Melan-A ו-B16 וכן בעוברי דג אינזברה, לא ראינו את השפעתו על תאי מלנומה MNT-1 אנושיים. ציפינו שההשפעה של Gomisin N עשויה להיות ניתנת לזיהוי בתאי MNT-1 במצב שבו המלנוגנזה מווסתת על ידי גירוי מתאים. הוכח כי Rapamycin משרה מלנוגנזה על ידי הגברת פעילות טירוזינאז ורמות החלבון של MITF, טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 [31], חלקית באמצעות הפעלה של אוטופגיה [32]. עקבנו אחר הרמות שלטירוזינאז, MITF,TRP-1 ו-TRP-2 בתאי MNT-1 על ידי ניתוח Western blot, לאחר טיפול משותף עם Gomisin N andrapamycin. טיפול ברפמיצין גרם משמעותית לרמות MITF, TRP-1 ו-TRP-2 אך לא השפיע עלטירוזינאזרמות (איור 6). עם זאת, טיפול ב-Gomisin N הפך משמעותית את ההשפעות של rapamycin על MITF, TRP-1 ו-TRP-2 באופן תלוי ריכוז. ההשפעה ההפוכה שלגומיסין ננגד rapamycin היה מבטיח יותר בריכוז של 20 ו-30 µM מאשר 10 µM. תוצאות אלו מצביעות על כך שגומיסין N מעכבמלנוגנזהבתאי המלנומה האנושיים MNT-1 על ידי ויסות גורם השעתוק MITF והמטרות שלו TRP-1 ו-TRP-2.

3. דיון

תפקידו העיקרי של המלנין הוא להגן על תאי העור מפני קרינת UV [33-35]. היפרפיגמנטציה, תוצאה של ייצור יתר של מלנין בעור, גורמת לחששות קוסמטיים לא רצויים וקשורה לדרמטיטיס ולסרטן העור. כמה דוחות הציעומלנוגנזהכיעד חשוב לטיפול במלנומה גרורתית [36,37]. לפיכך, יש צורך גובר בפיתוח חומרים אנטי-מלנוגניים המווסתים מלנוגנזה ללא רעילות תאית [38]. ישנם מספר מסלולים המעורבים במלנוגנזה של העור [39,40]. עם קישור ליגנד, MC1R משפר את הפעילות של אדניליל ציקלאז, אשר לאחר מכן מגביר את הרמות התוך-תאיות של cAMP [41,42]. ההפעלה התלויה ב-cAMP של מסלול PKA/CREB דווחה רבות כדי להגביר את רמות התעתיק של MITF, ובכך לשפר את סינתזת המלנין [43]. MITF מתפקד כמווסת ראשי של שלושת האנזימים המלנוגניים העיקריים טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2בחולייתנים [3,21,44]. אנזימים אלו הם חלבונים טרנסממברניים הממוקמים בממברנה המלנוזומאלית של המלנוציטים. טירוזינאז מסדיר את השלב המגביל את הקצבמלנוגנזהעל ידי המרת L-tyrosinase ל-L-DOPA [23]. TRP-1 ו-TRP-2 ממלאים גם הם תפקידים חשובים בסינתזה של מלנין, אם כי הפונקציות שלהם לא מובנות במלואן.

במחקר זה, Gomisin N, תרכובת ליגנן של S. chinensis הראתה פעילות של דה-פיגמנטציה ללא רעילות תאית. Gomisin N עיכב את סינתזת המלנין בשורות תאים יונקים בתרבית וכן בעוברי דג זברה. נראה כי Gomisin N יעיל יותר מהביקורת החיובית PTU המעכבת ייצור מלנין בתאי Melan-A (איור 1B). Gomisin N הפחית את תכולת המלנין באופן תלוי ריכוז. בהשוואה לקבוצת הביקורת הלא מטופלת, 10 מיקרומטר שלגומיסין נהפחית את תכולת המלנין בכ-40 אחוז, ללא רעילות תאית. הפעילות האנטי-מלנוגנית של 10-µM Gomisin N הייתה דומה לזו של 100-µM PTU בתאי Melan-A. באופן דומה, גומיסין נראתה חזק יותר מ-PTU בתאי B16F10 המופעלים על ידי -MSH, כאשר ההשפעות של 5- ו-10-µM Gomisin N היו דומות לאלו של 10- ו-{{12 }}µM PTU, בהתאמה (איור 1C). תאי NHEM שטופלו ב-Gomisin N הפגינו רמות מופחתות של L-DOPA, מה שמרמז ש-GomisinN מעכבטירוזינאזפעילות בתאים מתורבתים (איור 1E). ממצאים אלה הובילו אותנו לחקור עוד יותר את המנגנון הבסיסי שבאמצעותו Gomisin N מעכב מלנוגנזה.

בדקנו האםגומיסין נמווסת ישירות את הפעילות הקטליטית שלטירוזינאזin vitro. בניגוד לחומצה Kojic, Gomisin N לא הראה השפעות מעכבות על פעילות טירוזינאז פטריות (איור 2A). עם זאת, פעילות ה-tyrosinase הסלולרית בליזטים של תאי מלנומה B16 הייתה מווסתת משמעותית על ידי Gomisin N גם עם ובלי טיפול -MSH (איור 2B,C). עיכוב פעילות טירוזינאז תאית של Gomisin N לאחר גירוי -MSH נמצאה משמעותית יותר מזו של חומצת קוג'יק הביקורת החיובית (איור 2C).

הנחנו שהתפקוד האנטי-מלנוגני של גומיסין N עשוי להתרחש באמצעות ויסות תעתיק או פוסט-תעתוק של חלבונים הקשורים לטירוזינאז וחלבונים (TRPs). כדי לאמת זאת, מדדנו רמות ביטוי של מולקולות איתות במסלול MC1R, גורם מכריע עבור כמות ואיכות ייצור המלנין במלנוציטים. כצפוי, ראינו שגומיסין N הפחית את הרמות של MC1R ו-Adenylyl cyclases 2 בתאי Melan-A (איור 3A-C). יתר על כן,גומיסין נהוריד את הביטוי של MITF וחלבוני היעד שלו, כולל טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2 (איור 3A,D-G). תוצאות אלו מצביעות על כך שהרמות המופחתות של תכולת המלנין בטיפול ב-Gomisin N נובעות מהשבתת מסלול MC1R.

מצד שני, המסלולים PI3K/Akt ו-MAPK/ERK יכולים לזרחן MITF, ועל ידי כך יכולים לשנות את פעילותו פוסט-תעתיק [45]. עם זאת, ההשפעה הכוללת של ההפעלה של מסלולי PI3K/Akt ו-MAPK/ERK במלנוגנזהשנוי במחלוקת. שני המסלולים PI3K/Akt ו-MAPK/ERK מופעלים באופן מכונן במלנומות אנושיות עקב מוטציות שהצטברו [46]. ידוע שדיפיגמנטציה בתיווך C2-סרמיד בתאי Mel-Ab מתרחשת באמצעות הפחתה ברמות p-Akt [47]. ישנן מספר תרכובות טבעיות המפעילות את מלנוגנזה על ידי הגברת רמות p-ERK בתאי מלנומה B16 [28]. לעומת זאת, יש גם עדויות לכך שרמות גבוהות של p-ERK ו-p-Akt מעכבות את סינתזת המלנין [28,48]. ניתן להסביר חלקית את אי-ויסות המורכבות של מלנוגנזה על ידי העובדה שזרחון משפר את פעילות התעתיק של MITF, אך בו-זמנית גורם לפירוק Ubiquition-פרוטוזום תלוי של MITF [26,49-51]. הנתונים שלנו הראו כי גם רמות p-Akt וגם רמות p-ERK היו מווסתות בתאי Melan-A שטופלו ב-Gomisin N (איור 3H-J). זה מרמז שמסלולי PI3K/Akt ו-MAPK/ERK עשויים לתרום לעיכוב ייצור המלנין.

עוד אימתנו את הפעילות האנטי-מלנוגנית של Gomisin N במודל דג הזברה in vivo. עוברי דג הזברה שטופלו ב-Gomisin N הראו הפחתה משמעותית בפיגמנטציה של מלנין (איור 4). בנוסף, Gomisin N הפחית באופן ניכר את הרמות שלטירוזינאז, MITF, TRP-1 ו-TRP-2 בפיתוח עוברי דג זברה. ממצאים אלה מצביעים על כך ביחדגומיסין נגורם לדה-פיגמנטציה על ידי הורדת הביטוי של MITF ואנזימים מלנוגניים in vivo. הפעילות האנטי-מלנוגנית של Gomisin N אושרה עוד יותר בתאי מלנומה MNT-1 אנושיים שגוירו על ידי rapamycin. למרות שגומיסין N הביא רק לשינויים קטנים בתכולת המלנין בתאי MNT-1 (איור 1D), הוא היה יעיל להפוך את הרגולציה המושרה על ידי rapamycin של MITF, TRP-1 ו-TRP-2 ב באופן תלוי ריכוז (איור 6A,C-E). ביחד, ההשפעה הרגולטורית שלגומיסין נעל MITF ואנזימים מלנוגניים נמצאו באופן שחזור בתאים של עכברים ובני אדם וכן בעוברי דג זברה.

לסיכום, עבודה זו מציעה שלגומיסין N עשוי להיות פוטנציאל גבוה כרומןהלבנת עורסוֹכֵן. נראה כי גומיסין N מעכבמלנוגנזהעל ידי דיכוי הביטוי של MITF דרך מסלול MC1R, במקום לווסת ישירה של הפעילות הקטליטית שלטירוזינאזו-TRPs. למרות שמנגנונים מפורטים נותרו להבהיר, סביר להניח שדפיגמנטציה הנגרמת על ידי Gomisin N קשורה להפעלה של מסלולי PI3K/Akt ו-MAPK/ERK (איור 7).

4. חומרים ושיטות

4.1. חומרים

RPMI1640 נרכש מחברת Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, ארה"ב). ה-Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין (PS) נרכשו מהיקלון (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב). מצע גידול מלנוציטים נרכש מ-PromoCell (Heidelberg, גרמניה). Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-אצטט(TPA), חומצה קוג'ית, 1-פניל-2-תיאוריאה (PTU), טירוזינאז פטריות, 3,{{ 9}}דיהידרוקסי-ל-פנילאלנין(L-DOPA), -MSH, דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ופאראפורמלדהיד נרכשו מ-SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, ארה"ב).גומיסין נהמתחם סופק על ידי צ'ול יאנג קים (אוניברסיטת האניאנג, אנסאן, קוריאה). Rapamycin נרכש מ-Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ארה"ב).

4.2. תרבית תאים

שורת תאי המלנומה של העכבר B16F10 סופקה מהבנק הקוריאני Cell Line Bank (סיאול, קוריאה). תאי מלנוציט מלנוצית עכברים [52] היו מתנה נדיבה מד"ר Byeong Gon Lee (המכון למחקר עור, Amore Pacific Co., Yongin) -סי, קוריאה). תאי מלנומה מסוג MNT-1 אנושיים סופקו בנדיבות על ידי Aeyeong Lee (קולאז' לרפואה באוניברסיטת Dongguk, Goyang-si, קוריאה). מלנוציטים אפידרמיס אנושיים נורמליים ראשוניים (NHEM) נרכשו מ-PromoCell (Heidelberg, גרמניה). תאי Melan-A גודלו במדיום RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, ארה"ב) בתוספת של 10 אחוז FBS, 1 אחוז PS ו-200 ננומטר TPA. DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS ו-1 אחוז PS שימש לשמירה על תאי Melan-A ותאי NHEM. כל התאים הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5 אחוז CO2.

4.3. מדידת תכולת המלנין

תאי מלאן-A נזרעו בצלחת 24-באר (1 × 105 תאים/באר), שטופלה עםגומיסין נ, ולאחר מכן דגירה במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות, תכולת המלנין נמדדה כפי שתואר קודם [53]. בקצרה, לאחר הסרת אמצעי התרבות, התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, נוספה תמיסת נתרן הידרוקסיד (1 מ"ל, 1 N) לכל באר כדי להמיס מלנין. הספיגה ב-405 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרו-לוחיות. ניתוח זה חזר על עצמו עם תאי B16F10 (2 × 104 תאים/באר) ותאי MNT-1 באותה שיטה.

4.4. Western Blot Analysis

תאי Melan-A נזרעו בכלי 100 מ"מ (1 × 106 תאים/צלחת) וטופלו ב-1, 5 או 10 מיקרומטרגומיסין נלמשך שלושה ימים ב-37 ◦C. תאים נשטפו עם PBS ולאחר מכן נקצרו באמצעות מגרד. תאים מנותקים הוכנסו ל-1 מ"ל של PBS ועברו צנטריפוגה ב-75 00 סל"ד למשך 5 דקות. לאחר הסרת הרזולוציה העליונה, כדוריות התאים עברו ליטוש עם חיץ תמוגה (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 אחוז SDS, 150 mM NaCl, 1 אחוז NP-40, 0.02 אחוז נתרן אזיד, 0.5 אחוז נתרן דאוקסיכולאט, 100 מיקרוגרם/מ"ל PMSF, 1 גרם/מ"ל אפרוטינין) למשך 24 שעות ב-4 ◦C. סך החלבונים חולקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד למשך 30 דקות ב-4◦C. תכולת החלבון נמדדה באמצעות מבחן ברדפורד. חלבונים (30 מיקרוגרם) הופרדו באמצעות ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) של סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל והועברו לממברנת אניטרוצלולוזה. הממברנה נחסמה למשך שעה אחת עם 5 אחוז חלב דל שומן ב-Tris-buffered salinewith Tween-20 (TBST), ולאחר מכן הודגרה למשך 12 שעות ב-4 ◦C עם נוגדנים ראשוניים המכוונים -טובולין (סנטה קרוז, קליפורניה, ארה"ב ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, ארה"ב), tyrosinase (Cell Signaling), ERK(Cell Signaling), phospho-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), phospho-AKT (Cell Signaling),MC1R ( סנטה קרוז), אדניליל ציקלאזות 2 (סנטה קרוז), TRP-1 (סנטה קרוז) ו-TRP-2 (סנטה קרוז). לאחר הסרת נוגדנים ראשוניים, הממברנות נשטפו שלוש פעמים עם TBST והודגרו עם משני נוגדנים (ארנב אנטי-עז IgG-HRP; עכבר אנטי-ארנב HRP, סנטה קרוז) למשך שעה אחת. הממברנות טופלו עם ריאגנט כימי-לומינסנציה משופר באמצעות מערכת ההדמיה ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב). ניתוח דנסימטרי של הרצועות בוצע באמצעות תוכנת Image MasterTM 2D Elite (גרסה 3.1, GE Healthcare, שיקגו, IL, ארה"ב).

4.5. בדיקת פעילות טירוזינאז

להעריך את ההשפעה המעכבת של Gomisin N על פטריותטירוזינאזפעילות, טירוזינאז הודגרה עם 1, 5 או 10 מיקרומטרגומיסין נאו הביקורת החיובית Kojic acid. כל דגימה הומסה במתנול. L-DOPA (8.3 mM) וטירוזינאז פטריות (125 U) דוללו ב-80 mM phosphatebuffer (pH 6.8). 40 µL מכל דגימה ו-120 µL של L-DOPA ערבבו בצלחת 96-בבאר, ולאחר מכן הוספה של 40 µL של טירוזינאז פטריות מדולל. הצלחות הודגרו במשך 15 דקות, והספיגה נמדדה ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות.

טירוזינאזפעילות בליזטים של תאי מלנומה B16 נמדדה עם או בלי טיפול -MSH, כפי שתואר בעבר על ידי Ohguchi וחב'. [54], עם שינויים קלים. ליזאט התא הוכן כמתואר לעיל בחלק ניתוח ה-Western Blot. סך החלבונים בסופרנטנט נמדד על ידי מבחן ברדפורד תוך שימוש ב-Bovine Serum Albumin כסטנדרט [55]. כמות שווה של חלבונים דוללה ושימשה למבחן פעילות טירוזינאז.

מעכב את פעילות טירוזינאז

4.6. צביעת L-DOPA בתאי NHEM

תאי NHEM נזרעו בצלחת {{0}} היטב והודגרו במשך 72 שעות עם Gomisin N. תאים היו מקובעים עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 40 דקות, ולאחר מכן טיפול ב-0.1 אחוז Triton X{ {6}} למשך 2 דקות. L-DOPA (0.1 אחוז) נוספה לכל באר, ולאחר מכן דגירה למשך 2 שעות. לאחר הסרת התמיסה, התאים נשטפו פעמיים עם PBS. התמונות צולמו במיקרוסקופ.

4.7. ניסויים בדג זברה

עוברי דג זברה הושגו מבנק משאבי דג הזברה (Daegu, קוריאה). עוברים טופלו עם Gomisin N במשך 72 שעות. אפקט הפיגמנטציה שלגומיסין נעל עוברי דג זברה נצפו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. לניתוח Western blot, עוברים שטופלו ב-Gomisin N עברו ליטוש באמצעות חיץ תמוגה, שממנו הוכנו חלבונים הכוללים כאמור לעיל.

5. מסקנות

התוצאה שלנו תומכת בדעה שלגומיסין N יש פוטנציאל גבוה לשימוש כמזון פונקציונליהלבנת עורסוֹכֵן.גומיסין נהיא אחת מתרכובות הליגנן העיקריות ב-S. Chinensis. למעשה, ס. Chinensis היא תרופה צמחית המשמשת לריפוי של מחלות אנושיות רבות. עם זאת, יש צורך במחקרים אפידמיולוגיים נוספים כדי להוכיח את הבטיחות של Gomisin N על העור. כתוצאה מכך, מחקרים in vivo וניסויים קליניים יוכלו להדגים בצורה ברורה יותר את היעילות של GomisinN. לסיכום, מחקר זה מציע זאתגומיסין נעשוי להיות סוכן היפו-פיגמנטרי פוטנציאלי וטבעיהלבנת עורמועמד לתעשיית הקוסמטיקה.

cistanche לשפר את ההלבנה

הפניות

1. אלאלוף, ש.; אטקינס, ד'; בארט, ק.; בלאנט, מ.; קרטר, נ.; Heath, A. השפעת המלנין האפידרמיס על מדידות אובייקטיביות של צבע עור האדם. פיגמנט Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; באגולי, לפני הספירה; Askarian-Amiri, ME נתיבי איתות במלנוגנזה. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. סלומינסקי, א.; טובין, DJ; שיבהרה, ש.; Wortsman, J. Melanin פיגמנטציה בעור היונקים והוויסות ההורמונלי שלו. פיזיול. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. הרלינג, ט.; יונג, ק.; Fuchs, J. תפקיד המלנין כמגן מפני רדיקלים חופשיים בעור ותפקידו כאינדיקטור חופשי בשיער. Spectrochim Acta A Mol. ביומול. ספקטרוסק. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. ברוזינה, א.א.; יוזוויקי, ו.; רוסקובסקי, ק.; פיליפיאק, י. Slominski, AT תכולת מלנין בגרורות מלנומה משפיעה על תוצאות הטיפול בהקרנות. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. סלומינסקי, א.; וורצמן, י. פלונקה, ראש הממשלה; Schallreuter, KU; פאוס, ר.; טובין, DJ פיגמנטציה של זקיקי שיער.J. תחקור. דרמטול. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. סלומינסקי, א.; זמייבסקי, מ.א.; Pawelek, J. L-tyrosine ו-L-dihydroxyphenylalanine כמווסתים דמויי הורמונים של פונקציות מלנוציטים. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY התקדמות אחרונה בפתוגנזה של מלזמה. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; ואן ג'לה, מ.; Speeckaert, MM; למברט, ג'; van Geel, N. הביולוגיה של תסמונות היפרפיגמנטציה. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. סלומינסקי, ר.מ; זמייבסקי, מ.א.; Slominski, AT תפקידו של פיגמנט המלנין במלנומה. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. סלומינסקי, א.; וורצמן, י. טובין, DJ המערכת הסרוטונירגית/מלטונירגית העורית: אבטחת מקום תחת השמש. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. סרקר, ר.; ארורה, פ.; Garg, KV מוצרי קוסמטיקה להיפרפיגמנטציה: מה זמין? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. מימורה, י.; קואלו, SG; וולבר, ר.; מילר, ס"א; Wakamatsu, K.; זמודצקה, ב"ז; איטו, ש.; סמודה, סי; פסרון, ט.; צ'וי, ו'; et al. ויסות פיגמנטציה של העור האנושי ותגובות לקרינה אולטרה סגולה.Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. דייויס, EC; Callender, VD היפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית: סקירה של האפידמיולוגיה, התכונות הקליניות ואפשרויות הטיפול בעור בצבע. ג'יי קלין. אסתת. דרמטול. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. מכירות-קמפוס, ח.; סוזה, יחסי ציבור; פגיני, לפני הספירה; דה סילבה, JS; Cardoso, CR סקירה כללית של ההשפעות המווסתות של חומצה אולאית בבריאות ובמחלות. מיני. כומר מד. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; קאנג, מ.; צ'ונג, HS; צ'ו, סי; הונג, MC; שוקה, ח"כ; Bae, H. סקר ומנגנון של סוכני פיגמנטציה והבהרה של העור. פיטוטר. מילון 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. לואו, ל.; ג'יאנג, ל.; גנג, סי; קאו, ג'; Zhong, L. גנוטוקסיות הנגרמת על ידי הידרוקינון ונזקי DNA חמצוני בתאי HepG2. Chem. ביול. אינטראקציה. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydroquinone: זיהום סביבתי, רעילות ותשובות מיקרוביאליות. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD תכשירים להבהרת עור ומחלוקת ההידרוקינון. דרמטול. ת'ר. 2007, 20,308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; לי, I.; Yun, SK; קים, הולנד; פארק, ב"ה; Park, JW שמן נר הלילה מפושט מפחית את המלנוגנזה בתאי מלנומה B16 ומפחית פיגמנטציה של העור הנגרמת על ידי UV בבני אדם. ליפידים 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD מוצרים טבעיים ורפואה מסורתית: הפעלת פרדיגמה. ג'יי נאט. פרוד.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. פאנוסיאן, א.; Wikman, G. Pharmacology of Schisandra Chiensis Bail: סקירה כללית של מחקר רוסי ושימושים ברפואה. J. Etnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. חן, פ.; פאנג, ש.; יאנג, נ.; מנג, ה.; ליו, ג'. ג'ואו, נ.; ג'אנג, מ.; שו, ז; גאו, ו.; חן, ב.; et al. השפעות מועילות של Schisandrin B על תפקוד הלב במודל של אוטם שריר הלב בעכברים. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. לי, HJ; ג'ו, ש.; ריו, ג'; ג'ונג, HS; לי, ג.; ריו, MH; יונג, MH; קים, ה.; קים, BJ השפעות של SchisandraChinensis Turcz. פרי על דרמטיטיס ממגע הנגרמת על ידי דיניטרופלוארובנזן בעכברים. מול. Med. דו"ח 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; צ'ו, מ.; אז אני.; Jeon, JH ההשפעות המגנות של תמצית פרי Schisandra Chinensis והליגנאנים שלה נגד מחלות לב וכלי דם: סקירה של המנגנונים המולקולריים. Fitoterapia 2014, 97, 224–233. [CrossRef] [PubMed]

26. קאנג, OH; צ'אה, HS; Choi, JH; Choi, HJ; פארק, נ.ב; צ'ו, ש.ש; לי, GH; אז, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. השפעות של תמצית המים Schisandra Fructus על שחרור ציטוקינים משורת תאים אנושיים. J. Med. אוכל 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. פומה, א.; ביאנקיני, ש.; Miranda, M. עיכוב של ייצור מיקרו-גרעינים המושרה על ידי L-tyrosine byphenylthiourea בתאי מלנומה אנושיים. מוטאט. מילון 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. קים, HJ; קים, IS; דונג, י.; לי, IS; קים, JS; קים, JS; וואו, JT; Cha, BY השפעה מעוררת מלנוגנזה של סירסימריטין באמצעות עלייה בגורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה וביטוי טירוזינאז. Int. י.מול. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; אבי, פ.; Mantoux, F.; אברדם, ע.; Peyssonnaux, C.; אייכין, א. Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmediates את ההפעלה תלויה-cAMP של קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים (ERKs) במלנוציטים. EMBO J. 2000, 19, 2900-2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Balotti, R. Cyclic AMP שליח מרכזי בוויסות פיגמנטציה של העור. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. חח, י"ש; צ'ו, HY; לים, טי; פארק, ד"ה; קים, HM; יון, ג'; קים, JG; קים, CY; Yoon, TJ אינדוקציה של מלנוגנזה על ידי rapamycin בתאי מלנומה MNT-1 אנושיים. אן. דרמטול. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; קים, EY; פארק, JE; ג'ו, SY; באנג, ש.ש; צ'אנג, EJ; Chang, SE Microtubule-associated proteinlight chain 3 מעורבת במלנוגנזה באמצעות ויסות של ביטוי MITF במלנוציטים. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. שפריץ, ר"ע; שמיעה, VJ, Jr. הפרעות גנטיות של פיגמנטציה. עו"ד זִמזוּם. ג'נט. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. קדקארו, אל; חן, ג'; יאנג, ג'; חן, ש; ג'יימסון, ג'יי; Swope, VB; צ'נג, ט.; קדקיה, מ.; Abdel-Malek, Z. -הורמון מגרה מלנוציטים מדכא מתח חמצוני באמצעות מסלול איתות53-מתווך במלנוציטים אנושיים. מול. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. וואסמאייר, סי; Hume, AN; בולאסקו, ג'; Seabra, MC Melanosomes במבט חטוף. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. ברוזינה, א.א.; יוזוויקי, ו.; קרלסון, JA; Slominski, AT מלנוגנזה משפיעה על הישרדות כללית וללא מחלות בחולים עם מלנומה בשלב III ו-IV. זִמזוּם. פאתול. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. סלומינסקי, א.; קים, TK; ברוז'ינה, א.א.; Janjetovic, Z.; ברוקס, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN תפקיד המלנוגנזה בוויסות התנהגות מלנומה: מלנוגנזה מובילה לגירוי של ביטוי HIF-1 ומסלולים נלווים תלויי HIF. קֶשֶׁת. Biochem. ביופיס. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. קים, HJ; לי, JH; שוקה, ח"כ; היון לאם, ק.; קים, YJ; Lee, MH השפעה מעכבת של Gastrodia elata extracton melanogenesis בתאי מלנומה HM3KO. ג'יי קוסמט. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; פרייס, ER; Takemoto, C.; בדליאן, ט.; פישר, DE MAP kinase קושר את גורם השעתוק Microphthalmia לאיתות c-Kit במלנוציטים. טבע 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. מחיר, ER; דינג, HF; בדליאן, ט.; בהטצ'ריה, ס.; Takemoto, C.; יאו, TP; Hemesath, TJ; פישר, איתות ספציפי ל-DELineage במלנוציטים. גירוי C-kit מגייס את p300/CBP למיקרופתלמיה.J. ביול. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. ברטולטו, סי; אבי, פ.; Hemesath, TJ; ביל, ק.; פישר, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene המוצר כמתמר אותות בהתמיינות המושרה על ידי cAMP של מלנוציטים. J. Cell Biol. 1998, 142,827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. פוגנברג, ו'; אוגמונדסדוטיר, מ.ה.; ברגשטיינסדוטיר, ק.; שפסקי, א.; פונג, ב.; דיינקו, ו.; מילבסקי, מ.; שטיינגרימסון, ע.; Wilmanns, M. Restricted dimerization רוכסן לאוצין וסגוליות של זיהוי DNA של הרגולטור הראשי של המלנוציטים MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. פלאהרטי, ק"ט; הודי, FS; פישר, DE מגנים לתרופות: אסטרטגיות ממוקדות למלנומה. נאט. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. לי, ת'; Seo, JO; באק, ש; Kim, SY השפעות מעכבות של רזברטרול על סינתזת מלנין בפיגמנטציה המושרה על-ידי אולטרה סגול B בעור חזיר גינאה. ביומול. ת'ר. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. סו, טר; לין, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; יאנג, ZY; וו, MO; Zheng, YQ; סו, CC; Wu, YJ עיכוב מלנוגנזה על ידי חומצה גאלית: מעורבות אפשרית של מסלולי האיתות PI3K/Akt, MEK/ERK ו-Wnt/-catenin בתאי B16F10. Int. י.מול. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​יאג'ימה, I.; Kumasaka, MY; תאנג, ND; גוטו, י.; Takeda, K.; יאמשיטה, או.; אידא, מ.; אוהגמי, נ.; תמורה, ה.; קוואמוטו, י.; et al. איתות RAS/RAF/MEK/ERK ו-PI3K/PTEN/AKT בהתקדמות וטיפול במלנומה ממאירה. דרמטול. מילון תרגול. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. קים, ד"ש; קים, SY; ירח, SJ; Chung, JH; קים, KH; צ'ו, KH; Park, KC Ceramide מעכב את התפשטות התאים באמצעות AKT/PKB inactivation ומפחית את סינתזת המלנין בתאי Mel-Ab.Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. קים, JH; באק, ש; קים, ד.ה.; צ'וי, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; קים, MR; קוון, HJ; Lee, CH וויסות מטה של ​​סינתזת המלנין על ידי קיום A ויישומה למודל ברק in vivo. J.Investig. דרמטול. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. הרטמן, מ"ל; Czyz, M. MITF במלנומה: מנגנונים מאחורי הביטוי והפעילות שלה. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. קים, ד"ש; Hwang, ES; לי, JE; קים, SY; קוון, ס"ב; Park, KC Sphingosine-1-פוספט מקטין את סינתזת הסמלנין באמצעות הפעלה מתמשכת של ERK ופירוק MITF שלאחר מכן. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. שו, ו.; גונג, ל.; חדד, מ"מ; בישוף, או.; Campisi, J.; כן, אי.טי; Medrano, EE ויסות של רמות חלבון MITF של גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה על ידי קשר עם האנזים hUBC9 המצומד Theubiquitin. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. בנט, DC; קופר, PJ; Hart, IR שורה של מלנוציטים עכברים שאינם גידוליים, סינגניים עם מלנומה B16 ודורשים מקדם גידול לצמיחה. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. מאירה, WV; היינריך, ת"א; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenesis מעכב נשימה בתאי B16-F10 מלנומה ואילו משפר את תכולת התאים המיטוכונדריים. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. אוגוצ'י, ק.; טנאקה, ט.; איליה, א; איטו, ט.; אינומה, מ.; Matsumoto, K.; אקאו, י.; Nozawa, Y. Gnetol כמעכב potenttyrosinase מהסוג Gnetum. Biosci. ביוטכנולוגיה. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. אוצ'ידה, ר.; אישיקאווה, ש.; Tomoda, H. עיכוב פעילות טירוזינאז ופיגמנטציה של מלנין על ידי 2-הידרוקסיטירוסול. אקטה פארם. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]