ביטוי של אימונוגלובולין G בתאי אפיתל פרוקסימליים צינוריים אנושיים

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

תַקצִיר. מְקוֹרָבצִנוֹרִיתאי האפיתל (PTECs) בעלי מאפיינים חיסוניים מולדים ומייצרים גורמים מעודדי דלקת, כימוקינים ורכיבים משלימים המניעים את המעבר האפיתל-מזנכימלי (EMT). מחקרים קודמים שלנו גילו שתאי מזנגיה אנושיים ופודוציטים היו מסוגלים לסנתז ולהפריש אימונוגלובולין (Ig)A ו-IgG, בהתאמה. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להעריך את הביטוי של Igs ב-PTECs. ראשית, IgG זוהה בציטופלזמה, בקרום התא ובלומן שלPTECsבקליפת הכליה הרגילה על ידיאימונוהיסטוכימיה. שנית, שעתוק גן Ig ו-V(D)J רקומבינציה זוהו ב-PTECs בודדים על ידי PCR מקוננת ורצף Sanger. שלישית, Ig, Igκ ו-Igλ זוהו בבירור בקו PTEC מונצח (HK-2) על ידי צביעה חיסונית ו-Western blotting, שבו נעשה שימוש ב-RP215 (נוגדן שנקשר בעיקר ל-IgG שאינו מקורו בתאי B). בנוסף, תעתיקי גנים Ig , Igκ ו-Igλ, רקומבינציה שמרנית של V(D)J באזור המשתנה של Ig, רקומבינציה מפעילה גן 1/2 וציטידין דמינאז המושרה על ידי הפעלה - כולם זוהו בתאי HK-2. נתונים אלה העלו כי PTECs עשויים לבטא IgG באופן דומה לתאי B. יתר על כן, ביטוי IgG היה מווסת על ידי TGF-1 ועשוי להיות מעורב ב-EMT.

מילות מפתח:מְקוֹרָבצִנוֹרִיתאי אפיתל, חד-תא, HK-2, IgG, מעבר אפיתל-מזנכימלי

Cistanche tubulosa מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדגימה

מבוא

מְקוֹרָבצִנוֹרִיתאי האפיתל (PTECs) הם סוג התאים הנפוצים ביותר ב-כִּליָהויש להם תפקיד חשוב בתיקון כליות ו/או התקדמות של מחלות כליות כרוניות. PTECs מפעילים פונקציות אימונולוגיות על ידי ביטוי של מספר קולטנים דמויי Toll (TLR), כגון TLR 1, 2, 3, 4 ו-9 (1,2), ומולקולות הקשורות לתפקוד תאים מציגי אנטיגן, כולל MHCII, CD74, CD80 ותקליטור 86 (3). מאפיינים חיסוניים מולדים אלו של PTECs מאפשרים להם לפעול כמגיבים חיסוניים למגוון רחב של גירויים, עם ייצור ושחרור מתווכים ביו-אקטיביים, כולל ציטוקינים פרו-דלקתיים, כימוקינים ורכיבים משלימים, המניעים דלקת אינטרסטיציאלית ופיברוזיס (4). PTECs מבטאים גם קולטני Fc של יילודים ומשמרים את היכולת של קישור ספציפי תלוי-PH וטרנסציטוזיס של אימונוגלובולין (Ig)G (5). עם זאת, למיטב ידיעתנו, לא ידוע אם PTECs מבטאים Igs.

השערה בעבר הייתה כי Igs מיוצרים אך ורק על ידי תאי B בוגרים ותאי פלזמה וכי Igs פועלים כנוגדנים לזהות ולנטרל פתוגנים שונים. עם זאת, תיאוריה זו אותגרה בעשורים האחרונים, שכן עדויות מתגברות דיווחו כי Ig, כולל IgA, IgG ו-IgM, יכולים להיות מיוצרים ומופרשים על ידי תאים שאינם B, כגון תאי סרטן אפיתל אנושיים (6,7) ו תאים נורמליים שאינם B (8,9), וכן באתרים מוגנים במערכת החיסון, כגון העיניים (10), נוירונים מרכזיים (11,12), שליה (13), האשך והאפידידימיס (14)

בדומה לאיג'ים שמקורם בתאי B (B-Igs), לא-B-Igs הם גם תוצרים של שעתוק וסידור מחדש של גן Ig ומציגים דפוסי רקומבינציה קלאסיים של V(D)J עם תוספות נוקלאוטידים בצמתים והיפר-מוטציות סומטיות (7, 11,14). בניגוד ל-B-Igs, שאינם B-Igs מציגים דפוסי רקומבינציה מוגבלים של V(D)J ופחות גיוון (7). מבחינה תפקודית, האייג'ים הלא-B-I לא רק מפעילים פעילות נוגדנים טבעית בעור וברירית (8), אלא יכולים גם לשמש כגורמי גדילה לקידום שגשוג והיצמדות תאים, ועשויים לשפר את ההתחלה והגרורות של סרטן על ידי קשירה לאינטגרינים ( 15-17). לדוגמה, RP215 IgG סרטן מזוהה מבצע את תפקידו האונקוגני על ידי אינטראקציה עם קומפלקס האינטגרין 6 4 והפעלת מסלולי FAK ו-Src (15).

המחקר הקודם שלנו הראה שתאים מזנגיאליים (18) ופודוציטים (19) יכולים לסנתז ולהפריש IgA ו-IgG, ולהשתתף בצמיחת תאים והיצמדות תאים במבחנה. המחקר הנוכחי נועד להעריך את רמות הביטוי של Igs ב-PTECs ולחקור את תפקידו הפוטנציאלי במעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT).

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

חומרים ושיטות

תרבית תאים וטיפול.קו PTEC מונצח HK-2 נרכש מ-American Type Culture Collection. תאי HK-2 תופחו ב-DMEM/F12 בתוספת 100 U/ml פניצילין, 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (הכל Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ו-10% סרום בקר עוברי (FBS; מקור אוסטרלי; Biological Industries USA, Inc.) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה המכילה 95 אחוז אוויר ו-5 אחוז CO2. על מנת למנוע את ההפרעה של Ig ב-FBS, המדיום הוחלף במדיום נטול סרום 24-48 שעות לפני קצירת התאים. תאי HK-2 טופלו בריכוזים שונים (2, 5 ו-10 ng/ml) של TGF-1 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA).

בידוד PTEC בודד וסינתזת cDNA.דגימת כליה אנושית של רקמת קליפת המוח תקינה מבחינה מקרוסקופית התקבלה ממטופל (גבר, בן 31) שעובר כריתת כליה כתוצאה מקרצינומה של הכליה ללא הפרעה ברורה של תפקוד הכליות. השעיה חד-תאית הוכנה על ידי עיכול קליפת הכליה עם 1 mg/ml collagenase I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ב-37°C למשך 20 דקות. PTECs מוינו באמצעות אנטי-CD10 מצומד לפיקו-אריתרין (PE) (מספר קטגוריה 312203) ואנטי-CD13 מצומד אלופיקוציאנין (APC) (מספר קטגוריה מס' 301705; שניהם BioLegend, Inc.) לפי מיון תאים פלואורסנטיים מערכת הזמנה מיוחדת BD FACSAria II) כפי שתואר קודם לכן (20). נוגדני בקרת האיזוטיפ המתאימים (מספרי קטגוריה 400111 ו-400119; שניהם BioLegend, Inc.) שימשו כדי לא לכלול צביעה לא ספציפית. תאים חיים בעלי תווית חיובית כפולה בודדו כ-PTECs. PTEC יחיד נבחר באופן ידני תחת מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות פיפטה נימית ולאחר מכן הועבר לצינור PCR דק דופן של 0.2 מ"ל המכילה חיץ תמוגה (21). מיצוי RNA PTEC בודד וסינתזת cDNA בוצעו על פי שיטות שתוארו קודם לכן (21). בסך הכל נעשה שימוש בחמישה PTECs בודדים כדי לזהות שעתוק וסידור מחדש של גן Ig.

הגברה של PCR.סך ה-RNA הופק מתאי HK-2, תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים [PBMCs, שבודדו מתורמת בריאה בת 31 שנה באמצעות Ficoll (קטגוריה מס' 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] וקליפת הכליה (מאותו חולה המשמש בבידוד PTEC יחיד) באמצעות ריאגנט TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), וריכוז ה-RNA הוערך באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . לאחר מכן, 2 מיקרוגרם כולל של RNA הועתקו לאחור ל-cDNA באמצעות ערכת הסינתזה של RevertAid First Strand cDNA (מספר קטגוריה K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR בוצע באמצעות פריימרים המכוונים לאזורים הקבועים של Ig , Igκ, Igλ וציטידין דמינאז (AID) המושרה על ידי הפעלה. Nested PCR בוצע כדי להגביר את האזור המשתנה של Ig, חלבון 2 הקשור לקולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LRP2), וגנים מפעילי רקומבינציה (RAG)1 ו-RAG2. מוצרי ה-PCR הופרדו על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.0 אחוז והוצגו באמצעות GelRed (קטגוריה מס' 41003; Biotium, Inc.). הפריימרים של AID, RAG1/2 והאזורים הקבועים של Ig, Igκ, Igλ המשמשים במחקר זה מתייחסים לפריימרים שבהם השתמש Jing וחב' (19). הפריימרים של האזור המשתנה של Ig מתייחסים לפריימרים המשמשים את Van Dongen וחב' (22). הפריימרים האחרים המשמשים ל-PCR מופיעים בטבלה SI. התנאים התרמו-מחזוריים מפורטים בטבלה SII.

רצף סנגר וניתוח נתוני רצף.תוצרי PCR של האזור המשתנה Ig שהתקבלו מתאי PTEC בודדים, תאי HK‑2 ו-PBMC שובוטו בהתאמה לתוך pGEM-T Easy Vector System I (מספר קטגוריה A1360; Promega Corporation), שעברה טרנספורמציה לתוך TOP10 Competent cells (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). בקצרה, תוצרי קשירה של 5 μl נוספו ל-30 μl תאים מוכשרים TOP10, הודגרו על קרח למשך 30 דקות, הוזעמו בחום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, והודגרו על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, נוספו 500 μl LB והושארו לעמוד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות לפני חיסון חלק מהנוזל החיידקי על צלחות פטרי מצופים ב-0.1 mmol/l IPTG ו-20 μg/ml X-Gal. הכלים הופכים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בסך הכל, 5-16 מושבות לבנות לכל דגימה נבחרו באקראי ורצפו באמצעות מנתח גנטי ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). רצפי ה-V(D)J המחודשים הושוו לאלה בכלי החיפוש המקומי הבסיסי (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) כדי לזהות את מקטעי הגנים והצמתים המתאימים ביותר של קו הנבט לאחר חיתוך פריימר .

ניתוח כתם מערבי.תאי HK‑2 עברו ליטוש במאגר תמוגה של TSD [1 אחוז SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM DTT] המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז (Applygen Technologies Inc.), שעבר צלילים במי קרח למשך דקה אחת ( עובד 5 שניות ומנוחה של 15 שניות; 3 פעמים) ומואר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה ב-12,000 xg למשך 10 דקות ב-4˚C, ריכוז החלבון של ה-lysate התא נקבע באמצעות ערכת BCA (Applygen Technologies Inc.). לאחר מכן, חיץ טעינה מפחית פי 5 נוספה לליזאט, מבושל ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והדגימות שימשו מיד לאנליזה מערבית כתם. סרום, המשמש כביקורת חיובית עבור Ig, בודד מתורם בריא (אותו תורם כמו בשימוש ב-PBMCs) על ידי צנטריפוגה ב-2,103 xg למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

סופג ווסטרן בוצע על פי נהלים סטנדרטיים. בקצרה, חלבונים של 3{{40}} מיקרוגרם הופרדו על ידי SDS-PAGE על 10 אחוז ג'לים והועברו לממברנת ניטרוצלולוזה. לאחר מכן, הממברנה נחסמה בחלב רזה של 5 אחוז בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת והודגרה עם נוגדנים ראשוניים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כולל Ig אנטי-אנושי של ארנב (מספר קטגוריה ab109489; 1:1,{{8} }), ארנב אנטי-אנושי Ig 4 (מספר קטגוריה ab109493; 1:1,000), אנטי-Igκ (מספר קטגוריה ab124727; 1:10,000), אנטי-איגκ Igλ (מספר קטגוריה ab124719; 1:20,000), אקטין אנטי-אנושי של ארנב (מספר קטגוריה ab8227; 1:2,000) (הכל מ-Abcam), ו-RP215 נוגדן חד שבטי (mAb) (נתרם על ידי פרופסור Xiaoyan Qiu, אוניברסיטת פקינג, בייג'ינג, סין; 1:1,000), אשר זיהה ספציפית אפיטופ הקשור לפחמימות על non-B-Ig. לאחר מכן הודגר הממברנה עם נוגדנים משניים נגד ארנב עיזים (קטלוג מס' 926-32211) או נגד עכבר (קטגוריה מס' 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW (שניהם 1:10,{{37}; LI-COR Biosciences) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. האות זוהה באמצעות מערכת Odyssey Imaging ותוכנת Odyssey V3.0 (שתיהן LI-COR Biosciences). תוכנת ImageJ (גרסה 1.8.0; National Institutes of Health) שימשה לכימות למחצה.

טיהור IgG וספקטרומטריית מסה.לאחר תרבית תאי HK‑2 ב-DMEM/F12 ללא FBS במשך 48 שעות, סופרנטנט התרבית נאסף לאחר צנטריפוגה ב-2,103 xg למשך 10 דקות ב-4˚C. הסופרנטנט של התא טוהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון G Sepharose, בהתאם להוראות היצרן (קטגוריה מס' 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). המנקה עבר סינון אולטרה כדי להחליף את חיץ האלוציה (0.1 M Glycine; pH 2.4) ב-PBS. החלבונים המטוהרים הופרדו על ידי SDS-PAGE על 10 אחוז ג'לים, זוהו על ידי Western blotting, ונותחו עוד על ידי ספקטרומטריית מסה, שבוצעה על ידי Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

אימונופלואורסצנטי.תאי HK-2 תורבו על גבי כיסויי כיסוי, שקובעו באצטון קר לא מדולל למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השקופיות נשטפו פעמיים ב-PBS ונחסמו ב-5% FBS/PBS בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים ראשוניים ב-4°C למשך הלילה. הנוגדנים היו זהים לאלו המשמשים ב-Western blotting: Ig אנטי-אנושי ארנב (1:150), Igκ אנטי-אנושי (1:250), Igλ אנטי-אנושי (1:250) ו-RP215 mAb (1:200) ); PBS שימש כביקורת שלילית. לאחר כביסה ב-PBS, השקופיות הודגרו עם נוגדני IgG שכותרתו פלואורססאין איזותיוציאנט (מספר קטגוריה A11008) או עז נגד עכבר (מספר קטגוריה A11001) IgG (1:1,000; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) בטמפרטורת החדר למשך שעה. גרעינים נצבעו ב-DAPI. התמונות נלכדו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

צביעה אימונוהיסטוכימית.קליפת הכליה הפרא-סרטנית נאספו מארבעה חולים גברים (גיל 38-49 שנים) עם קרצינומה של הכליה. קליפת הכליה הפרא-סרטנית התקינה לאחר כריתת הכליה תוקנה עם 10 אחוז פורמלין למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוטבעה בפרפין. דגימות של כליות אנושיות משובצות בפרפין נחתכו לקטעים של 3 מיקרומטר, עברו שחרור מפראפין והוסרו מחדש באמצעות סדרה של ריכוזי אתנול מדורגים. שליפת אנטיגן בוצעה על ידי הרתחה ב-0.05 M Tris-EDTA (pH 9.0) בסיר לחץ למשך 3 דקות. לאחר מכן הדגירה המקטעים עם תמיסת H2O2 של 3 אחוזים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל פרוקסידאז אנדוגני והודגרו עם סרום עזים רגיל (קט. מס. ZLI-9022, ZSGB-BIO, סין) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום לא ספציפי אתרי קשירה של נוגדנים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בוצעה צביעה אימונוהיסטוכימית עקיפה עם נוגדנים ראשוניים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כולל RP215 mAb (1:200; 5 מיקרוגרם/מ"ל), Ig אנטי-אנושי של ארנב (1:2,000), אנטי-אנושי. Igκ (1:1,000), Igλ אנטי-אנושי (1:1,000) (אותם נוגדנים המשמשים ב-Western blotting). קטעים ללא נוגדנים ראשוניים שימשו כביקורות שליליות. לאחר מכן, השקופיות הודגרו עם נוגדנים משניים מסומנים חזרת פרוקסידאז (מס' קטגוריות PV-6001 ו-PV-6002; שתיהן OriGene Technologies, Inc.) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. נוגדנים קשורים זוהו באמצעות diaminobenzidine. לבסוף, השקופיות נצבעו נגד המטוקסילין. התמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה של 200 x). ניתוח סטטיסטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן ונותחו באמצעות SPSS 20.0 עבור Windows (IBM Corp.). כל הניסויים חזרו על עצמם 3 פעמים. ההבדלים בין קבוצות מרובות נותחו באמצעות ANOVA חד כיווני ומבחן הפוסט-הוק של Tukey. פ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

תוצאות

ביטוי IgG בתאי אפיתל צינורי כליה של קליפת הכליה.קליפת כליה תקינה, שנאספו מתורמים שעברו כריתת כליה כתוצאה מקרצינומה של תאי כליה, שימשו לקביעת ביטוי ה-IgG בתאי אפיתל צינורי כליה על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד Ig אנושי, Igκ, Igλ ו-RP215 (נוגדן עיקרי נקשר ללא-B-IgG). צביעה חיובית של שרשראות כבדות וקלות של IgG לא זוהה רק ב-PTECs אלא גם בתאי אפיתל צינורית מפותלת דיסטליים, בציטופלזמה, בקרום התא או בלומן הצינורי (איור 1).

שעתוק וריקומבינציה V(D)J של IgG ב-PTEC יחידים. כדי למנוע הפרעה של שיירי דם, קישור וטרנסציטוזיס של IgG על ידי PTECs בקליפת הכליה, וכדי להשיג עדות ישירה לביטוי IgG ב PTECs, PTECs בודדים מוינו מקליפת הכליה האנושית באמצעות תיוג משותף CD10 ו-CD13 על ידי זרימה ציטומטריה (20). כפי שמוצג באיור 2A, CD10/CD13 PTEC כפול חיובי היוו 4.1 אחוז מהתאים הקיימאים בדגימה. ה-PTECs המבודדים אושרו עוד יותר באמצעות גן הסמן הספציפי LRP2, וזיהום תאי B סולק על ידי CD19. תעתיקי אזור משתנה של Ig הוגברו בחמישה PTECs בודדים על ידי PCR מקונן (איור 2B ו-C). תוצאות רצף Sanger גילו ש-PTECs הפגינו רקומבינציה VDJ פונקציונלית ושמרנית של שרשרת כבדה של IgG (טבלה I), מה שמצביע על כך שביטוי IgG עשוי להתרחש ב-PTECs.

ביטוי של שרשרת כבדה וקלה של IgG בתאי HK-2. מכיוון שהיה קשה לזהות ביטוי של חלבון IgG ב-PTEC בודד ולהשיג מספיק PTECs ל-Western blotting, שורת התאים HK-2, המורכבת מ-PTECs שהונצחו, נבחרה כדי לאשר עוד יותר את ביטוי חלבון IgG. ניתוח אימונופלואורסצנטי הראה צביעה חיובית של Ig, Igκ ו-Igλ בציטופלזמה, וצביעה חיובית חזקה יותר של RP215 בעיקר בציטופלזמה ובממברנת התא (איור 3A).

לאחר מכן, הביטוי של שרשראות IgG כבדות וקלות בתאי HK-2 זוהה על ידי סופג מערבי בתנאים מפחיתים. כדי לחסל הפרעות FBS במדיום התרבות, המדיום המכיל FBS נמחק בנוגדנים מתאימים והוצבע שלילי. נוגדן IgG מסחרי הצליח לזהות IgG שמקורו בסרום אך לא IgG שמקורו ב-HK-2. לעומת זאת, RP215 יכול לזהות IgG שמקורו ב-HK-2, אך לא IgG בסרום. גם נוגדן IgG מסחרי וגם RP215 הצליחו לזהות Ig ב-55 kDa. פס Ig 4 (36 kDa) זוהה בתאי HK-2, בהתאם למשקל המולקולרי החזוי. יתר על כן, ביטויי Igκ (25 kDa) ו-Igλ (50 kDa, dimer) נצפו ב-lysates התא (איור 3B). לאחר מכן, ה-IgG בסופרנטנט של התא טוהר על ידי חלבון G, שאושר על ידי Western blotting ורצף על ידי ספקטרומטריית מסה, אשר הוכיח שרצועת 55-kDa מכילה שברי שרשרת Igκ ו-Ig המשתנה של השרשרת הכבדה, על פי המרכז הלאומי ל מסד נתונים ביוטכנולוגיה מידע (NCBI) (איור 3C-E). נתונים אלה הצביעו על כך שתאי HK-2 ייצרו והפרישו חלבון IgG.

שעתוק וריקומבינציה V(D)J של שרשראות IgG כבדות וקלות בתאי HK-2. שעתוק גן Ig ורקומבינציה פונקציונלית של V(D)J היא תנאי מוקדם לביטוי Ig. כדי לאשר את הביטוי של IgG בתאי HK-2, תעתיקי Ig, Igκ ו-Igλ הוערכו על ידי הגברה של האזורים הקבועים והמשתנים בתאי HK-2 (איור 4A ו-B). רצף של תוצרי PCR הקבועים הציג הומולוגיה גבוהה עם הרצף שפורסם במסד הנתונים של NCBI. שיבוט T-A ורצף Sanger הוכיחו שה-Ig בתאי HK-2 הציג רקומבינציה שמרנית של V(D)J עם VH4-4/D2-8/JH5. לעומת זאת, המגוון של רקומבינציה V(D)J נצפה ב-PBMCs, אשר ביטלו הטיית פריימר (טבלה II). בדומה לתאי B, IgG שמקורו ב-HK-2 הציג רקומבינציה פרודוקטיבית טיפוסית של V(D)J עם חיבורי V-D ו-D-J (איור 4C). יתר על כן, ההיפר-מוטציות הסומטיות זוהו ב-HK-2-ממקורי Ig (טווח, 6.8-8.4 אחוזים) עם 7 מתוך 15 מוטיבים של נקודה חמה (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) המציגים מוטציות.

בנוסף, תעתיקי AID (מרכיב חיוני להיפרמוטציה סומטית ולרקומבינציה של מתג כיתה בתאי B), ו-RAG1 ו-RAG2 [הכרחי לרקומבינציה V(D)J] זוהו בתאי HK‑2 (איור 4B), מה שמצביע על כך המנגנון העומד בבסיס סינתזת Ig בתאי HK-2 עשוי להיות דומה לזה שבתאי B.

TGF‑1 מגביר את ביטוי IgG בתאי HK‑2. תאי HK-2 עוררו עם ריכוזים שונים של TGF-1 למשך 48 שעות. צביעה אימונופלואורסנטית גילתה כי IgG ציטופלזמי הציג צביעה חיובית משופרת בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 5A). סופג מערבי אישר כי IgG היה מווסת באופן משמעותי על ידי TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

דִיוּן

המחקר הנוכחי הוכיח ש-PTECs ביטאו IgG עם שעתוק גנים ורקומבינציה שמרנית פונקציונלית של V(D)J, שהייתה דומה ל-non-B-IgG. TGF-1 הגביר את ביטוי IgG בתאי HK2.

כדי לחקור אם PTECs מבטאים IgG, IgG זוהה לראשונה בציטופלזמה, קרום התא והלומן של PTECs בקליפת הכליה האנושית הרגילה על ידי אימונוהיסטוכימיה; התוצאות הצביעו על כך ש-PTECs יצרו והפרישו IgG. זאת בניגוד לבדיקה הפתולוגית השגרתית שלנו, שבה לא זוהה IgG ברור ב-PTECs. ייתכן שהסיבה לכך היא צביעת PTEC חלשה מאוד, שהייתה נמוכה מדי לגילוי, במיוחד במחלות גלומרולריות הקשורות למערכת החיסון שבהן Igs חיוביים מאוד בגלומרולי וצביעת PTEC עשויה ללכת לא מכוון אך לאבד באופן מלאכותי. טרנסציטוזיס של IgG מהמחזור על ידי PTECs דרך קולטן Fc נשללה חלקית, שכן צביעה ברורה של IgG על ידי RP215 נצפתה בממברנת התא ובציטופלזמה. ממצאים אלו הצביעו על כך ש-IgG שמקורו ב-PTEC היה דומה לשאר לא-B-IgG ועשויים להיות בעלי אפיטופים מסוכרים ייחודיים, אותם ניתן לזהות באופן ספציפי על ידי RP215 במקום נוגדן אנטי-IgG מסחרי (15). הממצא שרק חלק מתאי אפיתל צינורי מבטא IgG עשוי להיות מוסבר על ידי ביטוי דינמי במחזורי תאים שונים, שהיה דומה לדפוס הביטוי של IgA שמקורו בתא מנזגיאלי (18). צביעה משותפת של IgG עם סמנים צינוריים (כגון אקוופורין 1 ואקוופורין 3) תהיה שימושית למחקרים נוספים כדי לשפר את ממצאי המחקר הנוכחי.

רצף RNA חד-תא יכול להציג בבירור את התעתוק של גן ספציפי בתא נתון. תעתיקים של שרשרת Ig ו-V(D)J רקומבינציה זוהו ב-PTECs בודדים. למרות שרק חמישה PTECs בודדים היו בשימוש, התהליך היה קפדני שכן קליפת הכליה נאספה הרחק מהגידול, וכל תא בודד ממוין על ידי ציטומטריית זרימה עם שני גנים סמן ספציפיים ל-PTEC, שאושרו מחדש באמצעות גן סמן ספציפי שלישי (LRP2) וזיהום תאי B בוטל. התוצאות גילו ש-PTECs לא מציגים רק תעתיקי גן IgG אלא גם את הרקומבינציה הקלאסית של V(D)J באזור המשתנה כתאי B, כגון רקומבינציה פרודוקטיבית של V(D)J עם V-D ו-D-J צמתים (איור 4), המצביעים על כך של-PTECs יש פוטנציאל לייצר IgG. בנוסף, הרקומבינציה השמרנית יותר של V(D)J המחישה ש-PTECs מופיעים עם תעתיקי גן IgG ו-V(D)J רקומבינציה הדומים לתאי אחרים שאינם B.

HK‑2, קו PTEC מונצח, קל לתרבית בכמויות גדולות. המחקר הנוכחי אישר ביטוי חלבון IgG בתאי HK-2 מתורבתים; IgG זוהה בתאי HK-2 הן על ידי אימונופלואורסצנטי והן ב-Western blotting. Ig 4, תת-סיווג של Ig, זוהה גם בגודל פס התואם את המשקל המולקולרי החזוי. ספקטרומטריית מסה גילתה שהחלבון שטוהר מהסופרנטנט של התא באמצעות חלבון G הכיל קטעים של האזור המשתנה של השרשרת הכבדה של Ig ושל שרשרת Igκ, מה שסיפק עדות להפרשת IgG על ידי PTECs. שעתוק IgG בתאי HK-2 תמך עוד יותר בביטוי IgG ב-PTECs, והקומבינציה השמרנית של V(D)J עם IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5 בתאי HK-2 תמך עוד יותר בנוכחות IgG בתאי HK-2 דומים לתאים אחרים שאינם B.

המחקר הנוכחי חקר גם את המנגנון הבסיסי של ייצור IgG ב-PTECs על ידי בחינת התעתיק של RAG1, RAG2 ו-AID בתאי HK-2. התגלה כי RAG1, RAG2 ו-AID הועתקו בתאי HK-2. בנוסף, תעתיקי RAG1, RAG2 או AID זוהו בעבר במספר רב של תאים אחרים שאינם B, כגון פודוציטים (19) וכמה שורות תאים סרטניים (23). תוצאות אלו הצביעו על כך שלתאים שאינם B, כולל PTECs, עשויים להיות מנגנונים דומים של סינתזת Ig לתאי B. עם זאת, האם AID ו/או RAG1/2 הם גנים הכרחיים עבור IgG שמקורו ב-PTEC דורשת בדיקה נוספת. בנוסף, תאי CD4 T עוזרי זקיק חשובים לוויסות ההתמיינות של תאי B של מרכז הנבט לתאי פלזמה ולתמוך בייצור Igs (24). הנתונים שטרם פורסמו גילו כי לא-B-Igs עדיין זוהו בעכברי NOD-SCID חסרי תאי T ו-B, מה שמצביע על כך שלא-B-Igs לא היו תלויים לחלוטין בתאי עוזר T. האם תאי עוזר T נדרשים ל-PTECs לבטא IgG דורש מחקר נוסף.

ל-TGF‑1 יש תפקיד חיסוני מרכזי בייצור Ig. לדוגמה, TGF-1 גרמה להחלפת מחלקות IgA והפרשה בתאי B מגורים בטחול עכבר (25) ובתאי B שקדים אנושיים (26). McIntyre וחב' (27) הדגימו ש-TGF-1 גירוי באופן סלקטיבי הפרשת IgG2b על ידי תאי B המופעלים על ידי ליפופוליסכריד, ככל הנראה על ידי השראת מתג IgM ל-IgG2b. Duan וחב' (28) הדגימו ש-TGF-1 הגביר את ביטוי IgA על ידי הסדרת גורם השעתוק Ets-1 בתאי סרטן אפיתל. המחקר הנוכחי הוכיח ש-TGF-1 הגביר את ביטוי IgG בתאי HK-2. בהתחשב בכך שרק IgG זוהה בתאי HK-2, ההשערה הייתה ש-TGF-1 משרה ביטוי IgG ללא תלות בהחלפת מחלקות Ig. המנגנון הרגולטורי של ייצור IgG על ידי TGF-1 דורש חקירה נוספת.

PTECs ממלאים תפקיד חשוב בפיברוזיס בין-סטיציאלי צינורי באמצעות EMT ו-TGF-1 פועל כמתווך פרופיברוטי מאסטר. במחקר הנוכחי, הוספה של TGF-1 לתאי HK-2 בתרבית הגבירה את ביטוי IgG, מה שמצביע על כך ש-IgG שמקורו ב-HK-2 עשוי להיות קשור באופן חיובי ל-EMT. מחקרים קודמים דיווחו שסרטן-IgG היה קשור לגרורות וקידם EMT על ידי הפחתת E-cadherin בקרצינומה ציסטית של אדנואיד רוק (29) וסרטן ריאות (30). כדאי לחקור אם IgG שמקורו ב-PTEC עשוי לשמש תפקיד ב-EMT של צינורית כליה ופיברוזיס בין-סטיציאלי בתנאי מחלה, כגון פציעת איסכמיה/פרפוזיה חוזרת אומחלת כליות כרונית.

לסיכום, למיטב ידיעתנו, המחקר הנוכחי היה הראשון שהוכיח ש-PTECs יכולים לבטא ולהפריש IgG, ו-TGF-1 יכול להגביר את ביטוי IgG בתאי HK-2. עם זאת, התפקיד הפוטנציאלי של IgG שמקורו ב-PTEC בפיברוזיס tubulointerstitial דורש חקירה נוספת.

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

מימון

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82070736, 91642109 ו-81870488), הקרן למדעי הטבע של Hainan (מענק מס' 819QN355), הקרן לטיפוח מחקר מדעי של האוניברסיטה הרפואית של Hainan (מענק מס'. HYPY201926), ופרויקטי התמיכה העיקריים של תוכנית המחקר העיקרית של הקרן הלאומית למדעי הטבע (מענק מס' 91642206).

זמינות נתונים וחומרים

מערכי הנתונים ששימשו ו/או נותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים מהמחבר המתאים לפי בקשה סבירה.

תרומות מחברים

בתור המחברים המקבילים, YW ו-XQ הגו ועיצבו את המחקר. ZD השתתפה בתכנון המחקר, ביצעה ניסויים היסטולוגיים ותאי יחיד, הכינה דגימות לספקטרומטריית מסה, ניתחה נתונים וכתבה את כתב היד. ZJ השתתף בתכנון המחקר, ברוב הניסויים לגבי ביטוי IgG בתאי HK-2, וניתוח נתונים רלוונטי. YG, JM, HD ו-YL ביצעו ניסויים חלקיים בקו תאים. ZC ו-YP בחרו מקרים מתאימים לניסויים בתא בודד על פי מאפיינים קליניים. HY ו-ZS השתתפו בניסויים חד-תאיים. SW השתתף בצביעה אימונוהיסטוכימית, ניתח נתונים של צביעת רקמות, ניסח ותיקן את כתב היד. YW, ZD ו-ZJ אישרו את האותנטיות של כל הנתונים הגולמיים. כל המחברים בחנו את כתב היד ותיקנו את הנתונים. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.

אישור אתיקה והסכמה להשתתפות

המחקר הנוכחי תאם את עקרונות הצהרת הלסינקי, ואושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין (אישור מס' S2020121) ונערך בהתאם לפרוטוקול. כל התורמים תרמו מרצון קליפת כליות וסיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני תרומת קליפת הכליה למחקר. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות הרלוונטיות. דגימות אלו היו אנונימיות לחלוטין. סרום אנושי ו-PBMCs, המשמשים כביקורות חיוביות ב-Western blotting או בשעתוק הפוך-PCR במחקר הנוכחי, התקבלו מדם של מתנדב בריא, שסיפק הסכמה מדעת בכתב לדגימה.

השפעות של cistanche: מועיל לכליה

הפניות

1. Schlondorff DO: סקירה של גורמים התורמים לפתופיזיולוגיה של מחלת כליות מתקדמת. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et אל: קולטנים דמויי אגרה, אימונופרוטאזום ותאי T מווסתים בילדים עם ארגמן Henoch-Schonlein ונפרופתיה ראשונית של IgA. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G ו- Neumann K: תאי אפיתל צינורי פרוקסימלי של הכליה מפעילים תפקוד אימונומודולטורי על ידי הנעת תגובות דלקתיות של CD4 פלוס תאי T. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL ו-Lan HY: פגיעה באבובית הכלייתית: כוח מניע לעבר מחלת כליות כרונית. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C ו-Tomino Y: טרנסציטוזיס בתיווך FcRn של אימונוגלובולין G בתאי אפיתל פרוקסימליים של הכליה האנושית. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et אל: סרטן אפיתל אנושי מפריש אימונוגלובולין g עם ספציפיות לא מזוהה כדי לקדם צמיחה והישרדות של תאי גידול. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et אל: לתמלילים גנים של אימונוגלובולינים יש מאפייני רקומבינציה מובהקים של VHDJH בתאי סרטן אפיתל אנושיים. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et אל: IgG ו-IgA עם פעילות פוטנציאלית לקישור חיידקים מתבטאים על ידי תאי עור אנושיים נורמליים. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X ו-Wang B: Immunoglobulin M, מולקולה חדשה של תאי שריר הלב של עכברים. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W ו-Gu J: ביטוי והפצה של אימונוגלובולין G והקולטנים שלו באתר חסון חיסוני: העין. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J ו-Qiu XY: ביטוי של גן אימונוגלובולין עם סידור מחדש קלאסי V-(D)-J בנוירונים במוח של עכבר. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C ו-Gu J: ביטוי והפצה של אימונוגלובולין G והקולטנים שלו במערכת העצבים האנושית. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W ו-Gu J: שני דפוסי הפצה אולטרה-סטרוקטורליים של אימונוגלובולין G בשליה אנושית והשלכות תפקודיות. ביול רפרוד 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P, ו-Qiu X: ביטוי של גן אימונוגלובולין עם סידור מחדש קלאסי של V-(D)-J באשך עכברים ואפידידימיס. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et אל: תאי קרצינומה של תאי קשקש ריאות מבטאים IgG לא-קנוני עם גליקוזילציה המפעיל איתות אינטגרין-FAK. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q, ו-Zhao Y: ביטוי גבוה של אימונוגלובולין מסוג גליקוזיל שמקורו בסרטן מנבא פרוגנוזה גרועה באדנוקרצינומה של צינורית הלבלב. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q ו-Zhao YP: אימונוגלובולין G שמקורו בסרטן: סמן חדש לאבחנה מבדלת וחיזוי הישנות בקרצינומה של בלוטת התריס. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X, ו-Wang Y: ביטוי של אימונוגלובולין A בתאים מנזגיים אנושיים והשפעותיו על אפופטוזיס והידבקות של תאים. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X ו-Wang Y: ביטוי של אימונוגלובולין G בפודוציטים אנושיים, ותפקידו בכדאיות התא והיצמדות. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et אל: בידוד ואפיון של מודל תאי אפיתל צינורי פרוקסימלי ראשוני מהכליה האנושית על ידי תיוג כפול CD10/CD13. PLoS One 8: e66750, 2013.