מחקר ניסיוני של מנגנוני אנטי עייפות ספורטיביים של Cistanche Deserticola

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

YANG Hong-Xin,YANG Yong²,YAN Xiao-hong'

תַקצִיר:מטרה לחקור את ההשפעה שלcistanche deserticolaעל איזואנזים לקטאט דהידרוגנאז (LDH), גליקוגן וחנקן תחמוצת סינתאז 3 (NOS3) של הכבד בעכברים מכבידים על שחייה וחוקרים מנגנונים מולקולריים רלוונטיים שלעייפות נגד ספורט. שיטה העכברים חולקו לקבוצת הביקורת הרגילה, קבוצת הביקורת הספורטיבית וה-cistanche deserticolaקבוצת ניסוי. כל עכבר מקבוצת הביקורת הרגילה וקבוצת הביקורת הספורטיבית קיבלה מי מלח 0.2 מ"ל ליום. כל עכבר מקבוצת הניסוי cistanche deserticola קיבל מרתח מיםcistanche deserticola0.2 מ"ל (3 גרם/ק"ג ליום. הניתוחים נמשכו 15 ימים. השחייה בנטל במשך 90 דקות בוצעה על העכברים של קבוצת הביקורת של הספורט ושלcistanche deserticolaקבוצת ניסוי בשעה אחת לאחר המתן האחרון. הכבדים של העכברים הוסרו לאחר 10 שעות של שחייה. חלק אחד של הכבד היה מקובע בנוזל הפורמלין הנייטרלי להכנת קטעי הפרפין והאחרים שימשו למדידת פעילות LDH. מבנה הכבד נצפה על ידי צביעה של HE והגליקוגן בכבד נמדד על ידי צביעה של גליקוגן. NOS3 נבדק בשיטה אימונוהיסטוכימית SP. Rei מבנה הכבד של קבוצת הביקורת הספורטיבית נפגע קשה, האיזואנזים של LDH4 ו-LDH5 היו גבוהים יותר, הגליקוגן בכבד היה גרוע, NOS3 ירד בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group=""><0.05). conclusion:="">Cistanche deserticolaיכול להפחית את LDH5, להגן על הכבד של שוחות העכברים, ולהאיץ את הצטברות הגליקוגן על ידי הגברת הביטוי של NOS3 כדי להגן על הכבד ולשפר את התאוששות היכולת הגופנית.

מילות מפתח; cistanche deserticola;גליקוגן בכבד; תחמוצת החנקן סינתאז 3; עכברים

Cistanche, הידוע גם בשם Dayun, הוא עשב טפיל בן שנתיים ממשפחת ה-Lydanaceae. יש לו גבעולים בשרניים יבשים עם קשקשים. הוא מיוצר בעיקר בקרקעות חוליות ובשטחי דשא חוליים למחצה במונגוליה הפנימית, גנסו, שינג'יאנג וצ'ינגהאי.Cistancheבמונגוליה הפנימית יש את האיכות הטובה ביותר מבין אזורי הייצור.Cistancheהוא מתוק, מלוח וחם באופיו. הוא חודר למרידיאן הכליות והמעי הגס. תפקידו העיקרי הוא להמריץ את הכליה ולחזק את היאנג, להזין את התמצית והדם ולהזין את המעיים. הוא משמש לעתים קרובות לטיפול באימפוטנציה, אי פוריות, חולשה במותניים ובברכיים, חולשת שרירים ועצמות, מעיים יבשים ועצירות. . מטרת מחקר זה היא לבחון את ההשפעות שלCistancheעל הכבד lactate dehydrogenase (LDH), גליקוגן כבד וחנקן אוקסיד סינתאז 3 (NOS3) בעכברי שחייה נושאי משקל באמצעות בדיקת שחייה נושאת עומס בעכברים, וכדי לחקור את מנגנון ההגנה שלו על הכבד, ספק בסיס תיאורטי עבור המחקר, הפיתוח והניצול המעמיק שלCistancheבספורט מזון בריאות.

1 חומר ניסוי

1.1 בעלי חיים 30 חולדות קונמינג זכרים, כיתה נקייה, משקל (20±0.5) גרם, מסופק על ידי מרכז החיות של אוניברסיטת מונגוליה הפנימית.

1.2 Medicine Cistanche (Cistanche deserticolaYC Ma) מיוצר ב-Ejina Banner, מונגוליה הפנימית, וזוהה. לפי החומר הרפואי המקורי: מים=100גרם: 400 מ"ל, משרים למשך 30 דקות, מחממים ומרתיחים, ואז מבשלים על אש חמה למשך 30 דקות, שופכים את התמיסה הרפואית ומקשטים מחדש ביחס של 100 גרם: 200 מ"ל. מערבבים את שתי המרתחים יחד, מסננים אותם בשתי שכבות גזה, ולאחר מכן רכזו אותם לשווה ערך של 1 גרם מהחומרים הרפואיים המקוריים למיליליטר של המרתח המקורי, ואחסנו במקרר ב-4 מעלות. 1.3 ריאגנטים ומכשירים נוגדן פוליקונלי NOS3 נרכש מ- Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. ערכת SP נרכשה מחברת Fujian Maixin Reagent. ערכת האיזואנזים לקטט דהידרוגנאז נרכשה מ- Inner Mongolia Tongri Reagent Co., Ltd (בבעלות מלאה של ניסן). מנתח תמונה צבעוני של Nanjing JD-80. מערכת ניתוח תמונת ג'ל UVP אמריקאית.

נוגד עייפותתוסף cistanche

2. שיטות ניסוי

2.1 קיבוץ וניהול עכברי קונמינג חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת רגילה, קבוצת ביקורת לפעילות גופנית וCistancheקבוצת ניסוי, כל אחד עם 10 עכברים. לקבוצת הביקורת הרגילה ולקבוצת הביקורת על פעילות גופנית ניתנו מי מלח רגיל פעם ביום, 0.2 מ"ל לפעם; הCistancheקבוצת הניסוי קיבלה מרתח ציסטאנש (קח 3 מ"ל ממרתח המים המקורי והוסף מים ל-1 0 מ"ל), פעם ביום, 0 ．2 מ"ל/פעם, מינון יומי של 3 גרם/ק"ג, מתן רציף למשך 15 ימים. שעה לאחר המתן האחרון, העכברים בקבוצת הביקורת של הפעילות הגופנית וקבוצת הניסוי של Cistanche הועמסו עם משקל עופרת של 1 גרם על זנבותיהם, והם הונחו בבריכה בגובה של 50 ס"מ, אורך של 50 ס"מ ו- רוחב של 35 ס"מ לשחייה. הטמפרטורה נשמרה על (30±0.5) מעלות ונשמרה קבועה. התבוננו בעכבר, אם נמצא שהעכבר מפסיק לשחות, השתמשו במקל עץ כדי לעורר את תנועתו למשך 90 דקות. לאחר פעילות גופנית, אכלו תזונה רגילה, תנוחו 10 שעות והרגו את העכברים יחד עם עכברי קבוצת הביקורת הרגילים בשיטת שחרור הצוואר, מוציאים את הכבד, מקבעים חלק עם 10 אחוז פורמלדהיד ניטרלי, מייבשים, שקופים, משרים בשעווה , והטמיע כדי ליצור 4 פרוסות רציפות עבות, השתמשו בשיטת צביעה HF כדי לצפות במבנה רקמת הכבד של כל קבוצה: החלק השני נשטף עם מי מלח רגיל, הוקפא ב-20 מעלות, הופשר בטמפרטורת החדר במהלך המדידה, ייבוש עם נייר סינון ו נשקל, ואז הוכנה הומוגנית כבד עם מי מלח רגיל, צנטריפוגה 3500r למשך 15 דקות ב/דקה, ולקחת את הסופרנטנט כדי למדוד את הפעילות של איזואנזים לקטאט דהידרוגנאז על ידי אלקטרופורזה.

2.2 קביעת פעילות הלקטאט דהידרוגנאז באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, מופרדים האיזואנזימים של LDH לפי הבדלי הניידות האלקטרופורטית שלהם. ריכוז ג'ל ההפרדה של הדגימה הוא 7 אחוז, pH 8.9, וריכוז הג'ל המרוכז הוא 4 אחוז, pH 6.8.10. הדגימה מעורבבת עם טיפה אחת של גליצרין וחיווי ברומופנול כחול. מאגר האלקטרודה הוא Tris-Glycine (pH 8.7), התחל לייצב את הלחץ ב-1o0-150V, הוסף אותו ל-2o0-250V לאחר 30 דקות, ובצע אלקטרופורזה למשך 4 שעות. לאחר אלקטרופורזה, הוא נצבע בערכת לקטאט דהידרוגנאז איזואנזים, נצבע ב-37 מעלות למשך 30 דקות, מראה פס איזואנזים לקטאט דהידרוגנאז כחול, לאחר מכן נשטף במים, קבוע עם חומצה אצטית קרחונית, והשתמש במערכת ניתוח תמונת ג'ל UVP בצע ניתוח נתונים .

2,3 צביעת גליקוגן קטעים סדרתיים בעובי של 4 אום מורידים באופן קונבנציונאלי למים, מכניסים לתמיסת חומצה מחזורית 1 אחוז ב-37 מעלות למשך 15 דקות, נשטפים במים זורמים, מכניסים לתמיסת שיף למשך 60 דקות, שטופים במים זורמים, מיובשים על ידי שיפוע. אתנול, קסילן הוא שקוף, ניטרלי הרכיבו את השקופיות עם מסטיק והתבונן בתוצאות הצביעה תחת מיקרוסקופ.

2.4 קטע הצביעה האימונוהיסטוכימי עבר שחרור מפראפין למים באופן שגרתי, והאנטיגן תוקן עם מיקרוגל חומצת לימון, והפרוקסידאז האנדוגני הוסר על ידי נוזל A למשך 10 דקות, ולאחר מכן נחסם בנוזל B (סרום עיזים מדולל) למשך 10 דקות. הוסף את הנוגדן הראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות בקופסה לחה, שטף בתמיסת PBS pH 7.4 במשך 5 דקות × 3 פעמים ביום השני, הוסף תמיסה מסומנת ביוטין C (תמיסת עבודה נוגדנים משני) למשך 10 דקות, שטף בתמיסת PBS במשך 5 דקות × 3 פעמים, והוסיפו תמיסת חזרת פרוקסידאז עם תווית D הודגרה למשך 10 דקות, נשטפה בתמיסת PBS במשך 5 דקותX3 פעמים, ולבסוף פותחה בתמיסת DAB למשך 5 דקות, נשטפה במי ברז, כתמה נגדית, מיובשת עם אלכוהול שיפוע, שקוף עם קסילן, ורכוב עם מסטיק ניטרלי. לאחר הרכבת הסרט, התבונן תחת מיקרוסקופ אור. בכל אצווה של ניסויים, נעשה שימוש במי מלח מבוצר פוספט (PBS) כבקרה שלילית במקום הנוגדן העיקרי.

2.5 ניתוח הביטוי של סינתאז תחמוצת החנקן 3 נצפה ראשונית בשיטה החצי-כמותית החזותית תחת מיקרוסקופ אור, התוצר החיובי של NOS3 הוא חום כהה או צהוב חום, והמוצר החיובי ממוקם בציטופלזמה של הפטוציטים או בין הפטוציטים . בציטופלזמה של תאי אנדותל, הרקע הכחול שלילי. לאחר מכן, מערכת ניתוח התמונה הצבעונית משמשת למדידת הערך האפור של המגיב החיובי, והפרמטרים של 4 שדות הראייה נמדדים באופן אקראי עבור כל סרט תחת עדשת אובייקטיבית מתקפלת 40-, והערך הממוצע הוא נלקח. פרמטר זה משמש לשקף את השינוי בעוצמת הצבע NOS3. 2.6 שיטות סטטיסטיות כל הנתונים מיוצגים על ידי. SPSS11.0 חבילת תוכנה סטטיסטית משמשת עבור t-test, ו-P<0.05 is="" considered="" a="" significant="">

נוגד עייפות

3. תוצאות

3.1 תצפית על מבנה הרקמה במיקרוסקופ אור בקבוצת הביקורת הרגילה, מבנה אונות הכבד ברור, מיתרי התאים מסודרים בצורה מסודרת, הסינוסואידים של הכבד תקינים, לתאי הכבד אין נגעים ברורים והמבנה הגרעיני ברור. בקבוצת הביקורת בפעילות הגופנית, מבנה הרקמה התקין נעלם, האונות לא היו ברורות, מיתרי התאים היו פגומים, רוב הסינוסואידים של הכבד נעלמו והפטוציטים היו ניוון ואקוולארי נרחב, שהתבטא בגידול נפח תאים, ציטופלזמה רופפת, צביעה בהירה, ואפילו ברור ושקוף. חלק מתאי הכבד הראו שינוי טיפוסי דמוי בלון, עם כמות קטנה של נמק מוקדי או נקודתי. תאי הכבד שלCistancheקבוצת הניסוי הייתה עכורה במידה קלה, אך הם היו מסודרים באופן קבוע, לא היו חללים ורפיון ברורים בתאים, חוטי התאים היו מסודרים בצורה מסודרת ומבנה הגרעין היה ברור.

3.2 השפעות על פעילותם של איזואנזימים כבד לקטאט דהידרוגנאז בעכברים בפעילות גופנית בעומס (ראה טבלה 1)

טבלה 1 ההשפעה שלCistancheעל הכבד לקטאט דהידרוגנאז איזואנזים של Xiaofeng טעון (x±s)

הערה: בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, P<0, 05;="" compared="" with="" the="" exercise="" control="" group,=""><0.05 (the="" same="">

3.3 תצפית מיקרוסקופ אור על צביעת גליקוגן בכבד. למרות שתכולת הגליקוגן של קבוצת הביקורת הנורמלית אינה גבוהה, ישנם גליקוגן בפיזור שווה בכל תא כבד ללא ואקוולים; בקבוצת הביקורת של הפעילות הגופנית יש פחות גליקוגן, מפוזרים בכבד תאי, ואקוולים הופיעו באזורים מסוימים; הCistancheקבוצת הניסוי הייתה עשירה בגליקוגן, אך אספה הרבה בצד אחד של התא. 3.4 תצפית על הביטוי של תחמוצת החנקן סינתאז 3 עם מיקרוסקופ האור וניתוח תמונה כמותי. הציטופלזמה של הפטוציטים בקרה תקינים הראתה ביטוי חיובי חזק בהפצה מפוזרת, במיוחד בתאים דו-גרעיניים, וביטוי חיובי בתאי אנדותל. . הביטוי בציטופלזמה של הפטוציטים ותאי אנדותל בקבוצת הביקורת על פעילות גופנית נחלש. קבוצת הניסוי cistanche הראתה ביטוי חיובי בציטופלזמה של הפטוציטים וביטוי חיובי חזק בתאי אנדותל. תוצאות הניתוח של מנתח התמונות הצבעוניות מוצגות בטבלה 2.

טבלה 2 השוואה של הבדל הביטוי של №s3 בהפטוציטים ותאי אנדותל (x±s)

4 דיון

שגוף האדם זקוק לאנרגיה לצורך פעילות גופנית, והגוף זקוק לאנרגיה גם בתהליך חילוף החומרים. חילוף החומרים של התא משתמש ישירות באנרגיה מפירוק אדנוזין טריפוספט (ATP). האנרגיה הדרושה לסינתזה של ATP מסופקת בסופו של דבר בעיקר על ידי קטבוליזם של סוכר. מחקרים הראו כי לאחר פעילות גופנית מאומצת, הגוף יפיק כמות גדולה של H', רדיקלים חופשיים, חומצת חלב וחומרים נוספים המשפיעים על חילוף החומרים התקין של התאים. יחד עם זאת, המחסור בגלוקוז בתאים מוביל לעייפות פעילות גופניתונזק לתאים. תוצאות מחקר זה מראות שפגיעה במבנה רקמת הכבד היא חמורה מאוד לאחר מספר רב של תרגילים, והיא משפיעה גם על סינתזה של תאים, כגון הפחתת סינתזת גליקוגן בכבד. אחרי הרבה תרגילים, לוקחים עכבריםCistancheיכול לראות את הפחתת הנזק לכבד, בעיקר עקב הפחתת LDH5, ותכולת הגליקוגן בכבד גבוהה משמעותית מזו של קבוצת הביקורת בפעילות גופנית, מה שמצביע על כך ש-Cistanche עשויה להשיג הגנה על הכבד ולשמור על פיזיולוגיה תקינה על ידי הפחתת תפקוד LDH5. מתוצאות צביעת גליקוגן.

תכולת הגליקוגן בקבוצת הניסוי של Cistanche גבוהה מזו של קבוצת הביקורת הרגילה. האם Cistanche מגביר את אחסון הגליקוגן בכבד לפני פעילות גופנית או מאיץ את סינתזת הגליקוגן תחת לחץ לאחר פעילות גופנית. כי אין אי מימוש שליטה עלCistancheבניסוי. אי אפשר להסיק מסקנה, וצריך לאשר אותה בשלב הבא, אלא המגןההשפעה של Cistancheעל הכבד וקידום סינתזת גליקוגן לאחר הרבה תרגילים ברורים. N{{0}} הוא חומר מולקולה קטנה שזוכה להערכה רבה על ידי קהילת הספורט בשנים האחרונות. NOS הוא הגורם המגביל את הקצב העיקרי לייצור N0. אושר כי ל-NOS יש שלושה סוגים של איזואנזימים, ו-NOSI נקרא סינתאז תחמוצת החנקן העצבית.

האנזים, הקיים בתאי עצב, תאי שריר השלד וכו', מעורב בעיקר בהתפתחות נוירובית, הפרשת עצבים, למידה ותהליכי זיכרון: NOS2 הוא סינתאז תחמוצת החנקן הניתן לשרירה, המצוי בעיקר בתאי שריר חלק, מקרופאגים ולימפוציטים. אנזים זה מושרה, הוא יכול להמשיך לסנתז NO עד למיצוי המצע או למוות של תאים. כיום הוא נחשב כמעורב בנזק לתאים; 'NOS3 הוא סינתאז תחמוצת חנקן אנדותל, המופץ בעיקר בתאי אנדותל והפטוציטים, ומייצר NO המעורב בעיקר בתפקודים פיזיולוגיים. תוצאות המחקר הזה מראות שאחרי הרבה תרגילים, הביטוי של NOS3 בתאי האנדותל והפטוציטים נחלש, וה-N0 המתקבל יורד, כך שלא ניתן להרחיב ביעילות את כלי הדם, זרימת הדם מופחתת, ולא ניתן להעביר את חומרי הגלם לסינתזה של גליקוגן לתאי הכבד, ולכן סינתזת הגליקוגן מופחתת. ;Cistancheיכול לווסת את הביטוי של NOS3 בתאי אנדותל ותאי כבד, להרחיב את כלי הדם באופן תגובתי, להגביר את זרימת הדם, להאיץ את היכולת להעביר חומרי גלם מסינתזת גליקוגן, להאיץ את סינתזת הגליקוגן ולשמור על הגוף ברמה מטבולית פיזיולוגית תקינה. לכן, הפחתת LDH5 כדי להגן על הכבד והסדרת הביטוי של NOS3 כדי לקדם גלוקונאוגנזה של חומצת חלב עשויה להיות מנגנון חשוב עבורCistancheכדי להגן על הכבד ולקדם התאוששות גופנית. מחקר זה מספק את הבסיס הניסויי המדעי להמשך פיתוח וניצול שלCistancheבתחום רפואת הספורט וגם מניח את הבסיס לפיתוח וטיהור שלההשפעה של Cistancheחומרים.