מחקר ניסיוני של ההשפעה המגנה של טיפול מקדים ב- Cistanche Glycosides על פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Zhu Jun, Zhao Ximin

(מחלקת כירורגיה, בית החולים המחוזי באושן לרפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת, שנחאי 201900)

【תַקצִיר】מטרה להקים מודל החייאה של הלם דימומי בחולדות ולבחון את ההשפעה המגנה שלCistancheסך גליקוזידים (CTG) על פגיעת איסכמיה כלייתית-רפרפוזיה. שיטות חולדות SD חולקו באופן אקראי ל-3 קבוצות: קבוצת ניתוח מדומה, קבוצת ניסוי (קבוצת החייאת הלם), קבוצת טיפול ב-CTG, 10 חולדות בכל קבוצה. קבוצת הניסוי וקבוצת הטיפול ב-CTG הקימו מודלים של איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית. לחולדות בקבוצת הטיפול הוזרק CTG 400 מ"ג/ק"ג תוך צפק, ולקבוצת הניסוי ולקבוצת הניתוח הדמה הוזרקו תמיסת מלח. תכולת שריר הלב בדם, תכולת חנקן אוריאה וציסטטין C של כל קבוצה זוהה כדי לקבוע את תפקוד הכליות, ניתוח ציטומטריית זרימה שימש כדי לזהות שיעור אפופטוזיס של תאי כליה; בדיקת חיסונית מקושרת אנזים (ELISA) שימשה לזיהוי קישור כרומוזום X בחולדהכִּליָהרקמות ביטוי של מעכב X-linked של חלבון אפופטוזיס (XIAP). תוצאות בהשוואה בין קבוצת ה-CTG לקבוצת הניסוי, Cr בדם, BUN ו-Cystatin C הופחתו באופן משמעותי (P<0.01), renal="" cell="" apoptosis="" was="" reduced=""><0.05), ctg="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap=""><0.05). conclusion="" the="" total="" glycosides="" of="">cistancheיש השפעה מגנה על פגיעת איסכמיה-פרפוזיה כלייתית בחולדות, אשר עשויה להיות קשורה לקידום הביטוי של XIAP.

[מילות מפתח] כִּליָה; פציעת איסכמיה-פרפוזיה מחדש; סך הגליקוזידים של cistanche; מעכב חלבון אפופטוזיס מקושר לכרומוזומים; אפופטוזיס; עכברוש

[מספר סיווג הספרייה הסינית] R692 [קוד סימון מסמך] A [מספר מאמר] 1008 -0392 (2015) 02-0037 -04

לחץ כדי Cistanche חילוץ אבקה לכליות

פציעת איסכמיה-רפרפוזיה (I/R) היא תופעה פתופיזיולוגית שכיחה של נזק לכליות בתהליך של הלם דימומי, טראומה קשה,כִּליָההשתלה, וכִּליָהניתוח גידול. מחקרים הראו כי אפופטוזיס הוא חלק חשוב מנזק לתפקוד הכליות הנגרם כתוצאה מפגיעת I/R (1). מעכב X-linked of apoptosis protein (XIAP) הוא אחד ממעכבי האפופטוזיס האנדוגניים החזקים ביותר שנמצאו עד כה (2). ישנם מעט מחקרים על ההשפעה האנטי-אפופטוטית של XIAP ברקמת הכליה לאחר פציעת I/R.Cistancheסך גליקוזידים (CTG) הוא תרכובת סך גליקוזידים פניליתנואידים המופקים ממנהCistanche, בעל תפקידים ביולוגיים מגוונים. ישנם מעט מחקרים על ההגנה הכלייתית שלו לאחר פציעת I/R. . מחקר זה הקים מודל של החייאת הלם דימומי בחולדות והקים מודל של פציעת I/R מערכתית כדי לחקור את ההשפעה המגנה של סך הגליקוזידים של בקע בשר עלכִּליָהמפציעת I/R ולחקור את המנגנון האפשרי שלה.

1 חומרים ושיטות

1.1 בעלי חיים וקיבוץ

ישנם 30 חולדות זכרים נקיות ובריאות המסופקות על ידי המרכז הניסויים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית, במשקל (320 ± 30) גרם. חלוקה אקראית ל-3 קבוצות: קבוצת ניתוח מדומה, קבוצת ניסוי (קבוצת החייאה בהלם), קבוצת CTG, כל אחת עם 10 חולדות.

1.2 ריאגנטים ומכשירים עיקריים

סך הגליקוזידים של אורז דביק (מספר אצווה: 20081516) נרכש מ- Zhejiang Hangzhou Xinghui Tianli Pharmaceutical Co., Ltd.; נתרן פנטוברביטל, Hoechst 33258, ו-propionyl iodide נרכשו מסיגמא, ארה"ב; ערכת בדיקת חלבון (XIAP) וערכת ELISA נרכשו מ- Shanghai Kemin Biotechnology Co., Ltd.; קורא microplate נרכש מחברת Thermo, ארה"ב; גלאי פיזיולוגי רב פרמטרים נרכש מחברת Nihon Kohden, יפן; ציטומטר זרימה BDFACSAria נרכש מחברת Becton, ארה"ב - Dickinson Company; טרוקר 24G נרכש מחברת Shandong Jierui Medical Devices.

1.3 שיטה נסיונית

1.3.1 הכנת חולדות SD מודל בעלי חיים צמו 12 שעות לפני הניסוי והורדמו על ידי הזרקה תוך צפקית של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג).

החולדה הייתה מקובעת בשכיבה, בוצע חתך של 3 ס"מ בבטן התחתונה השמאלית, עורק הירך הופרד, הוחדר טרוקר 24G וחבר גלאי פיזיולוגי רב פרמטרים. לחץ הדם הממוצע של החולדה נמדד כ- (113 ± 15) ממ"כ, 20 מ"ל מזרק הפרין לחץ הדם ירד ל-40 ממ"כ (l mmHg=0. 133 kPa) עם מכשיר תלת כיווני לחיבור כימי. ההלם נחשב כאילו התחיל, ולחץ הדם נשמר במשך 90 דקות. נפח הקזת הדם היה (13 ± 3) מ"ל, ולאחר מכן הדם העצמי במזרק אינפוזיה איטית נמשכת כ-30 דקות, ולחץ הדם חוזר ליותר מ-90 אחוז מהערך הבסיסי, וההחייאה נחשבת מוצלחת (3). . הטרוקר נשלף החוצה, עורק הירך נקשר והחתך נתפר. לאחר שהחולדות היו ערות, הן הוחזרו לכלוב לצורך תצפית, והן היו חופשיות לאכול ולשתות. 24 שעות לאחר ההחייאה, הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) שימשה להרדמה, לפרוטומיה, 5 מ"ל דם נאסף מהווריד הנבוב התחתון, החולדות הוקרבו מיד, והכליות השמאלית והימנית הוצאו עבור להשתמש.

1.3.2 שיטות טיפול בקבוצת הטיפול ב-CTG ניתנה CTG 2 שעות לפני הקזת הדם של החולדות והוזרק לחלל הבטן במינון של 400 מ"ג/ק"ג. לקבוצת הניסוי הוזרק תוך צפק עם 3 מ"ל של מי מלח רגיל שעתיים לפני הקזת הדם; קבוצת הניתוח הדמה עברה רק הרדמה, לפרוטומיה והפרדה של עורק הירך, הנחת טרוקר ותפר של החתך, אך ללא דימום או החייאה. השאר היו זהים לקבוצת הניסוי.

1. 4 אינדיקטורים ושיטות זיהוי

1.4.1 קביעת תכולת BUN, Cr וציסטטין C בדם Cystatin C הוא סמן אנדוגני לשינויים בקצב הסינון הגלומרולרי. כאשר תפקוד הכליות נפגע, קצב הסינון הגלומרולרי יורד, ריכוז הציסטטין C בדם יכול לעלות פי 10, ודיוק האבחון של ציסטטין C טוב משמעותית מזה של שיכרון שריר בסרום. תכולת BUN, Cr ו-Cystatin C בדם הוגשה למעבדה של בית החולים שלנו לקביעה.

1.4.2 קביעת קצב האפופטוזיס בתאים נעשה שימוש ב-Flow cytometry לזיהוי קצב האפופטוזיס של תאי כליה. קחו את הכליה וקוצצים אותה בעזרת להב, מוסיפים מעט PBS ומעבירים למבחנה. הוסף 0.3 אחוז טריפסין לעיכול באמבט מים 37 P, דגירה במשך 20 דקות, כאשר התוכן במבחנה הופך עכור, הוסף 2 פעמים PBS כדי לעצור את העיכול, סנן עם רשת ניילון 300 רשת, השליכו זיהומים וצנטריפוגה בצנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה. רדיוס צנטריפוגה 8 ס"מ, 12, 000 r/min, צנטריפוגה למשך 5 דקות, השלך את הסופרנטנט, התאם את ריכוז התא ל-1 ~ 1.5 x 106/ml, קח 0.4 מ"ל מתרחיף התאים שלעיל, והוסף 1.2 מ"ל Hoechst 33258 (10 פיל/מ"ל), כהה 37 ט': דגירה באמבט מים, מכסה את המבחנה, שטיפה עם PBS לאחר 5 דקות, רדיוס צנטריפוגה 8 ס"מ, 12 000 r/min, צנטריפוגה למשך 5 דקות , לזרוק את הסופרנטנט, לשטוף שוב באותו אופן. הוסף 0.4 מ"ל של PI, מוכתם למשך 5 דקות, וגלה את אחוז התאים הנורמליים, הנמקים והאפופטוטיים בכליה. לפי הזיקה של שני הצבעים של סוגים שונים של תאים, ידוע שרק תאים בצבע PI הם תאים מתים, רק תאים צבעוניים של Hoechst 33258 הם תאים אפופטוטיים, ואף אחד מהם אינו תאים חיים רגילים צבעוניים.

1.4.3 בדיקת חיסונית מקושרת אנזים (ELISA) לאיתור ביטוי XIAP ברקמות כליה של חולדה קח כל קבוצת כליות וטפל ברקמות כליות טריות עם ליזאט רקמות. צנטריפוגה בצנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ב-12 000 r/min למשך 5 דקות. קח את הסופרנטנט והפעל לפי ההוראות של ערכת ה-XIAP ELISA Kit. Shanghai Jiaotong University Fenghe Technology Co., Ltd אחראית על הבדיקות.

1.5 עיבוד סטטיסטי

הנתונים הניסויים של כל קבוצה מיוצגים על ידי Yuan soil s, ו-SPSS 17. תוכנת 0 משמשת לניתוח סטטיסטי. פ<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

Cistanche יכול לשפר את התפקוד המיני

2 תוצאות

ערכי תפקודי כליות Cr, BUN ו-Cystatin C היו מובהקים סטטיסטית (F<0.01); the="" experimental="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" the="" sham="" operation="" group="" (p=""><0.01), indicating="" that="" the="" rat="" the="" kidney="" i/r="" model="" was="" successfully="" prepared;="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" values="" of="" cr,="" bun="" and="" cystatin="" c="" in="" the="" ctg="" group="" were="" significantly="" reduced=""><0.01). renal="" cell="" apoptosis="" rate:="" in="" the="" sham-operated="" group,="" only="" a="" few="" cells="" in="" the="" kidney="" tissue="" experienced="" apoptosis.="" apoptotic="" cells="" accounted="" for="" 0.42%="" ±="" 0.08%,="" and="" the="" experimental="" group="" had="" a="" significant="" increase="" in="" apoptosis,="" accounting="" for="" 18.="" 22%="" ±="" 5.="" 32%="" (p=""><0.01). compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" showed="" apoptosis="" the="" number="" decreased="" to="" 12.71%="" ±="" 3.81%="">< 0.01).="" the="" effect="" of="" ctg="" on="" the="" expression="" of="" xiap="" in="" i/r="" injured="" renal="" tissue:="" the="" sham="" operation="" group="" only="" had="" weak="" xiap="" expression,="" while="" the="" experimental="" group="" xiap="" expression="" increased="" significantly,="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap="" (f=""><0.05), see="" table="">

טבלה 1 תפקודי כליות מציינת את ערכי Cr, BUN ו-Cystatin-C של חולדות בכל Tab של קבוצה. 1 מדדי תפקודי כליות בשלוש קבוצות

בהשוואה לקבוצת המבצעים הדמה, *פ<0.01; compared="" with="" the="" experimental="" group,=""><0.05><>

המנגנון של פגיעה בכליות איסכמיה-רפרפוזיה מסובך מאוד. זהו תהליך פתולוגי המתרחש בדרכים רבות תחת פעולתם של גורמים שונים, כגון עומס יתר של יוני סידן, נזקי חמצון שומנים, אפופטוזיס של תאים ונמק, ביניהם אפופטוזיס תאים תלוי-קספאז היא אחת הצורות העיקריות של תאי אפיתל צינורי כליה. נזק שנגרם עקב פגיעה בכליות I/R (4). משפחת המעכבים של חלבון האפופטוזיס (IAP) הוא מעכב הקספאז האנדוגני היחיד שנמצא בתאי יונקים עד כה, שיכול למנוע ביעילות את התרחשות אפופטוזיס התא. XIAP הוא החבר בעל ההשפעה המעכבת החזקה ביותר על קספאז במשפחת IAP. זה יכול לעכב אפופטוזיס של תאים הנגרמת על ידי מגוון גירויים פתולוגיים ולשחק אפקט מגן על איברים פגומים (5).

כיום, רוב השיטות לביסוס מודלים של בעלי חיים של פגיעה ב-I/R כלייתית הן הסרת כליה אחת והידוק הצד השני של עמוד הכליה או עורק הכליה ⑹ כדי לדמות את מצב השתלת הכליה. מחקר זה משתמש במודל של הלם/החייאה דימומי, הקרוב יותר לתהליך הפתופיזיולוגי של איסכמיה-פרפוזיה מערכתית המתרחשת בהלם טראומטי קליני. בניסוי זה, רמות ה-BUN, Cr ו-Cystatin C בדם של חולדות SD שיפור משמעותי, פגיעה חמורה בתפקוד הכליות, הוא מודל חיה אידיאלי לחקר פגיעה בכליות I/R.

CTG הוא מרכיב רפואי חשוב של משחת בשר ילדות ברפואה סינית מסורתית. משחת חצילים, שהיא חמימה באופייה, מתוקה ומלוחה, חוזרת למרידיאן הכליות והמעי הגס ונמצאה במקור ב-Materia Medica של Shennong. "בן סוטרה": חמש צירים עיקריים ושבע פציעות, להזין את האמצע, להזין את חמשת האיברים הפנימיים, לחזק את היין, להזין את המהות והצ'י;Cistancheנמצא בשימוש בארצי כבר אלפיים שנה. הוא מדורג במקום הראשון בפורמולות מגבירות כוח בעבר ומדורג במקום ה-2 בפורמולות הזנה לאחר ג'ינסנג. מחקרים הראו זאתCistancheפחיתלשפר את התפקוד המיני, לווסת את הנוירואנדוקרינית, ולשפר את התפקוד החיסוני. , נוגדי חמצון, לקדם את חילוף החומרים, להגן על שריר הלב האיסכמי ותפקודים אחרים. כמרכיב הרפואי העיקרי של מחית בשר משפחתית, ל-CTG תפקידים רבים. מחקר על מודלים של איסכמיה-פרפוזיה מוחית מצא ש-CTG יכול להפחית את חומצות האמינו המעוררות ברקמת המוח לאחר איסכמיה-רפרפוזיה ולהגן על רקמת המוח של חולדות SD (7). ל-CTG ישהשפעה נוגדת חמצוןעל רקמות עכברים ויש לו השפעה מגנה מסוימת על היפוקסיה מוחית חריפה בעכברים ונזק לשרירי הלב בעכברים (9). CTG יכול לשפר משמעותית את ההתנהגות הנוירובית שלפרקינסוןמדגמים עכברים ומעכבים את הירידה במספר הנוירונים של דופמין ב-substantia nigra (9). על ידי שיפור הפעילות של אנזימים שוללי רדיקלים חופשיים, מניעת חמצון שומנים, עיכוב שקיעת פפטיד B-עמילואיד במוח ועיכוב אפופטוזיס של תאי מוח, CTG משפר משמעותית את הלמידה שלמחלת אלצהיימרעכברים שנגרמו על ידי B-amyloid peptide יכולת זיכרון w. מחקר זה הראה כי לאחר יישום של טיפול מקדים ב-CTG, תכולת ה-BUN, Cr ו-cystatin C בדם של חולדות ירדה באופן משמעותי, והנזק הכלייתי ירד. CTG הגביר את החלבון מעכב האפופטוזיס XIAP ברקמת כליה פגועה ב-I/R וחסמה אפופטוזיס של תאים. להתרחשות המוות יש השפעה מגנה על הנזק לכליה.