תמציות פרחים כצבעים רב-תכליתיים בתעשיית הקוסמטיקה חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

מוצרים טבעיים רבים משמשים במערכות רפואיות מסורתיות לטיפול בהקלה בתסמינים של כאב ודלקת, [61] לכן, נחקרה השפעת התמציות שנותחו על עיכוב פעילות ליפוקסיגנאז ופרוטאינז. בטווח הריכוזים שנותחו (100-500 ug/mL), תמצית מי CTE הראתה את היכולת החזקה ביותר לעכב פרוטאינז (איור 4) (ב-57 אחוז לריכוז של 500 ug/mL). פעילות זו הושוו למעכב הפרוטאין הידוע diclofenac, המשמש כביקורת (כ-89 אחוז עיכוב בריכוז הגבוה ביותר שנבדק). עם זאת, תוצאות דומות התקבלו עבור תמצית GGE ו-KTE (כ-56 אחוז ו-53 אחוז, בהתאמה, עבור הריכוזים הגבוהים ביותר). עיכוב נמוך יותר של חלבון נצפה עבור תמציות PRE ו-PGE. בבדיקה נוספת למדידת היכולת לעכב lipoxygenase, התמציות המימיות מ-KTE ו-CTE מציגות את הערכים הגבוהים ביותר (כ-67 אחוז ו-64 אחוז עיכוב, בהתאמה, לריכוז של 500 ug/mL). דיקלופנק שימש גם כביקורת תמציות GGE, PGE ו-PRE מציגות גם ערכים גבוהים באופן משמעותי (60 אחוז, 57 אחוז ו-54 אחוז, בהתאמה). כמו כן צוין כי היכולת לעכב אנזימים LOX ופרוטאינז תלויה בריכוז התמצית (איור 5).

מחקרים קודמים הצביעו על כך שתרכובות פוליפנוליות רבות תרמו באופן משמעותי לפעילות האנטי דלקתית של תמציות צמחים רבות [62]. מחקרים הראו את המעורבות של ROS בתהליך הדלקתי, ותרכובות פנוליות כגון חומצה גאלית וחומצה כינית עשויות לחסום את חילוף החומרים של חומצה ארכידונית על ידי עיכוב פעילות פעילות lipoxygenase, או שהן עשויות לשמש כרדיקלים חופשיים תגובתיים, המיוצרים במהלך חומצה ארכידונית. [63]. התוצאות שהתקבלו על ידי BenSaad et al. מצביעים על כך שחומצה אלגית, חומצה גאלית ופוניקלאגין A&B שבודדו מ-P. granatum עיכבו את הייצור של תחמוצת חנקן (NO), פרוסטגלנדין E2(PGE2) ואינטרלוקין 6 (IL-6) ב-lipopolysaccharide (LPS) המושרה. מקרופאגים RAW 267.4. האם תרכובות אלו פועלות כסוכנים בלעדיים או בעלות השפעה סינרגטית עדיין נותרה שאלה [64]. מאז פלבנואידים רבים מראים תכונות אנטי דלקתיות, בשל התנהגות נוגדת החמצון הפנימית שלהם, הם היו מעורבים בהפרעות דלקתיות שונות.שיטת מיצוי פלבנואידים pdf,בפרט, קוורצטין הוא המולקולה המעניינת ביותר מכיוון שהוא מפריע למסלולים ביולוגיים ספציפיים. יתרה מכך, מחקרים מצביעים על כך שהוא יכול להפחית את התהליך הדלקתי המעורב במספר מודלים באמצעות מנגנונים שונים[65]. בפרט, חלבון קינאז המופעל על ידי AMP ומסלול ההיסטון/חלבון דאצטילאז (AMPK/SIRT1) מביאים לניהול דלקתי מעניין יותר. לפיכך, מפעילי AMPK יכולים להפחית דלקת מקרופאגים. קוורצטין ופלבונואידים אחרים, כמפעילים של AMPK ו-SIRT1, עשויים להפחית את הדלקת על ידי הפרעה למסלול זה [66]. כמו כן, הוכח כי קוורצטין ומונוגלוקוזידים של קוורצטין מפעילים פוטנציאל עיכוב גבוה יותר של LOX [67] Nair et al. הראו תכונות אנטי דלקתיות של תמצית KTE על ידי הערכת נוכחותם של פלבנולים עם קבוצת הקוורצטין כמו מנגסלין Qu 3-[2G] rhamnosylrutinoside, Qu 3-O-dirhamnoside ורוטין. מולקולות אלו הראו עיכוב חזק של פעילות COX-2 ודיכוי ROS חלקי. באופן כללי, פוליפנולים הנמצאים ב-CTE הראו תכונות אנטי דלקתיות בדלקת הנגרמת על ידי LPS בתאי מקרופאג RAW 264.7[68].

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

2.5. הערכת ציטוטוקסיות

ביצירת חומרי גלם קוסמטיים חדשים, אחד המאפיינים החשובים ביותר הוא בטיחות השימוש שלהם. חומרים ייעודיים לשימוש במוצרי קוסמטיקה חייבים להיות לא רעילים, במיוחד ביחס לתאי עור, כגון קרטינוציטים ופיברובלסטים. שני סוגים של בדיקות שימשו כדי לקבוע את הרעילות של התמציות המנותחות על תאי HaCaT ו-BJ.פלבנואידיםהמחקר הראשון, באמצעות מבחן הספיגה האדום הנייטרלי, מאפשר לנו להעריך את הכדאיות של התאים שטופלו בתמציות המנותחות. צבע זה חודר לליזוזומים של תא חי ומשתחרר לציטופלזמה של תאים מתים. נצפה (איור 6) שלתמצית CTE יש את היכולת הגבוהה ביותר להגביר את התפשטות של תאי HaCaT וגם של תאי BJ. בהשוואה לבקרה, תמצית זו השיגה ערכים גבוהים בכ-20% ו-40% מהפרמטר הנבדק בריכוז של 250 μL/mL (HaCaT ו-B】) ו-500 μL/mL (תאי BJ) בהתאמה. תמצית GGE בריכוזים של 100 ו-250 μL/mL ותמצית KTE בריכוז של 500 μL/mL אופיינו בהשפעה רעילה קטנה על תאי BJ. לתמציות אחרות הייתה השפעה חיובית על הכדאיות של תאים אלה. תמציות PRE ו-PGE בריכוז של 100 μL/mL לא היו שונות משמעותית מהביקורת, והן הגדילו את שגשוג תאי BJ בכ-10-15 אחוזים בהשוואה לבקרה בריכוז של 250 ו-500 μL/ מ"ל. במקרה של קרטינוציטים, לא נצפתה ירידה בכדאיות התא. עבור תמציות PGE, PRE ו-CTE, נצפתה עלייה בשגשוג עם עלייה בריכוז, בעוד שהודגמה ירידה בכדאיות התא עם עלייה בריכוז של תמציות KTE ו-GGE.

הבדיקה השנייה שבוצעה כדי לקבוע את הציטוטוקסיות של התמציות שנבדקו הייתה מבחן ה-resazurin (Alamar Blue). הוכח (איור 7) שכדאיות התאים תלויה בריכוז התמצית שאיתה הודגרו התאים. במקרה של פיברובלסטים, תמציות PRE, PGE ו-CTE גורמות לשגשוג גבוה יותר של תאים עם עלייה בריכוזם. בריכוז המנותח הגבוה ביותר (500 μL/mL), נצפתה שגשוג גבוה בכ-20 אחוז בהשוואה לביקורת.שימוש בהספרידיןבמקרה של תמציות KTE ו-GGE, נצפתה ירידה בכדאיות התא עם עלייה בריכוז התמציות. תמציות אלו הראו השפעה רעילה קטנה על BJ בריכוזים של 250 ו-500 μL/mL. במקרה של קרטינוציטים, נצפתה השפעה דומה של התמציות המנותחות על תאי העור, אך יכולתם להתרבות לא הייתה חזקה כמו במקרה של פיברובלסטים. היכולת הגבוהה ביותר להגביר את התפשטות קרטינוציטים נצפתה עבור תמצית CTE בכל טווח הריכוזים המנותחים. ערכים דומים התקבלו עבור תמצית PRE בריכוז של 250 μL/mL ועבור תמצית PGE בריכוז של 500 μL/mL. תמצית KTE הראתה השפעה רעילה גבוהה משמעותית על תאי HaCa מאשר תמצית GGE.

התמציות המנותחות לא נבדקו בהרחבה עבור רעילותן לתאי עור בעבר. ישנם רק כמה מחקרי ציטוטוקסיות על תמציות או החומרים הפעילים העיקריים שלהן, במיוחד כלפי תאים סרטניים. מחברי מחקרים קודמים הצביעו על כך שלתמציות אלו אין בדרך כלל השפעה רעילה על תאי העור, ויכולתן להגביר את התפשטות התאים מיוחסת לרוב לתכולה הגבוהה של פוליפנולים, אנתוציאנינים ופלבונואידים [45,69-73 ]. כמה מחברים ציינו גם שהרכיבים הבודדים הכלולים בתמציות עשויים להפגין השפעה רעילה על תאי העור, בעוד שהתמצית בכללותה לא. עלי חיג'אזי וחב'. [69] הראה שאלקלואידים המופקים מ-Punica granatum הם רעילים לשורות תאים נורמליות וסרטניות, בעוד שכל התמצית פחות רעילה. המחקר של Nasiri et al. [70] מצביע על כך שתמצית פרחי Punica granatum עשויה להיות שימושית בהאצת תהליך ריפוי הפצעים בשל יכולתה להגביר את התפשטות תאי העור. במחקר הקודם שלנו [45], הוכח כי תמציות המים-אתנוליות שהתקבלו מהצמחים המנותחים אופיינו ביכולת גבוהה יותר להגביר את התפשטות תאי BJ, ותמציות KTE ו-GGE הראו השפעה רעילה נמוכה יותר על תאים אלו. .אימפריה אבודהההשפעה של תמציות מים-אתנול על תאי HaCaT הייתה דומה לזו של תמציות מימיות טהורות, אך במקרה של תמציות שהושגו עם אתנול, נצפו תכונות ריבוי מעט טובות יותר מאשר במקרה של תמציות מימיות. ההבדלים בין ההרכב של שני סוגי התמציות המנותחות עלולים לגרום להבדלים ברעילותם. כפי שמוצג, תמציות מים אינן עשירות במרכיבים ביו-אקטיביים כמו תמציות מים-אתנול. ההבדלים הגדולים ביותר נצפים בתוכן של רוטין ואיסוקוורציטרין.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

2.6.קביעת גורם הגנה מפני השמש

ההשפעות השליליות של קרינת UV על העור עשויות להתגלות גם זמן קצר לאחר החשיפה וגם שנים לאחר מכן. לקרינת השמש השפעה מדכאת חיסונית המאיץ את תהליך הזדקנות העור עם כל ההשלכות הנלוות לכך, לרבות סרטן מוגבר[74]. המגמות הנצפות כיום מצביעות על צורך הולך וגובר בפיתוח מוצרים המאופיינים לא רק ברמת בטיחות גבוהה מאוד בשימוש אלא גם בריבוי פונקציונליות במובן זה שהמוצרים יציגו את ההגנה נגד קרינה של העור עם טווח פעולה רחב יותר מהשימוש עד כה. חלק מחומרים צמחיים ממלאים תפקיד לא יסולא בפז בהיבט זה, אשר מסוגל לא רק לספק הגנה מפני השמש אלא גם לנטרל את ההשפעות השליליות הקיימות ממילא של קרינת השמש על העור [75-77]. המחקר שנערך הראה כי תמציות הצמחים המנותחות PRE, PGE, KTE, CTE ו-GGE מאופיינות במקדמי SPF גבוהים.

ניתוח המקדמים (SPF) בוצע עבור תמציות המים שהתקבלו מהצמחים הנ"ל בריכוזים של 10 ו-50 מ"ג/מ"ל. עבור כל צמח שנחקר ריכוז גבוה יותר של התמצית הביא לערך גבוה משמעותית של SPF.מיקרוניזציה של פלבונואידים מטוהרים בשימוש של 1000 מ"גהשוואה בין תמציות מראה כי הערכים הגבוהים ביותר של SPF נצפו עבור תמצית KTE, אשר תקף לשני הריכוזים שנחקרו. תצפית מעניינת נוספת היא שגם בריכוז הנמוך מבין הנחקרים תמצית KTE עדיין הראתה SPF גבוה, בעוד שהערכים של תמציות אחרות ירדו באופן ניכר. זה ברור כאשר אנו מנתחים עד כמה התוצאה עבור KTE הייתה גבוהה יותר מאשר תמציות אחרות. עבור ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל, ה-SPF היה גבוה יותר בפקטור של 1.2 (בהשוואה ל-PGE, CTE) עד לפקטור של כמעט 1.9 (בהשוואה ל-PRE, GE). אותו חישוב לריכוז של 10 מ"ג/מ"ל ייתן גורמים מ-1.4 (בהשוואה ל-PGE) לגורמים בטווח 2-3 (בהשוואה ל-CTE, GGE), אפילו עד גורמים כמו 10 בהשוואה ל- מִרֹאשׁ. כאשר מתמקדים בתמצית KTE, ניתן להבחין כי ירידה בריכוז התמצית בפקטור 5 (מערך של 50 מ"ג/מ"ל לערך של 10 מ"ל/מ"ל) מביאה לירידה של ערך ה-SPF בגורם 3.4 , כלומר SPF יורד לאט יותר מהריכוז. האמור לעיל מראה שתמצית KTE יכולה להיות יעילה גם כאשר היא מיושמת בריכוזים נמוכים (איור 8).

2.7. אובדן מים טרנס-אפידרמי (TEWL) ומדידות לחות העור

בשל מגוון הפעילות הביולוגית והפרמקולוגית הרחב של חומרי גלם צמחיים, לחומרים צמחיים הכלולים בתמציות יש השפעה משמעותית על מצב העור. בפרט, אנחנו מדברים כאן על ההשפעה של מטבוליטים משניים על מצב העור שלנו [78,79].

בשלב הבא של המחקר, בוצעו ניתוחי הידרציה ו-TEWL. הוערכה השפעת התמציות שנבדקו על העור. המדידות נעשו במרווחי זמן של 60 ו-360 דקות עבור ריכוז התמצית של 10 מ"ג/מ"ל. עבור מדידת TEWL, האחוז הירידה הגדול ביותר הוצג עבור תמצית PGE, שם ערך הבקרה של 13.9 ירד ל-8.71, וכתוצאה מכך אחוז ירידה של 37 אחוז. כדאי גם לנתח את תמצית KTE מנקודת מבט זו, מכיוון שזו הייתה זו שהציגה את ערכי ה-SPF הגבוהים ביותר. עבור תמצית KTE, ערך בקרת TEWL ירד לערך של 10.22, כלומר ירידה של 26 אחוז (איור 9א).

עם זאת, במקרה של מדידת המכשיר השני, הוכח שהתמציות המנותחות גורמות לעלייה בלחות ביחס לדגימת הביקורת, גם לאחר 60 וגם לאחר 360 דקות.

כתוצאה מהניתוחים, נמצא שהתמציות המנותחות של PRE, PGE, KTE, CTE ו-GGE מגבירות את הלחות העור (איור 9B). נצפתה עלייה בתכונות הלחות לצד עלייה בריכוז התמצית בתכשירים. תכונות הלחות החזקות ביותר נצפו עבור תמציות PRE ו-PGE בשווי של 32% ו-29% לאחר 60 דקות ושוות ל-21% ו-22% לאחר 360 דקות. עם זאת, הרמה הנמוכה ביותר של לחות העור נמצאה עבור תמצית KTE השווה ל-18 אחוזים לאחר 60 דקות וקרוב ל-3 אחוזים לאחר 360 דקות.

2.8. ניתוח יישומים

2.8.1. קביעת פרמטרי הצבע של תמציות

בשל צבעם הטבעי, החומרים הפעילים של פרחי הצמח יכולים לשמש כצבעים טבעיים במוצרים מסחריים רבים, כגון קוסמטיקה ומזון. בוצע ניתוח צבע עבור התמציות שהתקבלו (טבלה 5).

תמציות PRE, KTE ו-CTE נמצאו בעלות הפוטנציאל הגבוה ביותר כפיגמנטים קוסמטיים טבעיים. עם זאת, ערכי הכרומה הגבוהים ביותר (C*) נצפו עבור CTE. בהתבסס על הערך של פרמטר h grad, נמצא שהצבע הצהוב של תמצית זו הוא שנצפה ונראה לעין בלתי מזוינת. במקרה של תמציות KTE ו-PRE, למרות ערך C* הנמוך (2.8), ניתן לראות בבירור את צבען של תמציות אלו בעין בלתי מזוינת והוגדר כאדום-סגול עבור PRE וכחול-סגול עבור תמצית KTE. תמציות המים של PGE ו-GGE היו אדמדמות וצבען מעט כתום, וערכי הכרומה שהתקבלו היו ברמה של 1.3. עבור צבע זה, ערכים אלה לא היו מובחנים באופן משמעותי בעין בלתי מזוינת.

2.8.2. קביעת פרמטרי הצבע של מוצרי קוסמטיקה על סמך התמציות

בשנים האחרונות נוצר צורך עז בפיתוח צבעים חדשים ממקור טבעי, בעיקר בתעשיות המזון והקוסמטיקה. בהשוואה לצבעים המתקבלים באופן סינתטי, ייתכן שיש להם השפעה שלילית נמוכה יותר על בריאות האדם והסביבה [80]. התמציות שהתקבלו שימשו בניסוח של נוזל מסיר איפור מיסלר דגם. בכל ניסוח, הם שימשו בריכוז של 1 אחוז. התוצאות של פרמטרי הצבע של מוצרי קוסמטיקה מודלים מוצגות בטבלה 6.

נצפה כי תוספת של 1 אחוז תמציות מים מ-PRE, PGE, CTE ו-GGE השפיעה באופן משמעותי על צבע מסיר האיפור. כל דגימה נראתה בבירור לעין בלתי מזוינת בצבע. תמצית PRE שינתה את צבע הקוסמטיקה לכתום, ותמצית PGE, CTE ו-GGE שינתה אותו לצהוב.

האפשרות להשתמש בתמציות המנותחות כצבעים פוטנציאליים מאוששת על ידי הערכים הגבוהים יחסית של △ מסיר איפור עם תמצית/ מסיר איפור בסיס, המעיד על שינוי משמעותי בצבע של מוצרי קוסמטיקה דגם עם תוספת התמצית בהשוואה לדגימת הבסיס (ללא הוספת התמציות). נתוני ספרות [73] מראים שאם ערכי AE גבוהים מ-5, הצבע נתפס על ידי הערב העירום ונתפס כאפקט צבע. עבור מסירי איפור המכילים תמציות PRE, KTE ו-CTE, התקבלו ערכי AE של 8.83,9.17 ו-8.14, בהתאמה. במקרה של מוצרים עם תמציות PGE ו-GGE, לא נצפתה השפעה משמעותית בתמצית על צבע התכשיר. הערכים של AE הם בטווח של 2.51-2.82. המשמעות היא שההבדל בצבע ניתן להבחין רק למתבונן מנוסה [80,81].

3. חומרים ושיטות

3.1. חומר צמח ונוהל מיצוי

החומר הצמחי ששימש במחקר היה פרחים יבשים של P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. ו-G.globosa L., שהתקבלו מחנות צמחי המרפא המקומית. . תהליך המיצוי בוצע באמבט אולטראסוני (Digital Mgtrasonic Cleaner, ברלין, גרמניה), אשר בוצע בשיטה שתוארה על ידי Yang וחב'[82]. 10 גרם פרחים יבשים ו-100 גרם מים שימשו להכנת תמציות מים של הצמחים שנבדקו. התהליך בוצע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נאספו התמציות שהתקבלו וסוננו שלוש פעמים דרך נייר סינון מס' 1 של Whatman. לאחר סינון, התמציות התאדו בלחץ מופחת ב-40 מעלות. מהתמציות המיובשות הוכנה תמיסת ציר בריכוז של 100 מ"ג/מ"ל ונשמרה בחושך ב-4 מעלות עד לניתוח נוסף. נעשה שימוש בקיצורים הבאים: PRE—תמצית Papaver rhoeas, PGE—Punica granatum extract, GGE—Gomphrena globosa extract, CTE—Carthamus tinctorius extract, KTE—Clitoria ternatea.

3.2. קביעת תרכובות ביו-אקטיביות על ידי HPLC-UV-ESI-MS

התמציות שהתקבלו נותחו כדי לקבוע את התרכובות הביו-אקטיביות העיקריות שלהן באמצעות HPLC(DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, ארה"ב), בשילוב עם ספקטרומטר מסה (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, קנדה), מצויד במקור יינון אלקטרוספריי (ESI) ומסת מלכודת מרובעת-יון משולשת מנתח. הפרדה כרומטוגרפית הושגה עם מערכת פאזה הפוכה של גרדיאנט. יתר על כן, עמודה כרומטוגרפית 100×4.6 מ"מ Kinetex 3.5 מיקרומטר XB-C18 100 A עם שרשראות צד איזו-בוטיל ועם שלב נייח עם מכסה קצה TMS בשימוש עם עמודת שמירה דומה נרכשה מ-Phenomenex ונשמרה ב-30 מעלות . מערכת ממס בינארית הכוללת 0.1 אחוז (o/v) חומצה פורמית מימית כממס A ומתנול כממס B שימשה במצב שיפוע במהלך 19.1 דקות מזמן הריצה. תנאי החלוקה שהופעלו היו כדלקמן: 0.0-15.0 דקות 25-100 אחוז B,15.0-17.0 דקות 100 אחוז B,17.0-17.1 דקות 100-25 אחוז B,17.1-19.1 דקה 25 אחוז B.קצב הזרימה של השלב הנייד היה 0.6 מ"ל/דקה ונפח ההזרקה היה 10 μL. הנקיט נוטר על ידי ספקטרומטר מסה יונים אלקטרוספריי (ESI-MS) במצב יונים שליליים ונסרק מ-m/z 20 ל-1000 Da. לצורך ניתוח כימות, גלאי MS מרובע פולים עבד במצב סריקה של ניטור תגובה מרובה (MRM). תנאי מנתח מסה אופטימליים ובחירת יוני תוצר עבור תרכובות בודדות נקבעו בניסוי. למטרה זו, הוכנסו תמיסות סטנדרטיות של תרכובות שנבדקו (1 ng/mL) בהרכב פאזה ניידת באמצעות משאבת עירוי הפועלת באספקת דגימה קבועה. לאחר שווידאתם כי היון המבשר הנכון נבחר, פוטנציאל ביטול אשכולות (DP), פוטנציאל כניסה (EP), פוטנציאל יציאה מתאי התנגשות (CXP) ואנרגיית התנגשות (CE) אופטימיזו עבור כל מעבר MRM (טבלה S1). שני מעברי MRM נוטרו, אחד לכימות ואחד לאישור. הפרמטרים של MS נקבעו כדלקמן: טמפרטורה נימית של 600 C, גז מסך ב-35 psi, גז נבולייזר ב-60 psi, וגז ייבוש ב-50 psi. מתח מקור של מצב יינון שלילי -4500 V הוחל לקביעת תרכובות ביו-אקטיביות. חנקן שימש כווילון וגז התנגשות. ניתוח הנתונים עובד עם תוכנת Analyst 1.5.1. הזיהוי של תרכובות נבחרות נעשה על ידי מסה מולקולרית ושבר של כניסות אניונים של כל תרכובת בודדת ואושר על ידי פיצול MS2. זהותן של תשע תרכובות נקבעה יחד עם הנוסחה הכימית שלהן, יונים מולקולריים דה-פרוטונים ויונים מקטעים האופייניים לכל פסגה בודדת. שש תרכובות כומתו על סמך עקומת הכיול שנוצרה באמצעות שטחי שיא של מעברי MRM האינטנסיביים ביותר של תקנים אנליטיים. הליניאריות של תגובת הגלאי עבור תרכובות מכומות הוכחה על ידי הזרקה של תקני כיול בשמונה רמות ריכוז שנעות בין 0.01 ug/mL ל- 2ug/mL. עקומות כיול היו ליניאריות עם מקדמי המתאם (R) גדולים מ-0.99. במקרה שהדגימות לא נפלו בטווח הליניארי של גלאי ה-CMS, הדגימות היו מדוללות.

סטנדרטים אנליטיים של חומצה כינית, חומצה גאלית, חומצה קפאית, חומצות קפאואילכיניות (CQA, שני איזומרים:3- ו-5-CQA), וקוורצטין נרכשו מסיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מונטריה, ארה"ב ). כל התקנים שבהם נעשה שימוש היו בדרגה אנליטית (2 גדול מ-99 אחוז טוהר או שווה ל-99%).

תמיסות מניות סטנדרטיות הוכנו על ידי שקילה והמסה מדויקת של 20 מ"ג מכל תקן ב-10 מ"ל מתנול בדרגת LC-MS כדי לתת ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. דילולים סדרתיים של 2.{{10}} ug/mL, 1.5 ug/mL,1.0 ug/mL, 0.5ug/mL,0 לאחר מכן נוצרו .1 ug/mL, 0.05 ug/mL, 0.02 ug/mL ו-0.01 ug/mL באמצעות תמיסת מתנול בדרגת LC-MS. גבול הכמות (LOQ) הוגדר כ-0.01 ug/ml.

בדיקת LC-MS/MS בוצעה בשלושה עותקים. הנתונים שהושגו הוצגו כממוצעים ± סטיות תקן.

3.3. קביעת תכונות נוגדות חמצון

3.3.1.ABTS· plus Assay Scavenging

ראשית, תמיסת ה-ABTS הוכנה על ידי ערבוב של 19.5 מ"ג ABTS ו-3.3 מ"ג אשלגן פרסולפט עם חיץ פוספט של 7 מ"ל (pH=7.4) והומס במשך 16 שעות בחושך. לאחר מכן, התמיסה דוללה לספיגה ברמה של בערך 1.0. ספיגה נמדדה באורך גל של 入=734 ננומטר. לאחר מכן, 20 מ"ל של תמציות KTE, PGE, PRE, CTE ו-GGE (10,100,250,500 ug/mL) עורבבו עם 980 מ"ל תמיסת ABTSe ​​פלוס מדוללת ולאחר מכן הודגרה במשך 10 דקות בחושך. בשלב הבא, הספיגה של הדגימות המוכנות נמדדה ב-入=734 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). מים מזוקקים שימשו כריק. ניקוי ABTS פלוס חושב מתוך משוואה (1):

היכן: As—ספיגה של המדגם; AC—ספיגה של דגימת הביקורת. מדידות בוצעו בשלושה עותקים עבור כל דגימה שחולצה. ההליך תואר על ידי Gawel-Beben וחב'. [83].

3.3.2. DPPH Radical Scavenging Assay

היכולת של התמציות לנקות רדיקלים חופשיים בוצעה בשיטה שתוארה על ידי Brand-Williams וחב'. [84]. הוא מבוסס על השימוש ברדיקל 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH）. תחילה, 33 μL של תמיסות מימיות של תמציות בריכוזים של 100ug/mL עורבבו עם 167 μL מתנול של DPPH (4 mM) והועברו לצלחת 96-באר ולאחר מכן ערבבו בניעור. לאחר מכן, הספיגה של הדגימות נמדדה באורך גל של 517 ננומטר. המדידות בוצעו כל 5 דקות למשך 30 דקות בספקטרופוטומטר UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). בוצעו שלושה שכפולים עצמאיים עבור כל תמצית. מים עם תמיסת DPPH שימשו כבקרה. יכולת נוגדת החמצון באה לידי ביטוי כאחוז של עיכוב DPPH באמצעות משוואה (2):

היכן: As—ספיגה של המדגם; AC—ספיגה של דגימת הביקורת. מדידות בוצעו בשלושה עותקים עבור כל דגימה שחולצה.

3.3.3.זיהוי רמות תוך-תאיות של מיני חמצן תגובתיים (ROS)

כדי לקבוע את היכולת של התמציות המנותחות לייצר את הייצור התוך תאי של מיני חמצן תגובתיים בתאי HaCaT ו-BJ, נעשה שימוש בצבע פלואורגני H, DCFDA. לתרכובת זו יש יכולת להיכנס לתאים על ידי דיפוזיה פסיבית, כאשר היא עוברת דה-אצטילציה על ידי אסטראזים תוך-תאיים לתרכובת שאינה פלואורסצנטית. אם קיימים מיני חמצן תגובתיים בתא, תרכובת זו הופכת ל-DCF ניאון גבוה. כדי לקבוע את הרמה התוך-תאית של ROS ב-HaCaTs ו-BJ, תאים נזרעו ב96-צלחות באר. לאחר מכן, תאים תורבו באינקובטור למשך 24 שעות. מדיום DMEM הוסר והוחלף ב-10 מיקרומטר H2DCFDA (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, ארה"ב) מומס במדיום DMEM נטול סרום. תאי HaCaT ו-BJ הודגרו ב-H, DCFDA למשך 45 דקות ולאחר מכן הודגרו עם התמציות בריכוזים∶ של 100, 250 ו-500 ug/mL. תאים שטופלו ב-1 mM מי חמצן (H2O2) שימשו כבקרות חיוביות. דגימות הביקורת היו תאים שלא טופלו בתמציות שנבדקו. קרינת DCF נמדדה כל 90 דקות באמצעות קורא מיקרו-צלחות FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) בגירוי מקסימלי של 485 ננומטר וספקטרום פליטה של ​​530 ננומטר [85].

3.4. הערכה של עיכוב מטריקס מטאלופפטידאזות

3.4.1. קביעת פעילות אנטי אלסטאז

כדי לקבוע את האפשרות של עיכוב מטריקס מטלופרוטאינז, נויטרופילים אלסטאז (NE), הוחל ערכה פלואומטרית (Abcam, ab118971). הבדיקה בוצעה בהתאם להוראות המצורפות לערכה ולפי הנוהל המתואר על ידי Niziol-Lukaszewska וחב'. [86]. הניתוחים בוצעו בצלחת באר 96-סטנדרטית עם תחתית שטוחה ושקופה. לצורך הניתוח, נעשה שימוש בתמציות צמחים בריכוז של 100 ו-250 ug/mL. בתחילה הוכנו תמיסות אנזים NE, מצע NE ובקרת מעכבים (SPCK) לפי ההוראות. תמיסת NE מדוללת נוספה לכל הבארות ולאחר מכן נוספו דגימות בדיקה, בקרת המעכבים ובקרת האנזים (Assay Buffer) לבארות הבאות. לאחר מכן, דגימות ערבבו והודגרו ב-37 מעלות למשך 5 דקות. בינתיים, הוכנה תערובת תגובה על ידי ערבוב של Assay Buffer ומצע NE. התערובת נוספה לכל שקע וערבבה היטב. הקרינה נמדדה מיד באורך גל עירור 入=400 ננומטר ופליטת 入=505 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) היכולת לעכב פעילות NE של המנותח דגימות חושבו מתוך משוואה (3):

התוצאה הסופית הייתה הממוצע האריתמטי של שלוש מדידות בלתי תלויות.

3.4.2. קביעת פעילות אנטי-קולגנאז

כדי להעריך את היכולת של התמציות שהתקבלו לעכב את פעילות הקולגנאז, הוחל ערכה פלואורומטרית (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). הבדיקה בוצעה בהתאם להוראות המצורפות לערכה ולפי הנוהל המתואר על ידי Niziol-Lukaszewska וחב'. [86]. הניתוחים בוצעו בצלחת באר 96-סטנדרטית עם תחתית שטוחה ושקופה. לצורך הניתוח, נעשה שימוש בתמציות צמחים בריכוז של 100 ו-250 ug/mL. ראשית, קולגנאז (COL) הומס במאגר ניתוח קולגנאז (CAB). לאחר מכן, נוספו דגימות מנותחות ל-COL ו-CAB. דגימות בקרת מעכבים הוכנו על ידי ערבוב מעכב הקולגנאז (1,10-phenanthroline(80 mM) עם קולגנאז ומאגר CAB. בארות בקרת אנזים הוכנו על ידי ערבוב COL מדולל עם CAB. המאגר CAB שימש כבקרת רקע לאחר מכן, הדגימות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. תערובת תגובה הוכנה על ידי ערבוב מצע הקולגנאז עם CAB. תערובת התגובה שהוכנה בדרך זו נוספה לכל הדגימות המנותחות וערבבה היטב. לאחר מכן, נמדדה הקרינה בשיעור אורך גל עירור של 490 ננומטר ופליטת 520 ננומטר. המדידה בוצעה במצב קינטי למשך 60 דקות ב-37 C. היכולת לעכב פעילות COL של תמציות שהתקבלו חושבה על ידי משוואה (4):

3.5. קביעת תכונות אנטי דלקתיות

3.5.1. עיכוב דנטורציה של חלבון

פעילות מעכבת חלבון של PRE, PGE, KTE, CTE ו-GGEextracts בוצעה על פי השיטה של ​​Sakat וחב' [87], אשר שונתה על ידי Gunathilake וחב' [88]. בקצרה, תמיסת התגובה (2 מ"ל) הייתה מורכבת מ-1 מ"ל של 1 אחוז טריפסין ב-2{{10}} מאגר Tris-HCl (pH7.4) ו-1 מ"ל של דגימת בדיקה ({{17} }.02 מ"ל תמצית 0.980 מ"ל מים). התמיסה הודגרה (37 מעלות למשך 5 דקות), ולאחר מכן נוספה 1 מ"ל של 0.8 אחוז (w/v) קזאין והתערובת הודגרה למשך 20 דקות. בסוף הדגירה נוספו 2 מ"ל של חומצה פרכלורית 70 אחוז להשלמת התגובה. התערובת עברה צנטריפוגה, והספיגה של הסופרנטנט נמדדה ב-210 ננומטר כנגד המאגר כריק. תמיסת חיץ הפוספט שימשה כשליטה. אחוז העיכוב של דנטורציה של חלבון חושב באמצעות הנוסחה הבאה:

כאשר A1= ספיגה של דגימת הביקורת, ו-A2= ספיגה של דגימת הבדיקה.

3.5.2. עיכוב פעילות Lipoxygenase

היכולת של תמציות שהתקבלו לעכב פעילות lipoxygenase נקבעה באמצעות השיטה שתוארה על ידי Sarvesvaran וחב'. 【89】. ראשית, 10 μL של תמציות צמחים בריכוזים שונים (100, 250 ו- 500 ug/mL) ערבבו בצלחת 96-בבאר עם 160 μL של 100 mM PBS ו-20 μL של תמיסת ליפוקסיגנאז מפולי סויה (167) מ"ל). דגימות הודגרו ב-25 מעלות למשך 10 דקות ולאחר זמן זה נוספו 10 μL של חומצה נתרן לינולאית כדי להתחיל את התגובה. לאחר מכן, הספיגה של דגימות נמדדה ב-234 ננומטר על פני תקופה של 3 דקות בכל דקה באמצעות קורא FilterMax F5microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). דיקלופנק שימש כביקורת חיובית. אחוז עיכוב פעילות lipoxygenase חושב מתוך משוואה (6):

איפה: כמו הספיגה של הדגימה שנבדקה, Ac היא הספיגה של הבקרה השלילית.

התוצאה הסופית הייתה הממוצע האריתמטי של שלוש מדידות בלתי תלויות.

3.6. ניתוח ציטוטוקסיות

3.6.1. תרבית תאים

במחקר זה, נעשה שימוש בשני קווי תאי עור: קרטינוציטים אנושיים נורמליים (HaCaT) ופיברובלסטים (BJ). מנאסס, וירג'יניה, ארה"ב). תאים גודלו ב-Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, ארה"ב) עם נתרן פירובט, L-גלוטמין ותכולת גלוקוז גבוהה (4.5g/L). המדיום גם הועשר ב-10% סרום בקר עוברי (Gibco, Waltham, MA, ארה"ב) ו-1% באנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-1000 ug/mL Streptomycin, Gibco) כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. תאים גודלו באינקובטור ב-37 מעלות באווירה לחה של 95 אחוז אוויר ו-5 אחוז פחמן דו חמצני.

3.6.2.Alamar Blue Assay

לאחר שהתאים התרבותיים (HaCaT ו-BJ) הגיעו למפגש הרצוי, המדיום DMEM נשאב בצלוחיות התרבית. התאים המחוברים לתחתית נשטפו פעמיים עם תמיסת מלח סטרילית מבוקרת פוספט. שכבת התאים נותקה עם טריפסין ואז התאים הונחו במדיום DMEM טרי. תאים צופו בצלחות עם תחתית שטוחה 96- היטב (VWR, Radnor, PE, ארה"ב) ולאחר הצמדות לתחתית הלוחות, התאים טופלו בתמציות (100, 250 ו-500 ug/mL). תאים הודגרו במשך 24 שעות.

בדיקת הציטוטוקסיות בוצעה עם מבחן Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, הולנד). לאחר הדגירה, נוספה לבארות תמיסת resazurin בריכוז של 60 uM, ואז הונחו צלחות באינקובטור ב-37 מעלות למשך שעתיים. לאחר זמן זה, הקרינה נמדדה (入=570nm). כל ריכוז תמצית בוצע בשלושה שכפולים.

3.6.3. מבחן ספיגה אדום ניטרלי

מבחן ספיגה אדום ניטרלי הוא הבדיקה השנייה המשמשת לקביעת הציטוטוקסיות של PRE, PGE, KTE, CTE ו-GGE. ראשית,96-בכן הוכנו צלחות עם תחתית שטוחה כמתואר בסעיף הקודם. לאחר 24 שעות של חשיפה של התאים לתמציות, הם נשאבו והוחלפו בצבע אדום נייטרלי (40 ug/mL) והודגרו במשך 2 שעות. לאחר זמן זה, התאים נשטפו עם תמיסת מלח מוגברת בפוספט. בשלב הבא, חיץ דה-צבע (150 μL) נוסף לבארות. לאחר מכן, הספיגה של dve אדום ניטרלי נקבעה על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) ב-540 ננומטר. כל ריכוז תמצית בוצע בשלושה שכפולים.

3.7. קביעת גורם הגנה מפני השמש (In Vitro)

מקדם ההגנה מפני השמש (SPF) נקבע על ידי מדידת הספיגה של תמיסה מימית של תמציות בריכוזים של 10 ug/mL ו-50 ug/mL, בטווח אורך הגל של 290 עד 320 ננומטר במרווחים של 5- ננומטר. מהתוצאות שהתקבלו, ה-SPF חושב ממשוואת מנסור [90]: כאשר∶ EE（λ）-ספקטרום אפקט אריתמי, I（入）-ספקטרום עוצמת השמש, ABS（入）-ספיגה של מוצר קרם ההגנה, CF- מקדם תיקון (=10), E（N）×I（λ）— נעשה שימוש בערכים שנקבעו על ידי Sayre [91].

3.8. מדידות אובדן מים טרנס-אפידרמי (TEWL) ומדידות לחות העור

מדידות TEWL והידרציה של העור נערכו באמצעות בדיקה TEWAmeter TM 300 ו-Corneometer CM 825 פרוב מחובר למתאם MPA (Courage plus Khazaka Electronic, קלן, גרמניה). חמישה מתנדבים השתתפו במחקר. על האמה שלהם. עור, סומנו שישה אזורים (בגודל 2×2 ס"מ). כמות של 0.2 מ"ל מתמציות הצמחים שנבדקו הונחה בחמישה מקומות, המקום השישי היה הביקורת (לא טופלה בשום דגימה). לאחר 60 ו-360 דקות נלקחו מדידות רמת הידרציה ומדידות TEWL. התוצאה הסופית הייתה הממוצע האריתמטי (מכל מתנדב) של חמש מדידות עצמאיות (הידרציה בעור) ו-20 מדידות (TEWL).

3.9.הכנת מוצרי קוסמטיקה (מסיר איפור) המכילים תמציות

הוכן דגם קוסמטי (מסיר איפור). כל הרכיבים שבהם נעשה שימוש תאמו את דרישות EcoCert ו-COSMOS. הניסוח מוצג בטבלה 7.

המוצר הופק על ידי ערבוב המרכיבים (מפריט 1 עד פריט 6) בטמפרטורת החדר עד לקבלת נוזל אחיד. בשלב האחרון, ה-pH של התכשיר הותאם. מסיר האיפור חולק למנות. כמות של 1 אחוז מתמיסות המניות של התמצית נוספה לכל מנה וערבבה היטב.

3.10. קביעת פרמטרי הצבע של תמציות ומוצרי קוסמטיקה (מסירי איפור) המכילים תמציות

דגימות של תמציות ומוצרי קוסמטיקה עם תמציות נבדקו בטמפרטורת החדר, 48 שעות לאחר הכנתן. מד CHROMA CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., טוקיו, יפן) שימש להערכת פרמטרי הצבע (קואורדינטות CIELAB). מערכת CIELAB הוגדרה על ידי הנציבות הבינלאומית להארה בשנת 1978. היא מבוססת על שלוש תכונות צבע: L*, a*,b, כאשר L* הוא משתנה בהירות פרופורציונלי לערך במערכת Munsell, ו-a* ו b* הן קואורדינטות כרומטיות. הקואורדינטות a* ו-b* מציינות מיקומים בצירים האדום/ירוק והצהוב/כחול, בהתאמה (בתוספת=אדום, -a=ירוק; פלוס b=צהוב, - ב =כחול).

בהתבסס על הנתונים שהתקבלו: L*, a* ו-b*, חושבו פרמטרי הצבע הבאים: כרומה (C*) וגוון (h). נעשה שימוש במשוואות הבאות:

4. מסקנות

בהתבסס על התוצאות שהתקבלו, ניתן להסיק כי תמציות הצמחים שנבדקו מציגות מספר תכונות חיוביות, שבזכותן ניתן להשתמש בהן בייצור מוצרי קוסמטיקה כמרכיב בטוח וביו-אקטיבי שלהן. הוכח שצמחים אלו הם מקור עשיר לפוליפנולים, מה שמקנה להם תכונות נוגדות חמצון. PRE הראה את היכולת הטובה ביותר לנקות רדיקלים חופשיים, וזה כנראה בגלל שהוא מכיל הכי הרבה פוליפנולים בהשוואה לצמחים אחרים. PGE ו-PRE הראו את היכולת הטובה ביותר להפחית את ייצור ROS בתאים. יתר על כן, צמחים אינם מראים פעילות ציטוטוקסית כלשהי. כל התמציות שנבדקו הראו השפעה מעכבת על אנזימי האלסטאז והקולגנאז, כאשר ל-P. granatum ול-GGE יש את ההשפעה המעכבת הגדולה ביותר. זה עשוי להצביע על כך שניתן להשתמש בצמחים אלו בקוסמטיקה כחומרים המאטים את תהליכי ההזדקנות. יתרה מכך, התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שלצמחים אלו יש תכונות אנטי דלקתיות. במקרה זה, נראה כי CTE ו-KTE היו הטובות ביותר. KTE ו-PGE הראו אפקט מגן מפני קרינת UV, אפילו בריכוזים נמוכים. בריכוזים גבוהים יותר, לכל הצמחים הייתה אפקט מגן UV. יתר על כן, לצמחים הייתה השפעה חיובית על לחות העור והפחתת איבוד מים טרנס-אפידרמי. תמציות PRE, KTE ו-CTE עשויות לשמש כחומרי צבע יעילים במוצרי קוסמטיקה. דגם הנוזל להסרת איפור המכיל את התמציות הנ"ל התאפיין בצבע עז ויציב לאורך זמן. הצבע של מוצרי הקוסמטיקה עם תמציות PGE ו-GGE ניתן להבחין רק על ידי צופים מנוסים, והם אינם שונים באופן משמעותי מהדגימה הקוסמטית הריקה, ללא תוספת התמצית. בהתחשב בכל התוצאות שהתקבלו, ניתן להסיק כי Papaver rhoeas, Clitoria ternatea ו- Carthamus tinctorius יכולים לשמש בהצלחה כמקורות לצבעים צהובים, כתומים, כחולים וסגולים בייצור מוצרי קוסמטיקה שיהיו בטוחים לשימוש, וכן, מה שכן, תהיה השפעה חיובית על העור.

מאמר זה מופק מ-Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules