חומר חלקיקי עדין 2.5 מגביר את מלנוגנזה בתאי מלנומה אנושיים A375
Jul 19, 2023
לעורך: מחקרים אפידמיולוגיים הראו שחשיפה לחלקיקים עדינים 2.5 (PM2.5) מגבירה את הסיכון להיפר-פיגמנטציה של העור.[1] מחקר שנערך לאחרונה הוכיח ש-PM2.5 יכול לגרום למלנוגנזה על ידי ויסות טירוזינאז (TYR), וביטוי של חלבון 1 (TYRP1) ו-2 (TYRP2) הקשורים ל-tyrosinase באמצעות קולטן אריל פחמימנים (AhR)/הפעלת איתות חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן.[ 2] ה-AhR נפוץ בתאי עור והקשירה שלו שולטת בחמצון/אנטי חמצון, תפקוד מחסום אפידרמיס, תגובה הנגרמת על ידי צילום, חסינות מולדת ומלנוגנזה. ניתן להפעיל אותו על ידי דיוקסין ופחמימנים ארומטיים פוליציקליים (המרכיבים של PM2.5) והפעלתו גורמת לשעתוק של גנים המקודדים הן לאנזימי מטבוליזם קסנוביוטי שלב I והן שלב II (ציטוכרומים P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 ו-CYP1B1). [3,4] BaP ודיוקסינים מסוכנים מפעילים את AhR עם יצירת מיני חמצן תגובתיים חזקים (ROS), המתווך לפחות בחלקו על ידי CYP1A1. יתר על כן, מתח חמצוני מתווך CYP1A1- אחראי לייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון אינטרלוקין (IL)-1, IL-6 ו-IL-8 בסביבה קרטינוציטים אנושיים שטופלו במזהמים.[3,5] עם זאת, ישנם מעט מאוד מחקרים על ההשפעות הרעילות של PM2.5 על תאים מלנוגנטיים. כאן, טיפלנו בתאי מלנומה אנושיים A375 בריכוזים שונים של PM2.5 כדי לחקור אם PM2.5 יכול לקדם מלנוגנזה, והקשר שלו עם איתות AhR, עקה חמצונית ותגובה דלקתית.
גליקוזיד של cistanche יכול גם להגביר את הפעילות של SOD ברקמות הלב והכבד, ולהפחית באופן משמעותי את תכולת הליפופוסצין וה-MDA בכל רקמה, תוך ניקוי יעיל של רדיקלי חמצן תגובתיים שונים (OH-, H₂O₂ וכו') ומגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי OH-רדיקלים. לגליקוזידים פנילתנואידים של Cistanche יש יכולת ניקוי חזקה של רדיקלים חופשיים, יכולת צמצום גבוהה יותר מאשר ויטמין C, משפרים את פעילות ה-SOD בתרחיף זרע, מפחיתים את תכולת ה-MDA ובעלי השפעה הגנה מסוימת על תפקוד קרום הזרע. פוליסכרידים של Cistanche יכולים להגביר את הפעילות של SOD ו-GSH-Px באריתרוציטים וברקמות ריאה של עכברים מתבגרים שנגרמו על ידי D-galactose, כמו גם להפחית את תכולת ה-MDA והקולגן בריאה ובפלזמה, ולהגדיל את תכולת האלסטין. אפקט ניקוי טוב על DPPH, הארכת זמן ההיפוקסיה בעכברים מזדקנים, שיפור הפעילות של SOD בנסיוב, ועיכוב ניוון פיזיולוגי של ריאות בעכברים מזדקנים בניסוי. עם ניוון מורפולוגי תאי, ניסויים הראו כי ל-Cistanche יש יכולת נוגדת חמצון טובה ובעלת פוטנציאל להיות תרופה למניעה וטיפול במחלות הזדקנות העור. יחד עם זאת, לאכינאקוסיד ב-Cistanche יש יכולת משמעותית לסלק רדיקלים חופשיים של DPPH ובעל יכולת לנטרל מיני חמצן תגובתיים ולמנוע פירוק קולגן הנגרמת על ידי רדיקלים חופשיים, וכן יש לו אפקט תיקון טוב על נזקי אניון רדיקלים חופשיים של תימין.
לחץ על מוסף Cistanche Tubulosa
【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
ה-PM2.5 נאסף במהלך החורף (מדצמבר עד ינואר) בבייג'ינג. HY-1000 דגימת חלקיקים מרחפים (TSP) חכמה בזרימה גדולה (חותך PM2.5 אופציונלי, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, סין) שימשה לדגימת מסנן קוורץ. קרום הקוורץ הוטבע ב-75 אחוז אתנול ואחריו ניעור קולי. מים סטריליים שימשו להכנת תמיסה בריכוז גבוה. תאי מלנומה אנושיים A375 תורבו ב-5% CO2 ב-37 מעלות ב-Dulbecco's Modified Eagle's Medium רגיל (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA) המכיל סרום בקר עוברי (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, ארה"ב). תאי A375 טופלו בריכוזים שונים של PM2.5 (0, 100, 200 ו-400 ug/mL) במשך 24 שעות, והתאים שימשו למחקרים הבאים. לניתוח סטטיסטי נעשה שימוש במבחן t של סטודנט לא מזווג וניתוח חד כיווני של שונות, ו-P <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
כדי לחקור את ההשפעה של PM2.5 על תאי A375, התפשטות תאים זוהתה באמצעות ערכת CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב), ואפופטוזיס של תאים זוהה באמצעות Annexin V fluorescein isothiocyanate/ ערכת אפופטוזיס של propidium iodide (FITC/PI) (Multisciences, ארה"ב), המבוססת על הוראות היצרן. התוצאות הצביעו על כך ש-PM2.5 הפגין ציטוטוקסיות תלוית ריכוז לתאי A375, אך לא השפיעה על האפופטוזיס [איור משלים 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
שיטת NaOH שימשה לקביעת תכולת המלנין. תאי A375 שטופלו ב-PM2.5- נשטפו עם מלח פוספט חוצץ (PBS) והוסרו במים. הליסאטים עברו צנטריפוגה במהירות של 12, 000 r/min למשך 5 דקות, נשטפו עם 10 אחוז חומצה טריכלורואצטית (500 מ"ל) (Sigma, St. Louis , MO, ארה"ב) ו-75 אחוז אתנול (500 מ"ל), ולאחר מכן הובהר שוב. לאחר מכן, 50 מ"ל של 1 מול/ליטר NaOH המכיל 10 אחוז דימתיל סולפוקסיד נוספו לכדורים למשך שעה אחת ב-80 מעלות. הספיגה ב-490 ננומטר (OD 490) נמדדה באמצעות קורא מיקרו-לוחיות. מכיוון ש-TYR הוא האנזים המלנוגני החשוב ביותר, בשלב הבא זיהינו את פעילות ה-TYR באמצעות מבחן levodopa (L-DOPA). צלחות Sixwell (Corning, ארה"ב) נזרעו בתאי A375 בצפיפות של 3 105 תאים/באר. לאחר מכן, התאים נשטפו עם PBS והוסרו עם 0.5 אחוז נתרן deoxycholate (Sigma). ה-lysate חולק לשלוש קבוצות, ולכל דגימה נוספו 0.1 אחוז L-DOPA (Sigma). לאחר 5 דקות, OD 490 נמדד ו-0.1 אחוז L-DOPA שימש כסטנדרט. מדדנו גם את רמות ה-mRNA והחלבון של TYR. RNA סך הוצא באמצעות ערכת מיני RNeasy (Qiagen, ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב). שעתוק הפוך בוצע באמצעות ערכת ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, יפן). לאחר מכן, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) בוצעה על Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, יפן). הפריימרים מ-Invitrogen מוצגים בטבלה משלימה 1, http://links. lww.com/CM9/A917, ורמת הביטוי של כל mRNA חושבה בשיטת 2*DDCT. רמות ביטוי החלבון נותחו על ידי Western blotting. תאים נשטפו עם PBS וסודרו במאגר RIPA (Beyotime, סין) המכיל phenylmethylsulfonyl fluoride (תערובת מעכבי פרוטאז, 20:1, Sigma-Aldrich). ריכוזי החלבון נמדדו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (Beyotime, סין). החלבון הכולל הורתח ב-70 מעלות למשך 10 דקות, הופרד בג'ל של 4 אחוז -12 אחוז ב-200 וולט למשך 40 דקות, הועבר לממברנה ב-4 מעלות באמצעות 120 mA למשך 75-100 דקות, ולאחר מכן הודגר עם 5 אחוזים. חלב ללא שומן למשך שעה. לאחר מכן נבדקו הממברנות עם נוגדנים אנטי-TYR, אנטי-AhR, אנטי-CYP1A1 ואנטי-CYP1B1 (Abcam) למשך הלילה ב-4 מעלות. נוגדן IgG אנטי-עכבר מצומד חזרת פרוקסידאז (Proteintech, ארה"ב) שימש כנוגדן משני. התוצאות הצביעו על כך ש-PM2.5 העלה את תכולת המלנין ואת פעילות ה-TYR באופן תלוי מינון. הן רמות הביטוי של ה-mRNA והן של החלבון של TYR היו מווסתות [איור משלים 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 יכול להגביר את פעילות ה-TYR על ידי הפעלת מסלול AhR. כדי לקבוע אם PM2.5 משפיע על איתות AhR, זיהינו את רמות השעתוק של AhR והגנים הקלאסיים שלו CYP1A1 ו-CYP1B1 על ידי qRT-PCR ו-Western blotting. התוצאות הראו ש-PM2.5 הגביר את רמות ביטוי ה-mRNA של AhR ו-CYP1A1, כמו גם את ביטוי החלבון של CYP1A1 [איור משלים 2 E-G, http://links.lww.com/CM9/A917].
הפעלת AhR גורמת ליצירת ROS, מה שיכול גם להגביר את פעילות ה-TYR.[5] לפיכך, הערכנו את ייצור ה-ROS באמצעות 20,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA) וציטומטריית זרימה. לאחר 24 שעות של טיפול ב-PM2.5, תאי A375 הודגרו עם DCFH-DA (5 mmol/L) למשך 30 דקות ב-37 מעלות בחושך. תאים נשטפו פעמיים ב-PBS, והקרינה נמדדה על ידי ציטומטר זרימה. עוצמת הקרינה הממוצעת הוכמתה באמצעות תוכנת FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב). מכיוון שייצור ROS המושרה על ידי CYP1A1- נחשב אחראי לתגובה הדלקתית,[5] רמות ביטוי ה-mRNA של ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1a, IL-6, IL{ {19}}, וגורם נמק גידול [TNF]-a) נמדדו. נמצא ש-PM2.5 הגביר את ייצור ROS, כמו גם רמות IL-1a, IL-6 ו-IL-8 mRNA בתאי A375 [איור משלים 2 H ו-I, http ://קישורים. lww.com/CM9/A917].
הממצאים של מחקר זה הצביעו על כך ש-PM2.5 מקדם מלנוגנזה, והגדיל הן את הפעילות והן את הביטוי של TYR בתאי A375. יתר על כן, PM2.5 יכול להפעיל איתות AhR, ולגרום ללחץ חמצוני ותגובה דלקתית, אשר עשויה להיות מפל איתות מלנוגני האחראי להיפרפיגמנטציה.
תודות
אנו מביעים את תודתנו הכנה לגורמים הבאים: פרופ' ד"ר Masutaka Furue ופרופ' ד"ר Tsuji Gaku מבית החולים האוניברסיטאי קיושו ששיפרו את כתב היד ועזרו במידע הקשור ל-AHR. אנו גם אסירי תודה על העריכה האנגלית שסיפק פרופ' ד"ר רוברט שוורץ מבית הספר לרפואה של רוטגרס ניו ג'רזי.
מימון
מחקר זה נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 2101000271).
ניגוד עניינים
אף אחד.
הפניות
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. חשיפה לחלקיקים עדינים הקשורים ללנטיגו סנילי בנשים סיניות: מחקר חתך. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. חומר חלקיקי מקדם היפרפיגמנטציה באמצעות הפעלת איתות AhR/MAPK ועל ידי הגדלת רמות ה-a-MSH הפרקריני בקרטינוציטים. זיהום הסביבה 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. תפקיד פוטנציאלי של PM2.5 במלנוגנזה. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. קולטן פחמימנים Aryl (AhR) יעד אפשרי לטיפול במחלות עור. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. השפעת חומר חלקיקי הנישא באוויר על העור: סקירה שיטתית מאפידמיולוגיה ועד מחקרים במבחנה. חלק סיבים טוקסיקול 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
