שיבוט גנים, זיהוי תפקודי, ניתוח מבני וביטוי של סוכרוז סינתאז מ-Cistanche Tubulosa

תַקצִיר:סוכרוז סינתאז ממלא תפקיד מכריע במסלול חילוף החומרים של הסוכר הצמחי על ידי זירוז הייצור של uridine diphosphate (UDP)-גלוקוז, המשמש כתורם גליקוזיל ביו-אקטיבי לתהליכים מטבוליים שונים. במחקר זה, שובט גן סוכרוז סינתאז בשם CtSusCistanche tubulosa, תרופה סינית מסורתית הידועה בעשיריהתוכן של גליקוזידים מגוונים, בהתבסס על תוצאות ניתוח טרנסקריפטום. מסגרת הקריאה הפתוחה של CtSus הייתה באורך 2 418 bp בקידוד של 805 חומצות אמינו. ניתוח רצף חשף תחומים שמורים הקשורים למשפחת הסוכרוז סינתאז הצמחי הן באזור ה-N-טרמינלי והן באזור ה-C-טרמינלי של חלבון CtSus. ניתוח פילוגנטי הראה כי ל-CtSus יש קשר אבולוציוני הדוק עםסינתזות סוכרוזמצמחים אחרים באותו סדר. זיהוי פונקציונלי של CtSus בוצע באמצעות קטליזה של תא שלם עם UGT71BD1, אנזים glycosyltransferase מאופיין. התוצאות הראו שהכנסת CtSus שיפרה משמעותית את שיעור ההמרה של גליקוזילציה מזורזת על ידי UGT71BD1. הביטוי המסיס של CtSus ב-Escherichia coli הושג עוד יותר באמצעות וקטור הביטוי pCold™ TF. בדיקה אנזימטית במבחנה הצביעה על פעילותו של CtSus לזרז היווצרות UDP-גלוקוז בנוכחות סוכרוז ו-UDP. תוצאות תגובת שרשרת כמותית-פולימראז בזמן אמת הראו כי דפוסי הביטוי של הגן CtSus בחלקים שונים של C. tubulosa ותרביות תאי ההשעיה של C. tubulosa תחת לחץ בצורת עמדו בקורלציה עם דפוסי ההצטברות שנצפו עבור פנילטנול גליקוזידים, בהתאמה. יתר על כן, חומצות אמינו מפתח והאינטראקציות שלהן בין האנזים והמצע נחקרו בהתבסס על חיזוי מבנה חלבון ותוצאות עגינה מולקולריות. בסך הכל, הממצאים שלנו מזהים סוכרוז סינתאז CtSus האחראי לאספקת תורם הגליקוזיל הפעיל UDP-גלוקוז במהלך הביוסינתזה של מוצרי גליקוזיד ב-C. tubulosa וכן סיפקו אלמנט גן שניתן לנצל בבניית זנים הנדסיים לייצור מוצרי גליקוזיד.

מילות מפתח: Cistanche tubulosa; סוכרוז סינתאז; גליקוזידים; UDP-גלוקוז; קטליזה אנזימטית

DICHEN CISTANCHE מטפח בסיסים ביוטיאן, הוטן, שינג'יאנג

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wightהוא צמח טפיל עשבוני רב שנתי מהסוג Cistanche ממשפחת ה- Orobanchaceae. זהו חומר מרפא סיני מסורתי נדיר ויקר, שמקורו בשינג'יאנג ובמונגוליה הפנימית. הוא מתוק, מלוח וחם באופיו, ויש לו את הפונקציות שליאנג כליות מחזק, מועיל למהות ולדם, והרטבת המעיים והקלה על עצירות. זה ידוע בשם "ג'ינסנג מדברי" [1] מחקר מודרני מצא את זהCistanche tubulosaמכילמגוון רכיבים כימייםכְּגוֹןפנילתנואידים גליקוזידים, טרפנים אירידואידיםוהגליקוזידים, הליגנאנים והגליקוזידים שלהם, אסטרים של אוליגוסכרידים, פוליסכרידים, פוליאולים, אוליגוסכרידים, סטרולים וגליקוזידים שלהם, גליקוזידים מונוטרפנואידים, סוכרים, חומצות אמינו ושמנים נדיפים [2,3], במיוחד תרכובות גליקוזידים הן המרכיבים הפעילים החשובים ביותר. ביניהן, לתרכובות פנילתנואיד גליקוזיד יש את התכולה הגבוהה ביותר בחומר הרפואי המקורי ויש להן מגוון רחב של פעילויות תרופתיות כגון פרוטקציה עצבית ואנטי אייג'ינג [4]. הביוסינתזה של תרכובות הגליקוזידים הנזכרות לעיל כוללת שלבים מרובים של תגובות גליקוזילציה, אשר מזורזות על ידיגליקוזילטרנספראזות בצמחים, ואתאספקת תורמי גליקוזיל פעיליםחיוני בתהליך זה. תורמי סוכר פעילים נפוצים באורגניזמים כוללים אורידין דיפוספט (UDP), thymidine diphosphate (TDP) וגואנוזין דיפוספט (GDP). ביניהם, UDP-גלוקוז הוא תורם הגליקוזיל הפעיל הנפוץ ביותר בצמחים. לא רק שניתן לזהות אותו ישירות על ידי גלוקוזילטרנספראז כדי לזרז את תגובת העברת הגלוקוזיל, אלא גם יכול לשמש כמבשר להשתתפות בסינתזה של סוגים אחרים של תורמי גליקוזיל. לדוגמה, UDP-גלוקוז יכול לשמש כמצע ליצירת UDP-rhamnose תחת קטליזה של 4,6-dehydratase, 3,5-isomerase ו-4-reductase[5]; UDP-גלוקוז יכול לשמש כמצע כדי לזרז את הסינתזה של UDP-xylose דרך UDP-glucose dehydrogenase ו-UDP-xylose synthase; ניתן לזרז UDP-xylose עוד יותר על ידי UDP-xylose epimerase ליצירת UDP-arabinose[6]; UDP-גלוקוז ו-UDP-גלקטוז הם דיאסטראומרים וניתנים להמרה זה לזה באמצעות אפימראז[7,8]. לכן, לסינתזה של UDP-גלוקוז יש השפעה חשובה על אספקת תורמי גליקוזיל פעילים בצמחים ושינוי הגליקוזילציה של מטבוליטים משניים.

ניתן להשיג את הסינתזה של UDP-גלוקוז בצמחים באמצעות מסלול סינתאז, מסלול פוספורילאז ומסלול קינאז. ביניהם, סוכרוז סינתאז יכול לזרז ישירות את התגובה בין UDP לסוכרוז ליצירת UDP-גלוקוז ופרוקטוז, כמו גם את התגובה ההפוכה [9]. במובן הרחב, סוכרוז סינתאז שייך לתת-משפחת ה-glycosyltransferase-4, הכוללת מגוון של גליקוזילטרנספראזות, כגון phosphatase synthesis sucrose, synthase trehalose ו-trehalose phosphorylase [10]. סוכרוז סינתאז זוהה לראשונה בנבט חיטה [11]. מאז, חוקרים זיהו מאות גנים של סוכרוז סינתאז ממגוון צמחים כמו שעועית מונג (Vigna radiata), אורז (Oryza sativa), תירס (Zea mays), פולי סויה (Glycine max) ואפרסק (Amygdalus persica). הם מעורבים בתהליכים מטבוליים מרובים בצמחים, כולל הובלה והפצה של סוכרוז, סינתזת עמילן, סינתזת תאית והרכב דופן התא, מתח ביוטי ואביוטי וכו', וממלאים תפקיד רגולטורי מרכזי בהקצאת מקור פחמן צמחי [12]. בנוסף, בהתבסס על חקר התפקודים הפיזיולוגיים, החוקרים השתמשו גם בסינטאז הסוכרוז שהושג כאלמנט גנטי לסינתזה אנזימטית של תרכובות גליקוזידים, והשיגו תוצאות אידיאליות. לדוגמה, מצדה וחב'. [13] ביטאו יחד את גן הסוכרוז סינתאז AtSus-1 מ-Arabidopsis thaliana ואת הגן glycosyltransferase CaUGT2 מ-Catharanthus roseus במבחנה, והשתמשו במערכת אנזימים כפולה בסיר אחד כדי לזרז את תגובת הגליקוזילציה של כורכומין, מה שהגדיל את תשואה של כורכומין גליקוזיד פי 7. יחד עם זאת, כמות תורם הגלוקוז של UDP הייתה רק עשירית מהכמות ההתחלתית.

Bungaruang et al. [14] בנה מערכת קטליטית מצמדת באמצעות סוכרוז סינתאז GmSuSy מפולי סויה וגליקוסילטרנספראז OsUGT מאורז. הם השיגו שינוי גליקוזילציה של nothofagin על ידי הוספת כמות קטנה בלבד של UDP (1.0 mmol·L-1) וסוכרוז. בהשוואה לזרזת האנזים הבודד של OsUGT, ייצור מוצרי הגליקוזילציה עלה בשלושה סדרי גודל, מ- μmol·L-1 ל-mol·L-1.

העושר והמגוון של תרכובות הגליקוזידים ב-Cistanche tubulosa מצביעים על כך שהוא צריך להכיל סינתאז סוכרוז חזק הקשור לשינוי הגליקוזילציה של מטבוליטים משניים, אך אנזים זה לא דווח בצמחים מהסוג Cistanche. במאמר זה השתמשו כחומר ב-Cistanche tubulosa, חומר רפואי הכלול בפרמקופיה. באמצעות ניתוח טרנסקריפטום וניתוח תנסקריפטומים השוואתי של חלקים שונים, נעשה שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית לכרייה וזיהוי של גן סוכרוז סינתאז CtSus. ניתוח ביואינפורמטיקה, ביו-טרנספורמציה של תאים שלמים, ביטוי וטיהור פרוקריוטי, ניתוח פעילות קטליטית של אנזים במבחנה וניתוח ביטוי גנים בחלקים שונים של Cistanche tubulosa ומערכות תרבית רקמות צמחיות תחת לחץ בצורת בוצעו כדי לחקור את תפקוד ה-CtSus ואת המתאם שלו עם הביוסינתזה של תרכובות גליקוזידים ב- Cistanche tubulosa, הנחת בסיס לחקר המסלול הביוסינתטי של תרכובות גליקוזידים ב- Cistanche tubulosa.

חומרים ושיטות

חומרים צמחי Cistanche tubulosa טריים נאספו מהוטאן סיטי, שינג'יאנג, סין, וזיהוי ביולוגי בוצע על ידי פרופסור Tu Pengfei מאוניברסיטת פקינג; מערכת תרבית תאי ההשעיה Cistanche tubulosa הוקמה על ידי קבוצת המחקר שלנו בשלב מוקדם [15]; E. coliFast-T1 נרכש מ-Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) נרכש מ-Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; וקטורים pCold™ I ו-pCold™ TF נרכשו מ-Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; בקרת UDP-גלוקוז נרכשה מ-Xian Qiyue Biotechnology Co., Ltd., ומצעי אסקולין ורזברטרול נרכשו מ-Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DICHEN CISTANCHE מטפח בסיסים בהוטן, שינג'יאנג

מיצוי RNA וסינתזת cDNA RNA הופץ לפי ההוראות של ערכת הצמחים של OMEGA RNA (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). אלקטרופורזה של ג'ל Agarose וספקטרופוטומטר Nanodrop 2000 שימשו כדי לזהות את הטוהר, הריכוז והשלמות של ה-RNA. דגימות ה-RNA המוסמכות הועתקו לאחור באמצעות ערכת העתקה הפוכה TransScript® OneStep gDNA Removal ו-cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) כדי לסנתז את השרשרת הראשונה של cDNA.

כרייה של גנים סוכרוז סינתאז ושיבוט של גנים CtSus רצף חומצות האמינו של Arabidopsis thaliana sucrose synthase המזוהה פונקציונלית AtSus1 (מספר כניסה ל-GenBank: AED92894.1)[16] שימש כתבנית. גנים של סוכרוז סינתאז נבדקו מנתוני התעתיק של C. tubulosa על ידי יישור רצף Blastp מקומי, בשילוב עם ביאור גנים של תעתיק, ניתוח FPKM (שפע ביטוי גנים) וניתוח נתוני תעתיק השוואתי. פריימרים ספציפיים תוכננו בהתבסס על מידע רצף הגן המועמד שסופק על ידי נתוני התעתיק של הדור השני של C. tubulosa (טבלה 1). C. tubulosa cDNA שימש כתבנית והגברת PCR של גן המטרה בוצעה באמצעות אנזים PCR בעל נאמנות גבוהה (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). מוצר ההגברה של PCR טוהר באמצעות FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) ולאחר מכן שובט לפי ערכת השיבוט המהיר (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) חוברה עם וקטור השיבוט pCE2 TA/Blunt-Zero בהתאם להוראות ההפעלה, הועברה לתאים מוסמכים של Fast-T1, ותופחה בן לילה ב-37 מעלות. הפלסמיד חולץ והוגש ל- Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. לזיהוי רצף.

טבלה 1 רצף נוקלאוטידים של פריימרים בשימוש במחקר זה. qPCR: תגובת שרשרת כמותית-פולימראזית בזמן אמת

ניתוח ביואינפורמטיקה של סוכרוז סינתאז CtSus מ- Cistanche tubulosa

התוכנה המקוונת ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) שימשה לניתוח התכונות הפיזיקליות-כימיות של החלבון; התוכנה המקוונת TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) שימשה כדי לחזות את המבנה הטרנסממברני של החלבון; התוכנה המקוונת SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) שימשה כדי לחזות את המבנה המשני של החלבון; התוכנה המקוונת SMART (http://smart.embl.de/) שימשה כדי לחזות את התחום השמור של רצף חומצות האמינו החלבון; התוכנה DANMAN שימשה כדי להשוות את רצפי חומצות האמינו של CtSus עם אלו של סינתזות סוכרוז ממינים אחרים; העץ הפילוגנטי נבנה על ידי ניתוח אשכולות בשיטת הצטרפות שכן באמצעות התוכנה MEGA11, עם חזרת אתחול של פי 1,000.

ניתוח ביטוי של CtSus בחלקים שונים של Cistanche tubulosa ותחת לחץ בצורת

פריימרים PCR כמותיים של קרינה בזמן אמת עבור CtSus וגן הייחוס הפנימי DNAj תוכננו באמצעות תוכנת DNAMAN [17] (טבלה 1). רמת הביטוי היחסית של הגן CtSus בתאי ההשעיה של Cistanche tubulosa בחלקים שונים של Cistanche tubulosa ותחת לחץ בצורת נותחה על ידי PCR כמותי הקרינה בזמן אמת. ניתוח PCR כמותי של הקרינה בזמן אמת בוצע באמצעות ערכת TransStart® Top Green qPCR SuperMix (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). תוכנית ההגברה אימצה שיטה דו-שלבית: 94 מעלות למשך 30 שניות; 94 מעלות למשך 5 שניות, 60 מעלות למשך 30 שניות, חוזרת על עצמה במשך 40 מחזורים; הוא הופעל על מערכת Bio-Rad CFX Connect™ לזיהוי PCR בזמן אמת (מעבדת Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב). שיטת 2-ΔΔCT שימשה לניתוח הביטוי היחסי של הגן CtSus בקבוצות ניסוי שונות. GraphPadPrism 9 שימש לניתוח מובהקות ולציור גרף עמודות.

בניית וקטור ביטוי פרוקריוטי וביטוי הטרולוגי של גן CtSus בהתבסס על תוצאות ריצוף הגנים, תוכננו פריימרים ספציפיים המכילים זרועות הומולוגיה וקטוריות ואתרי הגבלה (טבלה 1) להגברת PCR. גן המטרה CtSus נבנה לתוך וקטורי ביטוי pET-28a, pET-24b, pCold™ I ו-pCold™ TF תוך שימוש בטכנולוגיית שיבוט חלק באמצעות ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). הפלסמידים של וקטורי הביטוי הרקומביננטיים שנבנו בהצלחה חולצו והומרו לתא מוכשר לביטוי Escherichia coli Transetta (DE3). התאים תורבו במדיום נוזלי LB המכיל 50 µg·mL-1 קנאמיצין סולפט (עם pET-28a ו-pET-24b בתור וקטורי ביטוי) או 1{{ 22}}0 µg·mL-1 אמפיצילין (עם pCold™ I ו-pCold™ TF כווקטורי ביטוי) ו-50 ug·mL-1 כלורמפניקול, בהתאמה, ב-37 מעלות ו-200 r·min{{ 15}} עם ניעור עד שערך A600 של התמיסה החיידקית הגיע ל-0.4-0.6. הוסף isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG) בריכוז סופי של 0.5 mmol·L -1 כדי לגרום לביטוי חלבון. דגירה במנער טמפרטורה קבועה ב-23 מעלות (עם pET-28a ו-pET-24b בתור וקטורי ביטוי) או 15 מעלות (עם pCold™ I ו-pCold™ TF בתור וקטורי ביטוי), 180 r· דקה-1 למשך 16 שעות (עם pET28a ו-pET-24b כווקטורי ביטוי) או 24 שעות (עם pCold™ I ו-pCold™ TF כווקטורי ביטוי), ואז אסוף את החיידקים באמצעות צנטריפוגה.

חיץ ליזה (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0.5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } אימידאזול, 3% גליצרול, 100 mmol·L-1 phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mg·mL-1 ליזוזים, pH 7.4) נוספו, והתאים נשברו למשך 8 דקות וצנטריפוגה. הסופרנטנט והמשקע נלקחו בהתאמה. הסופרנטנט נספג על ידי עמודת זיקה HisTrap FF (Cat 17531901, Cytiva) מלאה במילוי Ni Sepharose 6 Fast Flow כדי לספוח את חלבון היעד המכיל את התג. לאחר elution עם ריכוזים שונים של imidazole, כל חלק נלקח לזיהוי SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). השברים המכילים את חלבון המטרה שולבו, רוכזו בצנטריפוגה והומלחו בצינור אולטרה סינון (Millipore), ואוחסנו במאגר [המכיל 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 dithiothreitol, 3% גליצרול] עבור תגובות קטליזה אנזימטיות חוץ גופיות עוקבות.

קטליזה של תאים שלמים CtSus הפלסמיד pCold™ I-CtSus ופלסמיד הביטוי pET-28a-UGT71BD1[18] של הגליקוזילטרנספראז UGT71BD1, שזוהה על ידי קבוצת המחקר קודם לכן, הועברו בו זמנית לביטוי המוכשר. E. coli Transetta (DE3). חיידקים רקומביננטיים חיוביים המכילים שני גנים CtSus ו-UGT71BD1 נבחרו וחוסנו במדיום LB (מדיום צמיחה) המכיל 50 ug·mL-1 kanamycin sulfate, 100 ug ·mL-1 אמפיצילין ו-50 ug·mL-1 כלורמפניקול ביחס של 1:100 (V/V). התרבית תורבה ב-37 מעלות עד שערך A600 של תמיסה החיידקית היה 0.4-0.6, ולאחר מכן הוסף IPTG בריכוז סופי של 1 mmol·L-1. התרבית נמשכה ב-15 מעלות ו-180 r·min-1 למשך 24 שעות. התרבית עברה צנטריפוגה ב-4 מעלות ו-4 000 r·min-1. אספו את התאים. יש לחסן את התאים שנאספו למדיום M9 (מדיום תסיסה) ביחס של 40 מ"ל מצע תרבות לגרם חיידקים, ולהוסיף 75 מיקרומול·ל-1 סוכרוז ו-25 מיקרומול·ל-1 אסקולטין (1) או מצעי רזברטרול (2) לקבוצות התגובה. המשך לנער את התרבית במשך 24 שעות, צנטריפוגה ב-4000 × גרם, 4 מעלות למשך 30 דקות, הוסף מתנול כדי לשבור את המשקע באופן קולי, הוסף פי 2 מנפח המתנול לסופרנטנט, צנטריפוגה ב-4000 × גרם, 4 מעלות למשך 30 דקות, קח את הסופרנטנט וערבב, לאדות את הממס בלחץ מופחת, להתמוסס מחדש במתנול, לסנן דרך קרום מסנן 0.22 מיקרומטר, ולזהות את תוצר התגובה באמצעות כרומטוגרף נוזלי Agilent 1260 בעל ביצועים גבוהים. עמודת CAPCELL PAK C18 (250 מ"מ × 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) שימשה כעמודה אנליטית, 0.1% מים חומצת פורמית (A) ומתנול (B) שימשו כשלב הנייד, ושיפוע הפליטה היה: {{61 }} דקות, 30%-90% B; 25-27 דקות, 90%-100% B; 27-33 דקות, 100% B. הפרמטרים של ספקטרומטריית המסה היו מצבי יונים חיוביים ושליליים, וסריקות מלאות אוטומטיות רב-שלביות של MS1, MS2 ו-MS3.

זיהוי של פעילות קטליטית של האנזים CtSus במבחנה החלבון הרקומביננטי שהושג על ידי כרומטוגרפיית זיקה עמודת HisTrap FF שהוזכרה לעיל, היה נתון להסרת תג סופני באמצעות פקטור Xa. מערכת העיכול האנזים הייתה כדלקמן: החלבון הרקומביננטי הותאם לריכוז של 1 mg·mL-1, ו-1 μL Factor Xa נוספה ל-50 μL של החלבון הרקומביננטי במאגר של 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0), 100 mmol·L-1 NaCl ו-2 mmol·L-1

CaCl2 ב-23 מעלות למשך 6 שעות. מערכת התגובה הייתה 100 μL. התוצר של מערכת עיכול האנזים היה נתון להפרדת חלבון משנית על ידי כרומטוגרפיה של זיקה HisTrap FF כדי להשיג את חלבון המטרה עם הסרת תג לתגובות קטליזה של אנזים חוץ גופיות עוקבות. מערכת התגובה האנזים הייתה כדלקמן: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 סוכרוז, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug CtSus חלבון, Tris-HCl (pH 7.0) בתוספת ל-100 μL, הגיב באמבט מים ב-30 מעלות למשך 6 שעות, ושיטות הניתוח שלאחר הטיפול וניתוח HPLC בוצעו כמתואר בהפניה [19].

חיזוי מבנה תלת מימדי וניתוח עגינה מולקולרית של חלבון CtSus AlphaFold2 שימש כדי לחזות את המבנה התלת מימדי של חלבון CtSus [20]. מולקולת הליגנד עברה הידרוגן וטעינה באמצעות תוכנת AutoDock Tools 1.5.6. כיס מקשר המצע הושג על ידי יישור עם חלבון התבנית AtSus1 (PDBID 3S28). שרשראות הצד של שאריות חומצות האמינו סביב החלל נקבעו להיות גמישות.

תיבת הרשת נקבעה ל-40 × 40 × 40 Å3, ומרווח הרשת היה 0.375 Å. עגינה מולקולרית בוצעה ב-AutoDock Vina [21]. תוכנת PyMOL 2.0 שימשה כדי להמחיש את המודל עם הזיקה הטובה ביותר (kcat·mol-1

).

ניתוח סטטיסטי GraphPad Prism 9 שימש לניתוח סטטיסטי. נתוני הניסוי הובעו כממוצע ± סטיית תקן. מבחן t שימש להשוואה בין שתי קבוצות, וניתוח שונות של שונות שימש להשוואה בין מספר קבוצות. ההבדל נחשב מובהק סטטיסטית כאשר P < 0.05.