ביטוי של סינתאז תחמוצת החנקן העצבי ורנין בכליות דיספלסטיות של כלבים צעירים

תַקצִיר:

רנין וסינתאז תחמוצת חנקן עצבית בכליה שולטים על מערכות המשוב של רנין-אנגיוטנסין ו- tubuloglomerular. המחקר הנוכחי חקר את הביטוי של רנין וסינתאז תחמוצת חנקן עצבית ב-כליות דיספלסטיותשל שלושה כלבים צעירים. רנין-אימוניות, המתרחשת בתאים juxtaglomerular ו-tubular שלכליות דיספלסטיות, לא היה שונה מזה בכליות הרגילות של כלבים צעירים. תאי Macula densa בכליות הנורמליות הראו פעילות חיסונית של תחמוצת חנקן עצבית, אך אלה בכליות הדיספלסטיות לא הראו אותות ברורים. תצפית זו עשויה להיות מתואמת עם המנגנונים הפתולוגיים שלכשל כלייתיבכלבים צעירים.

מילות מפתח: מחלת כליות כרונית, כליות דיספלסטיות, אימונוהיסטוכימיה, סינתאז תחמוצת חנקן עצבית, רנין

למידע נוסף אנא צור קשר:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche לשיפור תפקוד הכליות

כשל כלייתימתרחשת מדי פעם בכלבים צעירים. במקרים כאלה, בדיקה היסטולוגית מדגימה לעתים קרובותכליה דיספלסטיתנגעים. עם זאת, המנגנונים הפתופיזיולוגיים המתרחשים בכליות דיספלסטיותשל הכלבים עדיין לא ברור. לאחרונה, הדגמנו את ההחלשה של cyclooxygenase (COX)-2 במחלות כליות כרוניותבכלבים צעירים עםכליות דיספלסטיותבאמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי [19].

COX-2 הוא אנזים דלקתי הניתן להשראת החיוני להתפתחות תקינה של כליות בשלבי העובר והיילודים [12, 15]. לאחר הלידה, COX-2 מתבטא באופן מכונן בכליה ומתרכז באזור המוגבל של macula densa (MD) של הגפיים העולות העבות [1, 4, 22]. ה-MD הוא אזור מיוחד הסמוך לקוטב כלי הדם של הגלומרולוס. הוא שולט בהפרשת רנין ובמערכת המשוב ה-Tubuloglomerular (TGF). COX-2 המובע בתאי MD מווסת את המנגנונים הללו [6, 8]. בנוסף ל-COX-2, ידוע כי הוא המווסת העיקרי של מערכת ה-TGF (nNOS), המתבטא גם בתאי MD. ידוע ששתי המולקולות הללו, שמתבטאות יחד ב-MD, מקיימות אינטראקציה זו עם זו [2, 5, 9]. במחקר הנוכחי, חקרנו את הביטוי של רנין ו-nNOS בכליות דיספלסטיותעל ידי אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע אם ההחלשה של COX-2 בכליות דיספלסטיותגורם להפרעה של מערכת הרנין-אנגיוטנסין ומערכת ה-TGF בכלבים צעירים.

גושי הפרפין הקבועים בפורמלין שלכליות דיספלסטיותמכלבים צעירים (n{{{{10}}}}), כליות רגילות מכלבים צעירים (n=3), וכליות רגילות מכלבים בוגרים (n=4) היו זהה לאלה ששימשו במחקר הקודם שלנו, שבו ההיסטוריה הקלינית והכנת הרקמה תוארו בעבר [19]. המחקר אושר על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קגושימה, יפן (VM15020). חתכים הוכנו בעובי 3- מיקרומטר, וניתוח אימונוהיסטוכימי עבור רנין ו-nNOS בוצע לפי הפרוטוקולים הבאים: (1) דה-פראפיניזציה; (2) שליפת אנטיגן על ידי חימום במיקרוגל ב-10 מ"מ של חיץ ציטראט (pH 6.0) עבור nNOS; (3) דגירה עם 3 אחוז H2O2 למשך 30 דקות; (4) חסימה עם 3 אחוז אלבומין בסרום בקר (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) עבור רנין או 0.25 אחוז קזאין (Sigma-Aldrich) עבור nNOS, מדולל בתמיסת מלח מאוחסת פוספט, למשך 30 דקות; (5) דגירה למשך לילה ב-4 מעלות עם דילול של 1:3,000 של אנטי-סרום פוליקלונאלי רנין אנטי-רקומביננטי של ארנב (מסופק על ידי ד"ר מורקמי, אוניברסיטת צוקובה, יפן) או 1:3,{{31 }} דילול של אנטי-סרום פוליקלונאלי נגד nNOS של ארנב (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, ארה"ב), בתמיסה חוסמת; (6) דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נוגדן אוניברסלי מצומד פרוקסידאז-פולימר (אנטי אימונוגלובולין עכברים (Ig) G ואנטי-ארנבת IgG; כתם פשוט MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, טוקיו, יפן) ; ו-(7) זיהוי אימונו-אות באמצעות מערכת 3,3ʹ-diaminobenzidine (3,3ʹ-diaminobenzidine tablet; Merck, Darmstadt, גרמניה). עבור קטעי הביקורת השלילית, נעשה שימוש ב-IgG של ארנב רגיל (Lab Vision, Fremont, CA, ארה"ב) במקום הנוגדן העיקרי.

ניתוח מורפומטרי אקראי לאימוני רנין בוצע על פי שיטה שתוארה בעבר [20]. בקצרה, מדד הרנין הוגדר כיחס בין המספר הכולל של העורקים החיוביים לרנין לבין המספר הכולל של הגלומרולי ומבוטא לכל 100 גלומרולים. ההבדלים בין הקבוצות נותחו באמצעות שיטת ההשוואה המרובה של Bonferroni עם SPSS גרסה 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

אבחון היסטופתולוגי בוצע על פי הקריטריונים המיקרוסקופיים של דיספלזיה כלייתית של כלבים על ידי Picut ולואיס [14]. הקטעים ההיסטולוגיים של כל שלושת המקרים הציגו בידול אסינכרוני, המעיד על נוכחות של נגעים עם גלומרולי עובריים/לא בשלים. שינויים משניים בדרגת חומרה משתנה כגון נזק צינורי, פיברוזיס בין-סטיציאלי וגלומרולי טרשתיים נצפו בתוך רקמות הכליה הבוגרות.

בתוך הכליות דיספלסטיות, אותות רנין-אימוניות נצפו בתאים juxtaglomerular (JGCs) (איור 1A), ותאים צינוריים היו ממוקמים בנפרונים הדיסטליים (איור 1B). בחלק מהגלומרולי, כמה תאים הראו אותות חיוביים לרנין ליד הקטבים של כלי הדם (איור 1A). בכליות הבקרה הצעירות, אותות רנין זוהו גם ב-JGCs וגם באבובות דיסטליות, כולל תאי ה-MD. בכליות הביקורת הבוגרות, אותות חיוביים לרנין הוגבלו ל-JGCs. סטטיסטית, מספר האזורים החיוביים לרנין בכליות הדיספלסטיות לא הראה הבדלים מובהקים מאלה בכליות צעירות ובוגרות.

ידוע כי גירוי של ייצור רנין ממלא תפקיד באיתות COX-2, ומחקרים קודמים הוכיחו שפעילות וריכוז רנין בפלזמה ירדו לאחר מתן מעכב COX-2 או בנוק-אאוט של ה-COX גן -2 [10, 11]. בתור הכליות דיספלסטיותשנבדק במחקר הנוכחי לא הראה שום ביטוי של COX כליות-2 [19], הפחתה בסיגנלים האימונו של רנין ב-JGCs נחשדה בתחילה כהפרעה פיזיולוגית אפשרית בכליות הדיספלסטיות. עם זאת, הניתוח האימונוהיסטוכימי הנוכחי לא יכול לאשש השערה זו, ולא הוצעה הפחתה נראית לעין של רנין ב-JGCs. למרות שתפקידו הפיזיולוגי של הרנין הצינורי לא הובהר קודם לכן, טיפול כלייתי בנתרן עשוי להיות תפקיד אפשרי של הרנין הצינורי, מכיוון שהשיפור בביטוי הרנין נגרמה בנפרון הדיסטלי לאחר האכלה דלת מלח בחולדות. [16], והכליות הדיספלסטיות של כלבים שנבדקו במחקר הנוכחי עשויות לשמור על תפקוד צינורי זה.

COX-2 חשוב גם בוויסות מערכת ה-TGF, החשובה לשמירה על קצב הסינון הגלומרולרי. מחקר בחולדות בשיטת המיקרו-ניקור הדגים את דיכוי תגובת ה-TGF לאחר טיפול במעכב COX-2 [2]. תגובת TGF בכליות דיספלסטיותעשוי להיות מוחלש עקב היעדר ביטוי COX-2 כליות. עם זאת, לא דווחו ממצאים רלוונטיים בעבר. בכליה, nNOS מתבטא בתאי ה-MD ועוזר לווסת את מערכת ה-TGF [18].

בניתוח nNOS הנוכחי, לא זוהו אותות ברורים באזורי ה-MD של כל המקרים (איור 2). הפחתה זו של nNOS נחשבה לאירוע אטיופתוגני ב-כליות דיספלסטיותבמקום נרכש לאחר הכשל כלייתימהמקרים. למעשה, המחקר הקודם שלנו באמצעות חולדות OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), כמודל של סוכרת מסוג 2, הוכיח ש-nNOS בא לידי ביטוי יתר ב-MD ובסביבתו תאי צינורית בשלב מאוחר יותר של נפרופתיה סוכרתית [21]. ברגולציה של מערכת TGF, הפונקציה של nNOS דומה לזו של COX-2 ומקיימת אינטראקציה עם זה. כמה מחקרים הציעו ש-nNOS ממוקם במעלה הזרם של מסלול האותות וממריץ את הביטוי של COX -2 [5, 9]. מצד שני, מחקרים אחרים הציעו את ההיפך ש-COX-2 ממוקם במעלה הזרם של NOS אז [2, 13]. ללא קשר להבדל במסלול האיתות, היעדר nNOS-אימונואותות בתאי ה-MD עשוי לעורר ירידה בוויסות הביטוי של COX-2 בכליות בכליות דיספלסטיות.

כמה צינוריות הראו אותות חיוביים עבור nNOS בשני מקרים. במקרה הנותר, צינוריות מורחבות ופחוסות רבות, כנראה בנפרון הדיסטלי, הציגו אותות חיוביים ברורים (איור 3). במקרה זה, עם צינוריות בולטות חיוביות ל-nNOS,

התפתחות רקמות הכליה הייתה הבוסרית ביותר. בכליות נורמליות צעירות ובוגרות, נצפו אותות חיוביים ל-nNOS בגפיים העולות העבות, במיוחד בתאי ה-MD (איור 4). התפלגות ה-nNOS משתנה במהלך מהלך ההתפתחות של הכליה. בכליות מתפתחות של חזירים, nNOS מתפשט באופן נרחב ונצפה בחלקים של הגפה העולה העולה המובילה ל-macula densa [17]. בחולדות, נוכחות של nNOS באבובית הדיסטלית המתפתחת נתקלת כבר בגוף בצורת S מהשלבים המוקדמים ביותר של נפרוגנזה [7]. למרות שהתפלגות ה-nNOS בכליות מתפתחות של כלבים לא נחקרה בעבר, קיימת אפשרות שאותות ה-nNOS הבולטים בצינוריות עשויים להוות עדות לאבוביות הבוסריות מאודכליה דיספלסטיתבמקום הצינוריות הבוגרות הפגומות.

לסיכום, ביטוי רנין ו-nNOS ב-כליות דיספלסטיותמתוך שלושה כלבים צעירים נחקרו אימונוהיסטוכימית במחקר הנוכחי. זה הדגים את ההידרדרות של nNOS בתאי MD עם ביטוי רנין קבוע. הפחתת ביטוי nNOS בתאי ה-MD עשויה להחליש את מערכת ה-TGF של הכליות, וזה עשוי להיות אחד המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיסכשל כלייתיבכלבים צעירים עםכליות דיספלסטיות.

ניגודי אינטרסים פוטנציאליים

לכותבים אין מה לחשוף.

הכרה

חלק מעבודה זו נתמך על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי (מספר מענק 19K06385) מהאגודה היפנית לקידום המדע

מְחַבֵּר

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4)ואוסמו YAMATO1)

1)מעבדה לפתולוגיה קלינית וטרינרית, הפקולטה המשותפת לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת קגושימה, קגושימה 890-0065, יפן

2) בית החולים להוראה וטרינרית באוניברסיטת קגושימה, הפקולטה המשותפת לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת קגושימה, 1-21-24 קורימוטו, קגושימה 890-0065, יפן

3)מעבדה להיסטופתולוגיה וטרינרית, הפקולטה המשותפת לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת קגושימה, קגושימה 890-0065, יפן

4) המעבדה לאנטומיה וטרינרית, הפקולטה לחקלאות, אוניברסיטת איוואט, מוריוקה 020-8550, יפן

הפניות

1. Adegboyega, PA and Ololade, O. 2004. ביטוי אימונוהיסטוכימי של cyclooxygenase-2 בכליות תקינות. יישום אימונוהיסטוכים. מול. מורפול. 12: 71–74. [Medline] [CrossRef]

2. Araujo, M. and Welch, WJ 2009. עיכוב Cyclooxygenase 2 מדכא משוב טובולוגלומרולרי: תפקידים של קולטני Thromboxane ותחמוצת חנקן. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 296: F790–F794. [Medline] [CrossRef]

3. בלנץ, RC, Deng, A., Lortie, M., Munger, K., Vallon, V., Gabbai, FB and Thomson, SC 2002. התפקיד המורכב של תחמוצת החנקן בוויסות של סינון אולטרה גלומרולרי. כליות אינט. 61: 782–785. [Medline] [CrossRef]

4. Câmpean, V., Theilig, F., Paliege, A., Breyer, M. and Bachmann, S. 2003. אנזימים מרכזיים לסינתזת פרוסטגלנדינים כלייתית: ביטוי ספציפי לאתר בכליות מכרסם (חולדה, עכבר). אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 285: F19–F32. [Medline] [CrossRef]

5. Cheng, HF, Zhang, MZ and Harris, RC 2006. תחמוצת החנקן מגרה cyclooxygenase-2 בתאי CTAL מתורבתים דרך מסלול תלוי ap38-. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 290: F1391–F1397. [Medline] [CrossRef]

6. Deng, A., Wead, LM and Blantz, RC 2004. התאמה זמנית של משוב טובולולוגומרולרי: השפעות של COX-2. כליות אינט. 66: 2348–2353. [Medline] [CrossRef]

7. Fischer, E., Schnermann, J., Briggs, JP, Kriz, W., Ronco, PM and Bachmann, S. 1995. Ontogeny of NO synthase and renin in juxtaglomerular apparatus of rat kidneys. אמ. J. Physiol. 268: F1164–F1176. [מדליין]

8. Hao, CM and Breyer, MD 2008. ויסות פיזיולוגי של פרוסטגלנדינים בכליה. אננו. כומר פיזיול. 70: 357–377. [Medline] [CrossRef]

9. Ichihara, A., Imig, JD, Inscho, EW and Navar, LG 1998. Cyclooxygenase-2 משתתף בטון עורקי אפרנטי תלוי זרימה צינורית: אינטראקציה עם NOS עצבי. אמ. J. Physiol. 275: F605–F612. [מדליין]

10. Kim, SM, Chen, L., Mizel, D., Huang, YG, Briggs, JP and Schnermann, J. 2007. רנין פלזמה נמוך ותגובות מופחתות של הפרשת רנין לגירויים חריפים בחסר COX-2- עכברים. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 292: F415 F422. [Medline] [CrossRef]

11. Matzdorf, C., Kurtz, A. and Höcherl, K. 2007. פעילות COX-2 קובעת את רמת הביטוי של רנין אך היא הכרחית להגברת ויסות חריפה של ביטוי רנין בכליות חולדה. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 292: F1782–F1790. [Medline] [CrossRef]

12. Norwood, VF, Morham, SG and Smithies, O. 2000. Postnatal development and progress of renal dysplasia in cyclooxygenase -2 null moce. כליות אינט. 58: 2291–2300. [Medline] [CrossRef]

13. Paliege, A., Mizel, D., Medina, C., Pasumarthy, A., Huang, YG, Bachmann, S., Briggs, JP, Schnermann, JB and Yang, T. 2004. Inhibition of nNOS expression in ה-macula densa על ידי COX-2-פרוסטגלנדין E2. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 287: F152–F159. [Medline] [CrossRef]

14. Picut, CA ולואיס, RM 1987. מאפיינים מיקרוסקופיים של דיספלזיה של הכליות. וטרינר. פאתול. 24: 156–163. [Medline] [CrossRef]

15. Seta, F., Chung, AD, Turner, PV, Mewburn, JD, Yu, Y, and Funk, CD 2009. אפיון כליות וקרדיווסקולרי של עכברי COX-2 נוק-דאון. אמ. J. Physiol. רגיל. מספר שלם. Comp. פיזיול. 296: R1751–R1760. [Medline] [CrossRef]

16. Shao, W., Seth, DM, Prieto, MC, Kobori, H. and Navar, LG 2013. הפעלת מערכת רנין-אנגיוטנסין על ידי דיאטה דלת מלח אינה מגדילה את האנגיוטנסין התוך-צינורית ואנגיוטנסין II בחולדות. אמ. J. Physiol. כליות פיזיול. 304: F505 F514. [Medline] [CrossRef]

17. Solhaug, MJ, Ballèvre, LD, Guignard, JP, Granger, JP and Adelman, RD 1996. תחמוצת החנקן בכליה המתפתחת. רופא ילדים נפרול. 10: 529–539. [Medline] [CrossRef]

18. Wilcox, CS 1998. תפקידה של macula densa NOS במשוב טובולוגלומרולרי. Curr. דעה. נפרול. יתר לחץ דם. 7: 443–449. [Medline] [CrossRef]

19. Yabuki, A., Miyazaki, A., Ichii, O., Kohyama, M., Sawa, M. and Yamato, O. 2016. ביטוי נמוך של cyclooxygenase-2 במחלת כליות כרונית בכלבים צעירים. מילון וטרינר. Sci. 109: 71–73. [Medline] [CrossRef]

20. Yabuki, A., Suzuki, S., Matsumoto, M., Taniguchi, K. and Nishinakagawa, H. 2002. שיטה פשוטה לזיהוי ספציפי של Renin-1. כליות אינט. 62: 2294–2299. [Medline] [CrossRef]

21. Yabuki, A., Tahara, T., Taniguchi, K., Matsumoto, M. and Suzuki, S. 2006. Neuronal nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in diabetic nephropathy of diabetes type 2 OLETF rats. Exp. אנים. 55: 17–25 [CrossRef]. [מדליין]

22. Zhang, MZ, Wang, JL, Cheng, HF, Harris, RC and McKanna, JA 1997. Cyclooxygenase-2 בהתפתחות נפרון חולדה. אמ. J. Physiol.

23: F994–F1002. [מדליין]